免费文献传递   相关文献

Isolation and characterization of moderately halophilic bacteria in the saltern of Yancheng city

江苏盐城盐场中度嗜盐菌的分离与鉴定



全 文 :第 12卷第 4期
2014年 7月
生  物  加  工  过  程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol􀆰 12 No􀆰 4
Jul􀆰 2014
doi:10􀆰 3969 / j􀆰 issn􀆰 1672-3678􀆰 2014􀆰 04􀆰 016
收稿日期:2013-01-15
基金项目:国家自然科学基金(51008012)
作者简介:訾小利(1987—),女,安徽淮化人,硕士研究生,研究方向:应用微生物;胡  南(联系人),副教授,E⁃mail:hunannjut@ 126.com
江苏盐城盐场中度嗜盐菌的分离与鉴定
訾小利,李荣鹏,张  霞,高浩峰,胡  南
(南京工业大学 生物与制药工程学院,南京 211800)
摘  要:采用高盐的牛肉膏蛋白胨培养基(盐浓度为 8% NaCl),研究江苏省盐城市盐场土壤里中度嗜盐菌的分布
情况及种群特征。 从盐城市的射阳、新滩、灌东三处盐场土壤中共采集和分离得到 13株中度嗜盐菌。 通过形态观
察、生理生化分析、16S rRNA序列分析和系统进化分析等方法进行初步鉴定,结果表明:分离到的中度嗜盐菌分属
3个属,Virgibacillus属 4株、Halomonas属 7株和 Marinobacter 属 2株。 研究结果揭示盐城市的盐场存在较为丰富的
中度嗜盐菌,具有较高的研究和利用价值。
关键词:细菌;嗜盐;系统进化分析;盐场
中图分类号:X172        文献标志码:A        文章编号:1672-3678(2014)04-0082-05
Isolation and characterization of moderately halophilic bacteria in the
saltern of Yancheng city
ZI Xiaoli,LI Rongpeng,ZHANG Xia,GAO Haofeng,HU Nan
(Colloge of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)
Abstract:To investigate the diversity and population characteristics of halophilic and population bacteria
in saltern of Yancheng city, 13 bacterial strains were isolated from the soil of Sheyang, Xintan and
Guandong solar saltern, culturing in beef preptone medium with high salt concentration ( 8% NaCl)
􀆰 Morphologic observation,physiological and biochemical analysis were operated. Results showed that 13
bacteria strains belonged to three groups,4 in genera Virgibacillus,7 in genera Halomonas and 2 in genera
Marinobacter􀆰 The research proved that there was abundant phylogenetic diversity of moderately halophilic
bacteria,thus, it was valuable in research and application􀆰
Key words:bacteria;halophilic;phylogenetic analysis;saltern
    嗜盐菌广泛分布于海洋、盐场和盐湖等高盐环
境中,根据其生长所需最适盐浓度的不同,可分为
弱嗜盐菌(2% ~ 5%)、中度嗜盐菌(5% ~ 20%)和极
端嗜盐菌(20% ~ 30%) [1-3]。 由于不同地域条件下
的高盐环境在形成过程、气候特征及盐分组成方面
具有较大的差异,因此,蕴藏于其中的嗜盐细菌群
落结构组成也会各有不同[4]。 而在盐场中,中度嗜
盐菌是最重要的细菌组成部分[5],它们的耐盐机制
主要是相容性溶质机制,通过积累有机化合物如糖
类、氨基酸或氨基酸的衍生物(四氢嘧啶、羟基四氢
嘧啶和甜菜碱等),来对抗高盐环境,进而达到渗透
压平衡[6-8]。 相容性溶质的产物和其他化合物一
样,比如菌视紫红质、胞外多糖、水解酶类和生物表
面活性剂等在工业上都具有广阔的应用前景[9-10]。
已报道的中度嗜盐菌如 Marinobacter、Idiomarina 和
Halomonas 可降解有机污染物、有机氮化合物(存在
于食物、有机材料、化肥、毒物和炸药中)。 此外,中
度嗜盐菌可以在高盐、高pH 情况下发挥作用,如高
盐废水处理等,从而使一些特殊环境下的生物降解
得以实现[11-12]。
江苏省盐城市位于苏北平原东部,东临黄海,有
全国面积最大的滩涂,盐场众多,是我国东南沿海重
要的盐业生产中心,有着丰富的嗜盐微生物资源[13]。
笔者从盐城的射阳、新滩和灌东 3 个盐场采集土样,
分析其中的嗜盐细菌群落结构组成,以期为进一步对
这些嗜盐菌开展理论和应用研究提供基础。
1  材料与方法
1􀆰 1  材料
1􀆰 1􀆰 1  采样
采样地点为江苏省盐城市的射阳盐场、新滩盐
场和灌东盐场。 取地表 10 ~ 15 cm 深度采样,装入
无菌试样袋密封,将取得的试样保存于 4 ℃冰箱用
于嗜盐菌的筛选。
1􀆰 1􀆰 2  主要试剂
细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自康为世纪生
物科技有限公司,蛋白酶 K、溶菌酶、Taq 酶、DL2000
DNA标准分子质量、DL15 000 DNA 标准分子质量
和 pMD19 T 载体等购自 TaKaRa 公司,PCR 引物
由南京金斯瑞生物技术有限公司合成,DNA 胶回收
试剂盒和质粒快速提取试剂盒购自 AXYGEN,其他
试剂为国产分析纯。
1􀆰 1􀆰 3  培养基
含高盐的牛肉膏蛋白胨培养基( g / L):牛肉膏
5、蛋白胨 10、NaCl 80、KCl 5、MgSO4·7H2O 2􀆰 5;蒸馏
水定容至 1 L,调节 pH 至 7􀆰 0 ~ 7􀆰 2,固体培养基添
加 20 g / L琼脂,121 ℃湿热灭菌 20 min。
1􀆰 2  方法
1􀆰 2􀆰 1  嗜盐菌的分离筛选
制备含 80 g / L NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基平
板,称取采集的土壤试样 1 g 左右加入 50 mL 液体
培养基,加入玻璃珠振荡培养 2 h,将制备的土壤悬
液进行梯度稀释后(10-6)涂布培养基平板,涂板悬
液为 200 μL,30 ℃培养 72 h,采用划线法纯化分离
菌株。
1􀆰 2􀆰 2  嗜盐菌耐盐性的测定
将分离纯化的耐盐菌分别转接到含 NaCl 质量
浓度分别为 0、5、40、80、100、120、150、200、250 和
300 g / L的牛肉膏蛋白胨固体培养基上,划线培养,
30 ℃下培养 3 d,观察生长情况以确定细菌耐盐
程度。
1􀆰 2􀆰 3  嗜盐菌的生理生化性质的测定
对嗜盐细菌的革兰氏染色、过氧化氢酶、氧化
酶、甲基红、V.P.、Tween 80、淀粉水解、吲哚实验和
硝酸盐还原进行检测,实验方法参照文献[14-15]
进行。 对嗜盐细菌的 C 源利用进行检测。 选择乙
酸钠、草酸钠、丁二酸钠、柠檬酸三钠、葡萄糖、乳糖
和蔗糖这 7种糖试剂作为 C 源,配制 C 源筛选固体
培养基,80 g / L NaCl,将分离的菌株划线培养,30 ℃
下培养 3 d,观察生长情况以确定细菌能否利用该
C源。
1􀆰 2􀆰 4  嗜盐细菌 16S rRNA序列分类的鉴定
提取分离出的各菌株基因组 DNA作为模板,以
细菌 16S rRNA通用引物 27F:5′ AGAGTTTGATC⁃
CTGGCTCAG 3′和 1492R:5′ GGTTACCTTGTTA⁃
CGACTT 3′为引物扩增 16S rRNA。 产物胶回收
后,连接到载体 pMD19 T,并送到大连宝生物工程
有限公司进行全序列测定。
1􀆰 2􀆰 5  16S rRNA序列的系统进化树分析
将测得的 16S rRNA 序列在 NCBI 的 GenBank
中进行 BLAST 分析。 使用 MEGA 4􀆰 0 软件中的
Neighbor⁃joining 法构建系统进化树。 同时,重复取
样 1 000次进行自展值(Bootstrap value)分析评估系
统进化树的拓扑结构的稳定性。
2  结果与讨论
2􀆰 1  嗜盐菌的分离
在含有 80 g / L NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基平
板上分离得到菌落形态差异的 13株细菌,分别标记
为菌株 NY 1~NY 13。 其中 4株为革兰氏阳性枝
芽胞杆菌,其他均为革兰氏阴性杆状菌。 反复纯化
后的菌株于 80 g / L甘油条件下-80 ℃保存,以便后
面研究使用。
2􀆰 2  耐盐性检测
分离得到的 13 株菌株在不同盐浓度的培养基
平板上的生长情况表明,有 7株细菌的 NaCl耐受度
达到或超过 150 g / L,最高的可耐受 300 g / L,其他的
可达到 120 g / L,所有菌株的最适生长 NaCl 质量浓
度均在 40~100 g / L 之间,根据嗜盐菌的定义,分离
到的所有菌都为中度嗜盐菌。
38  第 4期 訾小利等:江苏盐城盐场中度嗜盐菌的分离与鉴定
2􀆰 3  生理生化检测
表 1 为所分离菌株的生理生化检测结果。 由
表 1 可知:经革兰氏染色观察,所分离的 13 株中
度嗜盐菌中,有 9 株菌为革兰氏阴性菌,其余 4 株
为革兰氏阳性菌株。 13 株中度嗜盐菌氧化酶均为
阳性,大部分菌株的过氧化氢酶、吲哚实验为阳
性,甲基红、V.P.、Tween 80 淀粉水解实验为阴性,
除菌株 NY 3 外,其余菌株的硝酸盐还原实验均
为阳性。 C 源利用结果显示,NY 1 只能利用这 7
种 C 源中的柠檬酸三钠和葡萄糖,NY 11 只能利
用柠檬酸三钠和蔗糖,可利用的 C 源范围较窄,而
NY 12 和 NY 13 可全部利用这 7 种 C 源,适用
的 C 源较为广泛,其余的菌株可利用这 7 种 C 源
的绝大部分。
表 1  分离菌株的生理生化特性
Table 1  Physiological and bio⁃chemical characters of strains
生理生化
指标
菌  株
NY 1 NY 2 NY 3 NY 4 NY 5 NY 6 NY 7 NY 8 NY 9 NY 10 NY 11 NY 12 NY 13
革兰氏染色 + - - - - + - - - - + - +
过氧化氢酶 + + + - - + - + - + + - -
氧化酶 + + + + + + + + + + + + +
甲基红 + - - + + + - - - - - - -
V.P. - - + - - - - - + - + - +
Tween 80 + - - + - + - - + - + - -
淀粉水解 - - + - + - + + - - - + -
吲哚 + + + + - + - - + - + - -
乙酸钠 - + + + + - + + + - - + +
草酸钠 - + - - + + + - - + - + +
丁二酸钠 - + - + + + + + + + - + +
柠檬酸三钠 + + - + + - + + + + + + +
葡萄糖 + + + - + + + - - - - + +
乳糖 - + - - + - + - - - - + +
蔗糖 - + + - + - + + - - + + +
硝酸盐还原 + + - + + + + + + + + + +
  注:+代表阳性,-代表阴性。
2􀆰 4  16S rRNA序列的相似性比较和系统进化分析
利用细菌 16S rRNA 通用引物,以分离获得的
13株嗜盐菌的基因组 DNA 为模板,扩增获得它们
的 16S rRNA基因并进行测序。 共获得 13条有效序
列,长度均约为 1 500 bp。 获得的基因序列信息分
别上传到 NCBI 的 GenBank 数据库中,BLAST 比对
寻找同源菌株,得到相似性最高相关菌株的 16S
rRNA基因序列(均高达 99%同源性,表 2)。
进一步将所测序列与 BLAST比对得到的相近中
度嗜盐菌已知种和部分相关种的模式菌株进行系统
进化树估算,得到以 16S rRNA序列为基础的系统发
育树(图 1)。 由图 1 可知:分离得到的 13 株中度嗜
盐菌可以分为三类。 第Ⅰ类为 Halomonadaceae 科的
Halomonas属,包括 NY 2、NY 3、NY 5、NY 7、
NY 8、NY 10和 NY 12共 7株,是盐场中度嗜盐
菌中 的 优 势 类 群。 第Ⅱ类 为 Bacillaceae 科 的
Virgibacillus 属,包括 NY 1、 NY 6、 NY 11 和
NY 13。 第 Ⅲ 类 为 Alteromonadaceae 科 的
Marinobacter属,包括 NY 4和 NY 9。 大部分分离
菌株与已知物种典型菌株之间的 16S rRNA序列都有
一定的差异,这些结果解释了盐场土壤里中度嗜盐菌
的稀有性及丰富的多样性。
48 生  物  加  工  过  程    第 12卷 
表 2  分离菌株同最近菌株的系统发育关系
Table 2  Phylogenetic relation to nearest neighbors of isolated strains
菌株号 最近的菌株 与最近菌株的相似性 / %
NY 1 (JN887878) Virgibacillus dokdonensis 99
NY 2 (JN903896) Halomonasaquamarina 99
NY 3 (JN903897) Halomonas taeanensis 99
NY 4 (JN903898) Marinobacter hydrocarbonoclasticus 99
NY 5 (JN903899) Halomonas elongata 99
NY 6 (JN903900) Virgibacillus dokdonensis 99
NY 7 (JN903901) Halomonas caseinilytica 99
NY 8 (JN903902) Halomonas venusta 99
NY 9 (JN903903) Marinobacter hydrocarbonoclasticus 99
NY 10 (JN903904) Halomonas variabilis 99
NY 11 (JN903905) Virgibacillus dokdonensis 99
NY 12 (JN903906) Halomonas elongata 99
NY 13 (JN903907) Virgibacillus marismortui 99
图 1  盐场中度嗜盐菌的 16S rRNA序列的系统发育树
Fig􀆰 1  Neighbor⁃joining tree constructed based on 16S rRNA sequences analysis showing the phylogenetic
relationships among strains isolated from solar saltern and related taxa
58  第 4期 訾小利等:江苏盐城盐场中度嗜盐菌的分离与鉴定
3  结  论
对江苏省盐城市 3个盐场土壤中的嗜盐菌进行
分离鉴定,并进行多样性研究。 在 3 个盐滩的土壤
中,共分离获得 13株中度嗜盐菌,分别为 Halomonas
属(7 株)、 Virgibacillus 属(4 株)和 Marinobacter 属
(2株),说明在盐城市的盐滩中,Halomonas 属是优
势种群。 大部分分离菌株与已知物种典型菌株之
间的 16S rRNA 序列都有一定的差异,表明盐滩土
壤里,中度嗜盐菌具有稀有性及丰富的多样性 2 种
特征。
参考文献:
[ 1 ]  Hedi A,Sadafi N,Fardeau M L,et al.Studies on the biodiversity
of halophilic microorganisms isolated from EI⁃Djerid Salt Lake
(Tunisia) under aerobic conditions [ J] . Int J Microbiol,2009.
doi:10.1155 / 2009 / 731786.
[ 2 ]   Oren A.Halophilic microorganisms and their environments[M].
Norwell:Kluwer Academic Publishers,2002.
[ 3 ]   Ventosa A,Nieto J J,Oren A. Biology of moderately halophilic
aerobic bacteria[J] .Microbiol Mol Biol Rev,1998,62:504⁃544.
[ 4 ]   吴海平,王真辉,杨礼富.新疆达坂盐湖沉积土壤嗜盐细菌的
定向富集与多样性分析[ J] .微生物学通报,2010,37 ( 7):
956⁃961.
[ 5 ]   Baati H, Amdouni R, Gharsallah N, et al. Isolation and
characterization of moderately halophilic bacteria from Tunisian
solar saltern[J] .Curr Microbiol,2010,60:157⁃161.
[ 6 ]   Roberts M F. Organic compatible solutes of halotolerant and
halophilic microorganisms[J] .Saline Systems,2005(1):1⁃5.doi:
10.1186 / 1746⁃1448⁃1⁃5.
[ 7 ]   Mevarech M,Frolow F,Gloss L M. Halophilic enzymes:proteins
with a grain of salt[J] .Biophys Chem,2000,86:155⁃164.
[ 8 ]   Tehei M,Franzetti B,Maurel M C,et al.The search for traces of
life:the protective effect of salt on biological macromolecules[J] .
Extremophiles,2002,16:427⁃430.
[ 9 ]   Elevi R, Assa P, Birbir M, et al. Characterization of extremely
halophilic archaea isolated from saline environment in different
parts of Turkey[J] .Microbiol,2006,75(6):739⁃746.
[10]   Sánchez⁃Porro C, Martín S, Mellado E, et al. Diversity of
moderately halophilic bacteria producing extracellular hydrolytic
enzymes[J] .J Appl Microbiol,2004,94(2):295⁃300.
[11]   Le Borgne S,Paniagua D,Vazquez⁃Duhalt R. Biodegradation of
organic pollutants by halophilic bacteria and archaea[ J] . J Mol
Microbiol Biotechnol,2008,15(2 / 3):74⁃92.
[12]   Vashed S Z,Forouhanded H,Hassanzadeh S,et al. Isolation and
characterization of halophilic bacteria from Urmia Lake in Iran
[J] .Mikrobiologiia,2011,80(6):826⁃833.
[13]   何敏艳,邹正中,蔡琳,等.连云港台北和盐城三圩盐田土壤
嗜盐菌多样性研究[J] .微生物学通报,2008,35(5):737⁃742.
[14]   东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版
社,2001.
[15]   Hot G J,Krieg R N,Sneath H A P.Bergey′s manual of determinative
bacteriology[M].9th ed.Baltirnore:Willianms & Wilkins,1994.
(责任编辑  荀志金)
68 生  物  加  工  过  程    第 12卷