全 文 ：May2003 生辆加工过程 第l卷第1期
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微生物转谷氨酰胺酶的生产菌种诱变
和发酵生产分析
王璋，王灼维，莫湘筠
(中国食品发酵工业研究院，北京100027)
摘要：对本研究室从土壤分离得到的链霉茵(蛳呻sp．)wzⅡ．w一12茵株的斜面孢干预培养处于初萌发
状态后，以亚嚣蒌甏；薯；差；善摹毒羹萋毫|g臼童。薹萋墨奏誊毫垂篁耋薹彗蓬三蘩磐垂辫黼蚪誉萋毫薹妻蘩募雾墓虹
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蠹萆翻M参蔓蠹妻鬻誊季薹甬基参量i譬萎鬟耋事闭塞鲞差囊萋二簧薹蠹喜螽妻簦囊釜孝耋蒌鹭孽翼羹造使得
控制衄Ⅲk的结构组成成为可能。
本研究在两株嗜水性气单孢菌A，^脚咖如wQ
和 ^．^，出神如4AK4中分别引人了y棚基因和ph．
bA、phbB基因。ya珊基因编码的酰基辅酶A脱氢酶
催化B一氧化过程的第一步反应L9j，使酰基辅酶A还
原成烯酰基辅酶AophaA基因编码口一酮基硫解酶
(8一k出“ola*)，可以催化两个乙酰辅酶A生成乙酰
乙酰辅酶A；口haB基因编码乙酰乙酰辅酶A还原酶
(acet∞ce竹l—c0A捌Ilcfase)，可以把乙酰乙酰辅酶A
转化为3皿一coA_I⋯。这两个基因广泛存在于许多
种P}M合成菌中。本研究在摇瓶发酵水平上对上述
重组菌生产单体结构可控的蛐}Ⅱ矗的能力进行了
验证，并进行了初步的发酵罐发酵实验。
1 材料和方法
1．1菌株
．^b幽批wQ和4．协出批删为清华
大学微生物实验室收藏。
1．2重组菌株的构建
编码有yam基因的质粒pBBRH(构建过程见下
面结果与讨论)通过电转化接合的方法转入到A．
胁出批wO中。
编码有P}lbA和pllbB基因的质粒p，I∞l(构建
过程见下面结果与讨论)通过电转化接合的方法转
入到^．蜥砒以如4AK4中。
1 ．3摇瓶培养基及培养条件
上述微生物的培养基由：月桂酸5∥L，
(N地)2s042g／L，M酉04‘7H200． g／L，Na2m04‘
l2H209，65g／L，KH2P041．5g／L，酵母粉lg／L，微量
万方数据
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·56生物加工过程第l卷第1期
要9h以上，所以，种子培养是有益的、必要的。茵体生长量和Mm酶活随着接种量的增大而
增大，特别是当接种量从2％增加到10％时，酶活增加了近一倍。当接种量再增加时，酶活及菌体量增
加较少，且当接种量增加到20％时，酶活又略呈下
降趋势。所以，实际发酵罐生产时，7％一10％的接种量比较合适。在最佳接种龄的确定试验中，分别采用经过18
h、24h、32
h、40
h培养的种子液按lo％的量接种。
图3的结果表明种子培养时间对MIG生产也有较 大影响，当种子培养到24
h时，显微镜镜检观察到
细胞处于生长旺盛期，接入发酵培养基后酶活力最大。而种子培养40
h后观察到开始出现了碎菌丝
体，这时再接种，虽然发酵的生物量不受影响，但酶
活明显下降。所以，最适宜的接种龄应为24h左右。
[二]最高酶活—▲一菌体量8243240
种龄时同／h 24 20 3
16k12&翻
8母
姐4
0
图3种子培养时间对苗体生长和MI_G发酵生产的影响
ng．3‰0f酬adnⅡcm∞础刚dm劬cu∞
2．2．2摇床转速对MTG生产的影响
图4表示了在100—250 r／Ⅱ血范围内不同摇床
转速时对菌体生长及产酶的影响。w．12．"口r
MN．35菌为典型的好氧性微生物，从
图4可以看出当转速增加，溶解氧增大时，菌体量和
¨m酶活都先升高之后再有所下降，而且菌丝球直
径一直在变小。当转速为200r／mh时，菌体量和
mG活力均达到最高，分别为22．8 g／L和O．78U／
mLo表明该菌株摇瓶发酵产酶时适宜的转速应为200
r／幽，过高或过低的转速均不利于菌体生长和
产酶。这种现象可能是由于增加了转速后，既提高
口薜活—▲_苗体盆+苗丝球直径
▲／／
▲ ▲
r／ ●——
_——
n’^～ ★ ▲
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摇床转速／(r／miⅡ)
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-：釜詈
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圄4摇床转速对菌体生长豆产酶的影响
ng4口自0f如衄删∞础"曲Bndq耐州。
了溶解氧量，也加大了机械搅拌剪切力，从而使菌丝
球直径变小，有利于菌丝球内溶解氧和营养物质的
传质，直接或间接地促进了MIc的生物合成。
2．2．4发酵培养温度对Ⅳr眦生产的影响
表3为20～45℃中设定的6种发酵培养温度
对菌体生长和产酶影响的比较试验结果。从表3可
以看出，温度对细胞生长繁殖和合成旧m都有明显
产酶，酶活及Dcw均有所下降。当温度为30℃时，
最适合于细胞生长和产酶，此时菌体量和mC酶活
均最高，分别达到22．6异／L和o．80U／mI．，因此，
^rrG发酵最适宜的温度为30℃。
表3发酵温度的影响
删c3 ne胡缸0f∞lmt∞m口m
2．3发酵培养基的优化
2．3．1不同碳源对盯IG生产的影响
本研究在发酵培养基中分别采用麦芽汁(12。
B血，北京燕京啤酒股份有限公司提供)200mI／I．以
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万方数据
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2003年5月 王璋等：微生物转谷氨酰胺酶的生产菌种诱变和发酵生产分析 ·59·
稳定与有效性，本研究室除了进行优化培养基组成 为(3)：4“6
和培养条件等基础性试验外，正在采用包括空间诱 [5]王灼维，王璋·刘新征等产答氨酰胺转胺酶茁株筛选方莹和
变育种方法的最新优良菌种选育驯化技术进行吲耋蒿墓里耋芝嚣是誓嚣嚣；：：：篇篇发
M1B生产菌株的高效快速分离筛选和菌种本身性 酵工业，2003，凹(4)：5．10．
能的改良与强化[12]，并深入探讨发酵工艺条件和酶 [7]王灼维．王璋，郝伟，等复合诱变选育谷氨酰胺转胺酶高产菌
产品分离提纯精制方法【9J，不断深化进行工厂化实 株[A]．2002年中国酶制剂生产与应用技术交流大会论文集
验生产MTc产品的各项成熟工艺技术研究，促进项 【cJ，捌zt1∞_11l
目成果的工程化推广应用实施。 哺3：篙]骂：：茗￥黹：黑：伯杰氏细菌分类手册涕八
[9]刘新征，王灼维，王璋谷氨酰胺转胺酶的盅酵生产及酶纯化
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