全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
-:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ
bB.2! +B2#
]H.K$%&%
GB@"&%2(/*/6_2@00C2&*$ =(*!2$%&%2%#2%%&
收稿日期"$%%/ =&% =$/
基金项目"国家重点基础研究发展计划#/( 计划$资助项目#$%%-Y%!%($%国家高技术研究发展计划#!*( 计划$资助项目#$%%*55%$P$&!$
作者简介"尹"强#&/!#&$男山西晋城人硕士研究方向"发酵工程%祁庆生#联系人$教授TRA,@."X@X@CJ0:ECJc0GH2EGH2IC
产琥珀酸工程菌株的发酵工艺条件优化
尹"强&$康"振&钟盛华$祁庆生&
#&2山东大学 微生物技术国家重点实验室济南 $)%&%%% $2江西农业大学 理学院南昌 ((%%#)$
摘"要"对实验室构建的产琥珀酸大肠杆菌工程菌株#-8)0*7P&&&&$进行发酵工艺条件研究( 以 5` & 低盐培养
基为基础研究不同-)+源及其质量浓度培养基初始 14和发酵温度等因素对琥珀酸的影响并在 ) V发酵罐中
进行了补料 分批发酵实验( 优化后的发酵条件为葡萄糖 $% J6V玉米浆 &% J6V14*d#发酵温度 ( e( 在 ) V
发酵罐中培养琥珀酸产量达到 #d/ J6V(
关键词"琥珀酸%发酵%大肠杆菌
中图分类号"f7/$%d*""""文献标志码"5""""文章编号"&*$ =(*!#$%&%$%# =%%%& =%)
+9F.G.H5F.2/27704G0/F5F.2/942I3:F.2/2713::./5F0
0/;./0040IJA !"#$%&#$( #)*
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]@,CJ^@5JF@IH.?HF,.WC@\EF0@?K +,CI:,CJ((%%#) -:@C,$
*J1F45:F"5EFB8@I0HII@C,?E1FBGHI?@BC Z,0IBCGHI?EG Z@?: ,C ECJ@CEEFEG -,).%/).$ )0*7P&&&&2MCR
D.HECIE0BDI,F8BC 0BHFIE0 C@?FBJEC 0BHFIE0 @C@?@,.14 ,CG ?EA1EF,?HFEBC ?:E0HII@C,?E1FBGHI?@BC
ZEFE@C\E0?@J,?EG2f:EB1?@A@9EG IBCG@?@BC0ZEFEJ.HIB0E$% J6V IBFC 0?EE1 .@XHBF&% J6V 14*d#
,CG ?EA1EF,?HFE( e2UEGR8,?I: DEFAEC?,?@BC @C ,) VDEFAEC?EFZ,0?E0?EG2f:E0HII@C,?EIBCIEC?F,R
?@BC FE,I:EG #d/ J6V@C ?:E) VDEFAEC?EF2
K0A L24I1"0HII@C,?E% DEFAEC?,?@BC% -,).%/).$ )0*
""琥珀酸学名丁二酸是三羧酸#f-5$循环的
中间产物同时也是一种具有重要应用价值的四碳
二羧酸( 琥珀酸作为 (% 多种重要工业产品如
&# 丁二醇)四氢呋喃等的前体物质被广泛应用
于食品)医药)树脂聚合体)印染)化妆品等方
面*& =$+ ( 目前琥珀酸主要由化学法合成( 基于环境
保护和可持续发展的理念研究重点开始转向利用
微生物发酵法生产琥珀酸( 发酵法生产琥珀酸与
化学合成法相比具有很多优势"如工艺控制的简化
以及环境友好等( 以可再生资源为原料的微生物
发酵法将逐步取代传统的化学合成法(
""目前研究较多的产琥珀酸微生物菌株主要
有"产琥珀酸厌氧螺菌#9&$%/0(0,3/*+7,+))&3/0:
2+)%&,$)产琥珀酸放线杆菌#9)4&0($)*+,,+))&0:
6%&%,和;$&&.%7$ ,+))&)3/02+)%&,$)嗜淀粉拟杆
菌#<$)4%/02%,$7=*03.*+,$和大肠杆菌#-,).%/).$
)0*$
*$ =#+
( 其中大肠杆菌作为生产工业产物的宿
主由于其遗传背景明确)易操作)生长速率快)易
培养及利用 -源广等诸多优点而受到越来越多的
重视( 大肠杆菌也被认为是最有潜力的琥珀酸生
产菌株( 基因工程与发酵工艺的结合使大肠杆菌
大规模发酵琥珀酸成为可能( 许多代谢工程策略
已经用于提高大肠杆菌发酵生产琥珀酸的产
量*# =&&+ ( 目前对大肠杆菌生产琥珀酸的报道大都
集中 在 厌 氧 发 酵 方 面 bEAHF@等*&$+ 通 过 将
>.?0(+7%4*中的丙酮酸羧化酶基因#3=)$引入大
肠杆 菌 5U;&&& 中 得 到 大 肠 杆 菌 突 变 株
5U;&&&61fFI//5R3=)该菌株在厌氧条件下通过优
化培养条件琥珀酸产量达到了 //d$ J6V%姜岷
等*&(+通过对重组大肠杆菌 +P+&&& 的培养条件进
行优化琥珀酸产量达到 &)d*# J6V( 厌氧发酵过程
存在一定的缺点例如菌体量小)-源利用缓慢)产
物合成速率慢等( 为了消除厌氧发酵生产琥珀酸
的各种缺陷V@C 等*&#+构建了大肠杆菌工程菌株
4V$*)/h#1NN(&($该菌株在完全好氧条件下利
用营养丰富的 QY培养基进行补料 分批发酵琥珀
酸产量达到了 )!d( J6V(
""本研究采用已构建的 -8)0*7P&&&&该工程菌
株具有 ) 个基因缺失突变分别编码琥珀酸脱氢酶
#QHII@C,?EGE:KGFBJEC,0E Q34$)磷酸转乙酰基酶
#;:B01:B?F,C0,IE?K.,0E;?,$)丙酮酸氧化酶#;KFH\,?E
B^@G,0E;B^Y$)异柠檬酸裂解酶阻遏物 # $)%Y5N
B1EFBC FE1FE00BFMI.a$及葡萄糖糖 磷酸转移酶系统
M#O.HIB0E1:B01:B?F,C0DEF,0E0K0?EA;?0O$该菌株在
未优化的条件下琥珀酸产量达到了 $*d# J6V*(+ ( 虽
然用于好氧发酵产琥珀酸的菌株已经构建但作为一
种经济有效的生产琥珀酸的工艺方法特别是利用廉
价底物进行发酵的方法仍需探索开发( 本研究根据
-8)0*7P&&&&的生理特点和营养需求并从经济的
角度考虑以廉价的 5` & 低盐培养基为基础*&)+ 对
其培养条件和培养基成分进行了优化并在 ) V发酵
罐中进行了生产琥珀酸的补料 分批发酵(
D?材料与方法
D=D?菌种和培养基
&2&2&"菌种
""-8)0*7P&&&&由山东大学微生物技术国家重
点实验室构建(
&2&2$"培养基
""种子培养基"蛋白胨 &% J酵母粉 ) J+,-.
&% J加水定容至 & %%% AV(
""发酵培养基"葡萄糖$% J玉米浆&% J#+4
#
$
$
4;>
#
&/d/$ AAB.+4
#
4
$
;>
#
d)* AAB.N-.$ AAB.
J`Q>
#
!4
$
>&d) AAB.YE?,@CE!N-.& AAB.微量元
素溶液 & AV定容至 & %%% AV(
""微量元素溶液的配制"UE-.
(
!*4
$
>!d!! AAB.
-B-.
$
!*4
$
>&d$* AAB.-H-.
$
!$4
$
>%d!! AAB.
PC-.
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$d$% AAB.+,
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B`>
#
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$
>&d$# AAB.4
(
Y>
(
&d$& AAB. C`-.
$
!#4
$
>$d)% AAB.溶解于含 &$%
AAB.6V4-.的 & %%% AV溶液中(
D=B?主要仪器
""流加摇瓶柜上海欣蕊自动化设备有限公司%
) V发酵罐上海保兴生物设备工程有限公司%生物
传感分析仪 QY5 #%-型山东省科学院%Q:@A,G9H
V- &%5\1 高压液相色谱仪Q;3 &`%5\1 二极管
阵列检测器-V555 b;工作站日本岛津公司(
D=M?培养方法
""种子培养"从平板挑取单菌落至装有 )% AV种
子培养基的 (%% AV三角瓶中置于 ( e摇床中
$#% F6A@C培养 &$ :(
""发酵培养"将种子液以 )i接种量接入装有
(%% AV培养基的 & %%% AV三角瓶中置于 ( e摇
床或者流加摇瓶柜中$#% F6A@C培养(
""补料 分批培养"补料 分批发酵在 ) V发酵罐
中进行( 用 # AB.6V的 N
$
->
(
溶液控制 14*d#)通
气量 * V6A@C)起始搅拌转速 $%% F6A@C(
D=@?检测方法
""菌液室温下 &$ %%% F6A@C离心 $ A@C取上清
然后用孔径为 %d$$
"
A的无菌滤膜过滤用高效液
相色 谱 #4;V-$ 检 测 发 酵 产 物( 色 谱 柱 为
4;S !4#(%% AAjd! AA$流动相为 ) AAB.6V
的4
$
Q>
#
溶液流速为 %d* AV6A@C( 琥珀酸盐利用
示差检测器#aM$检测( 发酵结果均为测定 ( 次的
平均值( 葡萄糖利用生物传感分析仪检测( 菌体
用无菌 %d&) AB.6V的 +,-.溶液清洗 ( 次然后利
用分光光度计测量菌体@A发射光波长为 *%% CA(
B?结果与分析
B=D?$源的选择
""从发酵的经济性考虑以各种+源中含+的质
量浓度相等为原则分别选择酵母粉#&$d! J6V$胰
蛋白胨 #&%d& J6V$玉米浆 #$!d) J6V$牛肉膏
#&#d# J6V$+4
#
-.##d/ J6V$ #+4
#
$
$
Q>
#
#*d%
J6V$作为+源考察不同 +源对琥珀酸产量的影
$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
响结果如表 & 所示(
表 D?$源对菌体生长和琥珀酸产量的影响
E5J60D?#70:F127/.F42;0/1234:012/:06;42LF-5/I
13::./5F0942I3:F.2/
+源 @A
*%%
!
#琥珀酸$6#J!V=&$
酵母粉 /d! d/!
胰蛋白胨 &%d* !d$%
玉米浆 &%d) !d$!
牛肉膏 /d* d/*
+4
#
-.
)d! (d)%
#+4
#
$
$
Q>
#
)d/ (d!
""由表 & 可知"以胰蛋白胨和玉米浆作为 +源
时琥珀酸产量较高菌体生长较好%以酵母粉与牛
肉膏作为+源时琥珀酸产量也几乎相当酵母粉
略好于牛肉膏而它们的产量均低于以胰蛋白胨或
玉米浆为 +源时琥珀酸的产量%以 +4
#
-.和
#+4
#
$
$
Q>
#
为+源时琥珀酸产量较低菌体生长状
况较差( 由于玉米浆价格低廉营养丰富同时又
是工业上常用的有机+源因此以下实验选用玉米
浆作为+源(
B=B?玉米浆质量浓度对琥珀酸产量的影响
""玉米浆作为 +源时若质量浓度过小会造成
菌体生长缓慢从而影响产物的产率%若质量浓度
过大会造成菌体生长旺盛使养分过早耗尽进一
步导致菌体提前衰老自溶从而缩短产物的生产
期( 因此需要选择合适的玉米浆质量浓度( 分别
设定玉米浆质量浓度为 ))&%)&))$%)$) 和 (% J6V*
个水平考察不同玉米浆质量浓度对琥珀酸产量的
影响实验结果如图 & 所示(
图 D?玉米浆质量浓度对菌体生长和产酸的影响
N.;=D?#70:F127:24/1F0096.O324:2/:0/F45F.2/2/
:06;42LF-5/I13::./5F0942I3:F.2/
""由图 & 可知"当玉米浆质量浓度为 &% J6V时
琥珀酸产量最高达到 !d#$ J6V( 玉米浆质量浓度
高于或者低于 &% J6V时琥珀酸产量均下降而菌
体@A值的变化也是如此( 因此玉米浆的最佳质量
浓度为 &% J6V(
B=M?,源的选择
""该菌株由于去除了34,O基因使得大肠杆菌葡
萄糖代谢产物抑制现象得以解除从而可以使该工
程菌株能够同时利用多种 -源*(&*+ ( 而 34,O基因
的缺失导致葡萄糖利用速率下降影响产酸效率
因此选用主要依赖于 34,O基因进行运输的葡萄糖
和不依赖于 34,O基因进行运输的木糖)甘油)山梨
醇)葡萄糖酸以及成分复杂的菊芋作为 -源进行实
验实验结果如表 $ 所示(
表 B?,源对菌体生长和琥珀酸产量的影响
E5J60B?#70:F127:54J2/1234:012/:06;42LF-5/I
13::./5F0942I3:F.2/
-源 @A
*%%
!
#琥珀酸$6#J!V=&$
葡萄糖 &&d* !d*!
木糖 *d# (d/(
山梨醇 &&d& !d!!
葡萄糖酸 )d! &d(*
甘油 /d# !d!%
菊芋 )d* &d!%
""由表 $ 可知"从菌体生长情况看选用葡萄糖作
-源时菌体@A最高山梨醇次之%选用山梨醇作-
源时琥珀酸产量最高甘油次之%葡萄糖作 -源
时琥珀酸产量与山梨醇和甘油作 -源时相比略
低%而木糖)葡萄糖酸)菊芋作 -源时虽然 -源消
耗速度较快但副产物较多受其影响琥珀酸产量
也很低( 由于葡萄糖是常用的工业 -源且葡萄糖
作-源时菌体生长状况较好因此本实验选用葡萄
糖作为-源(
B=@?葡萄糖质量浓度对琥珀酸产量的影响
""葡萄糖是最常见的工业用 -源它在培养基中
的质量浓度相当重要如果质量浓度过高细胞的
生长因细胞脱水开始下降并且在某一质量浓度下
会阻遏 & 个或更多的影响产物合成的酶( 分别设定
葡萄糖质量浓度为 &%)$%)(%)#%))% 和 *% J6V* 个
水平考察不同葡萄糖质量浓度对琥珀酸产量的影
响实验结果如图 $ 所示(
("第 # 期 尹"强等"产琥珀酸工程菌株的发酵工艺条件优化
图 B?葡萄糖质量浓度对菌体生长和产酸的影响
N.;=B?#70:F127;63:210:2/:0/F45F.2/2/
:06;42LF-5/I13::./5F0942I3:F.2/
""由图 $ 可知"当葡萄糖质量浓度高于 $% J6V
时琥珀酸产量随葡萄糖质量浓度的增加而减小
说明高于此质量浓度的葡萄糖已经对琥珀酸的合
成产生抑制作用%@A的变化也是如此( 而当葡萄
糖质量浓度为 $% J6V时 琥珀酸产量达到
!d/! J6V为葡萄糖的最佳质量浓度(
B=P?培养基初始9"对琥珀酸产量的影响
""用磷酸盐缓冲液将培养基的 14分别设定为 *d%)
*d$)*d#)*d*)*d!)d%进行培养结果如图 (所示(
图 M?起始9"对菌体生长和产酸的影响
N.;=M?#70:F127./.F.569"2/:06;42LF-
5/I13::./5F0942I3:F.2/
""由图 ( 可知"培养基初始 14在 *d# 以下时琥
珀酸产量较低%培养基初始 14在 *d# 以上时琥珀
酸产量随着 14的增大而下降@A值的变化也是如
此( 培养基初始 14为 *d# 时琥珀酸产量最高且
菌体生长较好( 由图 ( 还可知14过高或者过低都
会造成菌体产酸能力的下降( 由此得到培养基的
最佳初始 14值为 *d#故选择 14*d# 为培养基的
初始 14(
B=Q?培养温度对琥珀酸产量的影响
""温度对细胞生长和产物合成过程具有重要影
响而且细胞生长和产物合成的最适温度不一定相
同因此在发酵过程中需要选择合适的培养温度(
在 (&)(()())()(/)#& e下进行培养结果如图 #
所示(
图 @?培养温度对菌体生长和产酸的影响
N.;=@?#70:F127F0G9045F3402/:06;42LF-5/I
13::./5F0942I3:F.2/
""由图 # 可知"当培养温度低于 ( e时琥珀酸
产量随着温度的升高而增加%当培养温度高于 ( e
时琥珀酸产量随着温度的升高而下降%当培养温
度为 ( e时菌体@A值最高琥珀酸产量也最高(
因此选择 ( e作为发酵培养温度(
B=R?P S发酵罐的补料 分批发酵
""采用最优的摇瓶条件进行 ) V发酵罐发酵实
验( 工艺控制如下"用 # AB.6VN
$
->
(
水溶液控制发
酵液 14*d#通过流加 )%% J6V的葡萄糖溶液控制
发酵液糖质量浓度在 &) k$% J6V保持通气量
# V6A@C培养温度 ( e发酵罐起始搅拌速率
$%% F6A@C控制溶氧 !%i当溶氧低于 !%i并持续
下降时保持通气量不变将转速上调至 )% F6A@C(
发酵结果如图 ) 所示(
图 P?P S发酵罐中菌体生长和琥珀酸积累过程
N.;=P?N04G0/F5F.2/F.G0:2341027!+#)*TUDDDD
./5 P S704G0/F04
""由图 )可知"菌体@A在 % k)# : 表现出较快增
# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
长)# :之后菌体@A出现下降然后在 *% : 之后相
当长的时间内保持相对稳定而琥珀酸的积累量与菌
体@A增长表现出一定的相关性( 琥珀酸产量在菌
体生长初期增加较为缓慢但随着菌体 @A的增加
琥珀酸积累速度也随之加快直到菌体生长进入稳定
期琥珀酸始终保持较快的积累速度( 在整个发酵周
期中菌体@A在 )# : 达到最高值 $/d/( 发酵结束
时共消耗葡萄糖 !!d% J6V其中在发酵过程中共补
入葡萄糖 * J6V琥珀酸最终产量为 #d/ J6V相对
于所利用的葡萄糖的摩尔产率为 %d!((
M?结?论
""&$通过对培养基成分中-)+源种类-)+源质
量浓度培养基的初始 14以及发酵温度进行了摇
瓶条件下的研究得出 -8)0*7P&&&& 发酵产琥珀
酸的最佳培养条件"葡萄糖 $% J6V玉米浆 &% J6V
初始 14*d#发酵温度 ( e(
""$$在摇瓶优化所得的最佳条件下通过适当的工
艺控制进行补料 分批培养使得-8)0*7P&&&& 在
) V发酵罐中积累琥珀酸产量为 #d/ J6V产物相对
于所利用的葡萄糖的摩尔产率为 %d!((
""($本实验的优势在于所采用的培养基是廉价的
工业+源和低盐培养基这从一定程度上节约了发酵
的成本从而使该菌株具有一定的工业生产价值(
参考文献"
*&+"詹晓北朱一晖[,CJ3BCJ:,@2琥珀酸发酵生产工艺及其产品
市场*]+2食品科技$%%(#$$" ##R#/2
P:,C S@,B8E@P:H L@:H@[,CJ3BCJ:,@2QHII@C@I,I@G 1FBGHI?@BC
,CG 1B?EC?@,.A,FhE?*]+2UBBG QI@ECIEfEI:CB.BJK$%%( #$ $"
##R#/2
*$+"M0,F]5J,FZ,.VQ,F,C QE?,.2QHII@C@I,I@G 1FBGHI?@BC DFBA
<$)4%/02%,5/$6*," 1FBIE00B1?@A@9,?@BC ,CG 0I,.EH1 @C ,8@BFE,IR
?BF*]+25C,EFB8E$%%*#&$$" $(&R$(2
*(+"康振耿艳平张园园等2好氧发酵生产琥珀酸工程菌株的构
建*]+2生物工程学报$%%!$##&$$"$%!&R$%!)2
N,CJP:ECOECJL,C1@CJP:,CJLH,CKH,CE?,.2-BC0?FHI?@BC BD
ECJ@CEEFEG -,).%/).$ )0*DBF,EFB8@I0HII@C,?E1FBGHI?@BC*]+2
-:@C ]Y@B?EI:$%%!$##&$$" $%!&R$%!)2
*#+"王庆昭赵学明2琥珀酸发酵菌种研究进展*]+2生物工程学
报$%%$(##$" )%R))2
[,CJ7@CJ9:,BP:,BSHEA@CJ2f:EFE0E,FI: 1FBJFE00BD0HII@C@I
,I@G DEFAEC?,?@BC 0?F,@C0*]+2-:@C ]Y@B?EI: $%% $( # # $"
)%R))2
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J.HIB0E8K-,).%/).$ )0**]+2511.TC\@FBC @`IFB8@B.$%%&*
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*&(+ 姜岷王益娜陈可泉等2重组大肠杆菌厌氧发酵产丁二酸培
养条件的优化*]+2食品与发酵工业$%%!(##/$" *R&%2
]@,CJ` @C[,CJL@, C,-:EC NEXH,CE?,.2>1?@A@9,?@BC BD?:E
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