全 文 ：第6卷第6期
2008年11月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Nov．2008
· 19·
．．-l‘
Cj
同浓度糖发酵制备乙醇
宋向阳，欧阳嘉，李 鑫，云彩琴，勇 强，余世袁
(南京林业大学 化学工程学院，林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京210037)
摘要：以树干毕赤酵母为发酵茵株，混合糖(木糖、葡萄糖)为发酵底物，通过培养基和培养条件的改变来确定
树干毕赤酵母高糖浓度发酵时所需的条件。研究结果表明：在24h发酵周期内初始木糖质量浓度为63．0s／L
较适宜；在36h发酵周期内初始木糖质量浓度为72．0g／L较适宜。24h发酵周期内，在36．0s／L木糖中添加的
葡萄糖质量浓度以54．0g／L为最佳，发酵结束乙醇质量浓度达32．9g／L；36h发酵周期内，添加的葡萄糖质量浓
度以72．0g／L为最佳，发酵结束乙醇质量浓度为36．9g／L。以(NH。)：S0。为N源时较适合戊糖发酵制备乙醇，
(NH4)2s04的最佳质量浓度为1．1g／L。发酵前8h摇床转速为90r／min，后16h为150r／min，乙醇质量浓度较
高，可达17．5g／L。
关键词：乙醇；发酵；高浓度；戊糖
中图分类号：Q53 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)06—0019—06
Highconcentrationferme tationofpentosetoethanol
SONGXiang-yang，OUYANGJia，LIXin，YUNCai—qin，YONGQiang，YUShi—yuan
(CofiegeofChemicalEnsineefing，NanjingForestryUniversity，KeyLaboratoryofForestGenetic
．&Biotechnology，MinistryofEducation，Nanjing210037，China)
Abstract：Fermentationofslueo眈-xylosemixturetoethanolwithPichiastipitiswasinvestigated．Hishcon-
centrationfermentationconditionswereoptimizedbychangingculturemediumandcultivationconditions．
Theresultsshowedthattheinitialxyloseconcentrationof63．0s／Lwasappropriatein24handinitialxy-
loseconcentrationof72．0s／Lwagsuitablein36h．ItWaSoptimalbyadding54s／LSluco∞in24h．The
concentrationofe ha olWaS32．9g／L．Furtheritwasoptimalbyadding72．0s／Lsluco跎in36h．The
concentrationofethanolWaS36．9s／L．ItWaSfitfor@H4)2S04tofermentationofethanolwithxylose．The
concentrationof州H4)2SO,WaS1．1g／L．Rotatesp edofswingbedremainedat90r／rainthefirst8h，
thenat150r／rainafter16h．Theconcentrationofethanolreached17．5g／L．
Keywords：ethanol；fermentation；highconcentration；pentose
高浓发酵没有一个统一标准，通常把发酵液中
菌体浓度达108～109／["／mL，底物质量分数达10％一
30％，并具有较高产物浓度的发酵过程叫高浓发
酵‘1|。高浓度乙醇发酵是通过提高单位体积内发
酵醪液中可发酵糖的含量，在适量酵母菌的作用
下，在一定的时间内获得最大量的乙醇，其特点是
能明显提高单位设备的生产率和利用率。高浓乙
醇发酵因为增加了单位体积醪液中可发酵性糖的
收稿日期：2008-06-22
基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2008AA052401)；江苏省高技术研究计划资助项目(BG2005327)；江苏高校
自然科学重大基础研究计划资助项目(06KJ322015)
作者简介：宋向阳(1965一)，男，江苏无锡人，副教授，博士，研究方向：生物化工。E·mail：xiangyangsong@hotmail．com
万方数据
· 20· 生物加工过程 第6卷第6期
含量、乙醇含量和其他固形物的含量，减少了拌料
过程中水的投入，能节约相当数量的水，大大降低
蒸煮、发酵、蒸馏和浓缩干燥过程中的能量消耗B1。
但高浓乙醇发酵时间长，高浓度底物可能导致发酵
罐中残糖浓度高，且由于产物抑制、高渗透压和营
养不足等因素造成发酵不完全【3J。本文以混合糖
(木糖、己糖)为C源【4J，通过培养基和培养条件的
改变来确定树干毕赤酵母高糖浓度发酵时所需的
条件，为工业化高糖浓度发酵制备乙醇的生产工艺
提供理论基础。
1材料与方法
1．1 菌种
树干毕赤酵母(Pichiastipitis)P2，能够同步发酵
戊糖和己糖，由南京林业大学生物化工研究所通过
对美国标准菌库保藏菌种PichiastipitisCBS5776长
期的定向驯化和诱变所得，在抗抑制物和戊糖发酵
能力上均优越于其出发菌种。
I．2培养基和培养条件
菌种培养基(g／L)：木糖20．O，蛋白胨5．0，酵
母汁3．0；
增殖培养基(g／L)：木糖20．0，蛋白胨5．0，酵
母汁3．0；
发酵培养基(g／L)：木糖36．O一72．0，葡萄糖
9．0～85．0，CaCl20．3，MgS040．3，KH2P042．5，
CO(NH2)20．2，(NH。)2S041．1。
将试管斜面菌种接人液体酵母细胞培养基，在
30℃、150r／rain条件下活化2d后进行戊糖(己
糖)发酵，初始pH为5．0。
1．3分析测定
1．3．1还原糖测定
采用3，5．二硝基水杨酸(DNS)法测定【5]。
1．3．2乙醇含量测定
采用高效液相色谱(HPLC)法测定乙醇含量。
方法如下：测定试样先经10000r／rain离心5min，
上清液经0．22岬的滤膜过滤，再用HPLC分析，采
用外标法测定。
HPLC操作条件：Angilent1100色谱仪，色谱柱
为Bio—RadAminexHPX-87H(7．8mm×300mm)。
洗脱液为0．005mol／LH，S04，流速0．6mL／min，柱
温55℃，进样量lO斗L。检测器示差折光检测器。
2结果与分析
2．1 发酵液中初始木糖质量浓度对发酵的影响
树干毕赤酵母的特性之一是可以利用木糖作C
源，本试验以纯木糖为c源，研究不同初始木糖浓
度对树干毕赤酵母发酵的影响，实验结果如表1所
示。由表1可知，随发酵液中初始木糖质量浓度的
提高，乙醇质量浓度不断上升，当初始木糖质量浓
度在36．0—63．Og／L时，游离酵母发酵24h后残余
木糖质量浓度几乎为0，即木糖几乎都能被酵母利
用完，但超过63．0g／L时，木糖的利用受到限制，残
糖质量浓度大幅度上升，而乙醇质量浓度提高幅度
不大。随着初始木糖质量浓度的升高，这种抑制作
用更加明显。当初始木糖质量浓度为81．Og／L时，
发酵24h后残糖质量浓度高达15．7∥L，发酵不彻
底。延长发酵时间到36h时，初始木糖质量浓度为
72．O、81．0g／L的发酵液发酵后残糖质量浓度分别
降到0．3、5．1g／L，而乙醇质量浓度分别为29．5、
30．7g／L。因此在24h的发酵周期内以63．Og／L
的初始木糖较为适宜，残糖质量浓度为0．3g／L，乙
醇质量浓度达25．Og／L；在36h的发酵周期内以
72．0g／L的初始木糖较为适宜。
表l 初始木糖质量浓度对乙醇发酵的影响
Table711IeiImuenceofconcentrationofinitial
xyloseon thanolfermentation
g·L。
2．2葡萄糖对发酵的影响
天然植物纤维原料含有半纤维素、纤维素和木质
素，利用酶解、酸解或嗜热厌氧乙醇菌∞1等方法可将
纤维原料降解成五碳糖和六碳糖，其中最主要的是葡
萄糖和木糖。本试验在36．0g／L的木糖基础上，考
察添加9．0、18．0、36．0、54．0、72．0、85．0g／L的葡萄
万方数据
2008年11月 宋向阳等：高浓度糖发酵制备乙醇 · 2l ·
糖对树干毕赤酵母发酵的影响，实验结果如表2
所示。
表2添加葡萄糖对戊糖发酵产乙醇的影响
Table2 Theinfluenceofglucose011production
ofethanolbypentosefermentation
由表2可知，添加质量浓度9．0～54．0g／L的葡
萄糖经过24h发酵后，还原糖基本上被发酵利用完，
残糖浓度几乎为0，而乙醇浓度也随着葡萄糖的添加
而逐步升高；当添加葡萄糖质量浓度为72．0g／L，残
余还原糖质蛩浓度较高，达17．3g／L，发酵时间延长
到36h，残余还原糖为3．8g／L。随着葡萄糖浓度的
不断增加，发酵36h后残糖质量浓度也不断上升，添
加85．0g／L葡萄糖发酵后残糖质量浓度高达
14．4g／L，而乙醇质量浓度变化不大。因此葡萄糖的
添加浓度不宜太高，在24h发酵周期内，添加葡萄糖
质量浓度以54．0g／L为最佳，乙醇质量浓度为32．9
g／L；在36h发酵周期内，添加葡萄糖质量浓度以
72．0g／L为最佳，乙醇质量浓度为36．9g／L。
2．3不同N源对发酵的影响
N源是构成菌体物质和一些代谢产物的必需营
养元素，糖发酵制备乙醇与N源有一定关系。
本试验以80．9g／L的混合糖(葡萄糖与木糖质
量比为2：1)为C源，考察不同N源对戊糖发酵产乙
醇的影响，各种N源的计量以各自的含N量折算，
初始N质量浓度控制为0．2g／L，结果如表3所示。
由表3可知，采用不同N源，树干毕赤酵母发酵
结果有明显差异。从乙醇浓度来看，最佳发酵效果是
采用(NH。)2SO。作N源，乙醇质量浓度为30．4g／L，
其他依次是尿素、蛋白胨和NH。NO，，乙醇质量浓度
分别为29．4、25．9和22．9g／L。但从酵母生长变化
来看，以蛋白胨为好，酵母质量浓度由发酵前的12．3
g／L变为发酵后的13．1g／L，由于蛋白胨含有丰富的
蛋白质多肽和游离的氨基酸，并含有少量的维生素及
生长因子，可能营养过于旺盛，导致酵母的旺盛生长，
而对发酵不利。当单独采用Nil。N03作N源时，糖利
用率、乙醇得率都较低，分别为79．9％、70．8％，由于
酵母必须先将NOr还原成NH，，所以酵母发酵速度
和乙醇得率都较低。而采用尿素作N源时，糖利用率
和乙醇得率为99．1％、74．3％，不及(Nil。)2SO。作N
源时的99．8％、76．5％，因此戊糖发酵制备乙醇的最
佳N源为(NH。)2SO。。
表3 N源对戊糖发酵产乙醇的影响
Table3 Theinfluenceofnitrogennproductionofethanolbypentosefermentation
2．4 (NH。)2SO。浓度对发酵性能的影响
碳氮比是调控培养基的一个重要参数，碳氮比过
高或过低都会影响微生物的生长及目标代谢产物的
合成。N源浓度过高时菌体生长过于旺盛，自身供氧
量低，造成局部或阶段性供氧不足，部分微生物的衰
亡期提前，不利于目标产物的积累；N源含量低时，菌
体生长变慢，发酵周期相应延长，乙醇产量最高值出
现的时间滞后。本试验以80．9g／L混合糖(葡萄糖
万方数据
·22· 生物加工过程 第6卷第6期
与木糖质量比为2：1)为C源，通过变化(NH。)：SOd
浓度，来判定戊糖发酵制备乙醇所用(NH。)：SO。的最
佳浓度。(NH。)2S04质量浓度分别为0．6、0．8、1．1、
1．6,2．1g／L，结果如图1所示。
■●
№∞
董≤
磐磕
鼷心
qq
零承
蠢旃
暖、砷
幕让
器门
P((NH4)2S04)／(g‘L一1)
—o-残糖质量浓度；一糖利用率一乙醇质量浓度；一乙醇得率
图l (NH．)：S0。质量浓度对乙醇发酵的影响
Fig．1‰influenceofconcentrationof(NH4)2S04
onethanolfermentation
由图l可以看出，(NH。)：SO。质量浓度小于
1．1g／L时，随着其浓度的增加，发酵终了乙醇质量浓
度也逐渐上升，两者成正比例关系。当(NH。)：SO。浓
度为1．1g／L时，乙醇得率最高，达81．5％。当
(NH。)：SO。浓度大于1．1g／L时，乙醇浓度逐渐趋于
一恒定值，乙醇得率变化不大，且残糖浓度随着
(NH。)：SO。浓度的升高而逐渐下降。也就是说，当提
供充足的N源时，酵母接种进入发酵培养基后能很快
适应环境，缩短延迟期，使N源浓度不成为限制酵母
生长的因素，从而使酵母数量很快上升，缩短了发酵
时间。对于发酵而言，在不影响糖利用率与降低残糖
浓度的前提下，应尽量减少N源用量。在本试验中以
1．1g／L的(NH。)：So。质量浓度，既能保证发酵效果，
又能降低发酵成本。
2．5转速对发酵的影响
由于发酵液中同时存在木糖和葡萄糖，而葡萄糖
发酵并不需要供氧条件，因为葡萄糖在利用过程中首
先通过酵解(EMP)途径生成丙酮酸，最后生成乙醇，
代谢途径较简单。但木糖代谢相对复杂，木糖醇氧化
成木酮糖和磷酸戊糖循环这两步需要氧作为氢受体。
当发酵液中溶解氧缺乏时，木糖醇脱氢酶的辅酶
NADH积累，抑制了木糖醇脱氢酶的活力，从而引起
发酵液中木糖醇的积累；反之，溶解氧过高时，酵母增
殖旺盛，同时在氧过量时乙醇被作为C源而消耗掉。
在发酵的开始主要是葡萄糖的利用，其后才是木糖的
利用，酵母菌代谢葡萄糖和木糖时对O：的需求也不
同，所以有必要进行分阶段控制。
Horitsu等¨o在发酵制取木糖醇时采用分段变
转速的方法，发酵过程前期增加培养基的溶氧浓
度，使细胞快速生长并大量聚集，而木糖醇的产生
是在微耗氧条件进行的，后期适当降低通气量，对
提高木糖醇得率较有效。黄炜等人【81也采取分段
控制摇床转速的方法来提高木糖醇的产率，结果表
明采用先高后低的分段通气发酵在木糖醇得率方
面明显优于恒定通气发酵。本试验采用80．9g／L
的混合糖(葡萄糖和木糖质量浓度之比为2：1)为c
源，(NH。)：SO。为N源，以5种方式控制摇床转速，
结果如表4所示。
由表4可知，不同时期控制不同转速对糖的利
用、乙醇浓度及酵母浓度的变化有着不同的影响。
始终保持150r／rain的摇床转速发酵后，残糖质量
浓度相对较低，而乙醇质量浓度相当，但每轮发酵
后酵母浓度都增高，如第二轮发酵时的12．4g／L变
为第四轮发酵后的14．7g／L。这主要是在发酵前期
氧气供应比较多，导致酵母菌旺盛生长，残糖质量
浓度不断下降，多消耗的糖主要用于酵母菌的自身
繁殖，导致酵母浓度不断升高，而乙醇质量浓度并
未增高。“120—150”方式下，残糖质量浓度相对较
高，而乙醇质量浓度较低，且转速增大还会消耗更
大的能耗，增加了成本，因此这3种控制方式优先选
择“90～150”。
“90～120”方式下，虽然第一轮发酵时乙醇质量
浓度高于后者，但由于发酵后期氧气供应少于后者，
经过几轮发酵后，酵母的活性逐渐减弱，酵母菌数量
逐渐减少，糖利用率也逐渐减少，乙醇质鼍浓度逐渐
下降，如第四轮发酵时，乙醇质量浓度只有28．0g／L，
而酵母质量浓度也由第一轮发酵时的12．4g／L下降
到11．2g／L。“90一180”方式下，糖利用率虽然也很
高，但乙醇质量浓度并未相应增高，第四轮发酵后的
乙醇浓度为28．0g／L，酵母浓度变化很大，可能是供
氧太多，酵母代谢途径发生改变，酵母牛长旺盛，同时
在氧过量时乙醇也町能被作为C源消耗掉或在高转
速下被生成的CO，带出去【9J。“90—150”方式下，在
四轮发酵后。酵母质量浓度基本保持稳定，乙醇质量
浓度也较稳定，基本稳定在30．0g／L左右。因此在
高浓度混合糖发酵中，综合各方面的因素，可选择
“90—150”这种控制方式，即前8h摇床转速为
90r／min，后16h为150r／rain。
万方数据
2008年11月 宋向阳等：高浓度糖发酵制备乙醇 · 23·
表4不同时期控制不同转速对戊糖发酵产乙醇的影响
Table4Theinfluenceofdiffirentotate8pe捌ofswingbeduringdiffirent
periodonproductionofethanolbypentosefermentation
注：①“150”指24h始终保持摇床转速150r／rnin；②“120～150”指前8h摇床转速为120r／min，
后16h为150r／rain；③“90—150”指前8h摇床转速为90r／rain，后16h为150r／min；
④“90—120”指前8h摇床转速为90r／min，后16h为120r／rain；⑤“90—180”指前8h摇床
转速为90r／min，后16h为180r／rain。
3结论
1)在24h发酵周期内初始木糖质量浓度为
63．0g／L较为适宜，乙醇质量浓度达到25．0g／L；在
36h发酵周期内初始木糖质量浓度为72．9g／L较
适宜，乙醇质量浓度达到29．59／L。在36g／L木糖
基础上添加质鼍浓度为9．0～54．0g／L的葡萄糖，
发酵24h后残糖浓度几乎为0，低浓度的葡萄糖对
发酵有促进作用。
2)在36．0g／L的木糖基础上，在24h发酵周
期内，添加葡萄糖的质量浓度以54．0g／L最佳，乙
醇质量浓度能达到32．9g／L；在36h发酵周期内，
添加葡萄糖的质量浓度以72．0g／L最佳，乙醇质量
浓度能达到36．9g／L。
3)以80．9g／L的混合糖为c源，采用尿素、蛋白
胨、(NH。)：S04和NH。N03作N源时，24h发酵后从
乙醇浓度来看，发酵效果最佳是采用(NH。)：SO。作N
源，乙醇质量浓度为30．49／L，其他依次是尿素、蛋白
胨和NH。NO，，乙醇质量浓度分别为29．4，25．9和
22．9g／L。发酵最佳的(NH。)2S04浓度为I．1g／L。
4)混合糖发酵时采用分阶段控制转速法，最佳
摇床转速为“90—150”，即前8h摇床转速为90
r／min，后16h为150r／min，在此条件下酵母活性和
数量稳定，乙醇质量浓度达到30．0s／L。
参考文献：
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万方数据
·24· 生物加工过程 第6卷第6期
纤维素乙醇气化发酵研究取得进展
在美国提出的2022年生产1360亿L生物燃料目标计划中，纤维素生物燃料的研发将发挥巨大作用。
近10a来，美国俄克拉何马州立大学的生物燃料交叉学科研究小组在纤维素乙醇的气化发酵过程研究中取
得了进展。该项工艺主要利用低成本、未处理过的生物质原料，如多年生牧草和作物秸秆，能够获取生物乙
醇和其他增值产品。该研究小组正在进行进一步的整体分析研究，以解决生物质原料到液体燃料产品引用
中的一系列可持续发展问题。该研究小组宣布与Coskata公司和通用汽车公司合作，将共同开发下一代生
物乙醇市场。
杜邦拓展可再生来源包装材料开发
杜邦公司宣布对其DuPontBiomax系列包装材料进行拓展，将包含可再生来源的BiomaxThermal300热
稳定修饰剂用于聚乳酸(PLA)，从而使PLA热塑包装在运输、存储和使用过程中耐受更高的温度，将有助于
可再生包装应用的扩展。
BiomaxThermal是杜邦公司用于PLA的第二种修饰剂，2007年投入使用的BiomaxStrong加强修饰剂提
高了PLA的可加工性、耐受性、冲击强度和柔韧性。BiomaxStrong加强修饰剂来源于石化材料，而质量分数
为50％的BiomaxThermal来自可再生资源。BiomaxThermal将首先进入美国市场，最早在2009年进入欧洲
和亚太市场。
(朱宏阳)
万方数据