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生 物 加 工 过 程
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第 9 卷第 % 期
%&&’ 年 ’ 月
反相高效液相色谱在发酵制备琥珀酸中的应用
陈可泉，韦! 萍，蔡! 婷，苏! 溧，龚! 璐，姜! 岷!
（南京工业大学制药与生命科学学院，南京 %:&&&;）
摘! 要：对于生物法制备琥珀酸的微生物发酵体系，利用 <22=,6)反相 >1,?#*2 (:@ 色谱柱，以 %’ AA/2 B C磷酸二氢钾
（5D %E ’）作为流动相，在流速 : AC B A*+时，于 %:& +A处紫外检测器检测，能将发酵液中琥珀酸、甲酸、乙酸和乳酸
完全分离并准确定量。琥珀酸等有机酸的回收率在 ;FG H :&IG之间。本方法能够快速、精确测定发酵样品中主
产物琥珀酸与其它有机酸含量。
关键词：反相高效液相色谱；琥珀酸；有机酸；发酵
中图分类号：JF’KE K! ! ! ! 文献标识码：!""#$%&’$() (* +,-,+.,/ "0&., 1234 *(+ ’0, "+(/5%’$()
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! ! 琥珀酸（T066*+*6 #6*W），又称丁二酸，是厌氧发
酵的代谢产物之一。它可以作为很多重要化学品的
中间产物和专业化学制品，可以取代很多基于苯和
石化中间产物的商品［:OI］。琥珀酸在食品、医药、表
面活性剂、洗涤剂、绿色溶剂、生物可降解塑料和动
植物生长刺激物等领域也有广泛的应用前景［:，’］。
由于琥珀酸的广泛用途，它的生产越来越受到
人们的重视。传统生产方法为催化加氢法、石蜡氧
化法、电化学合成法［I］。目前国内外的研究热点是
采用微生物发酵法来生产琥珀酸，以减少人们对石
油等不可再生资源的依赖。目前研究的最多的琥珀
酸产生菌有 !"#$%&’("$))*+ +*""$%&,-%-+、!%(-.&’$&+/$0
.$))*1 +*""$%$"$/.&2*"-%+、重组 3E 4&)$ ，它们可以在厌
氧条件下利用葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖等很
多糖类来产生琥珀酸，同时伴随有乙酸、甲酸和乳酸
等副产物产生［:，F］。在发酵过程中通过对这些有机
酸含量的分析，可以对菌种的代谢途径有一个比较
直观的了解，对发酵代谢调控有很重要的意义。发
! 收稿日期：%&&’O&’O::
基金项目：国家重点基础研究发展计划（;K9 计划，%&&9(4K:F&&&I）、国家自然科学重点基金（%&&9F&:&）
作者简介：陈可泉（:;@%O），男，硕士研究生，研究方向：发酵工程。
联系人：姜! 岷，&%’O@9’@K99&万方数据
! "##$ 年 $ 月 陈可泉等：反相高效液相色谱在发酵制备琥珀酸中的应用 · $%! ·
酵过程中产物及副产物测定可以采用 &’() 法［*+,］，
以有机酸柱来分析，但由于有机酸柱较为昂贵，本文
尝试利用反相 )%- 柱来同时检测发酵液中各有机
酸的含量。
!" 实验部分
%. %! 仪器与试剂
%. %. %! 仪! 器
高效液相色谱仪（ /"0 &’() 1231，4556789：
:;<=+"#%，(<>?@A；’B7C4D5 )%-，@556789；E467BF
&’() "#%# 工作站）；G=+&= 冷冻离心机（ H?)I+
J@>）；’&=+K)，精密 1&计（上海雷磁仪器厂）。
%. %. "! 试! 剂
琥珀酸，色谱纯（=:’?()L）；乳酸，色谱纯（上
海化学试剂有限公司）；乙酸，分析纯（上海化学试
剂有限公司）；甲酸，分析纯（中国太仓特种试剂厂）
；磷酸二氢钾，分析纯（广东汕头市西陇化工厂）。
%. "! 色谱条件
色谱柱：无机色谱柱 ’B7C4D5 )%- 8M523N "$# 33
O/. 0 33；紫外检测波长 "%# N3；流动相 "$ 33M5 P
( I&"’L/，1& ". $（抽滤脱气）；流动相流速 % 3( P
3DN，进量 "# !(；柱温，室温。
%. K! 有机酸标准曲线的绘制
用超纯水分别精确配制不同浓度的标准琥珀酸
溶液，标准甲酸溶液，标准乙酸溶液，标准乳酸溶液，
经 #. "" !3微孔滤膜过滤后，进样 "# !(，得出各峰
色谱图，测定峰面积，以峰面积（!）为纵坐标，样品
质量浓度（"）为横坐标，分别绘制标准曲线，得出各
线性参数。
%. /! 有机酸混合标准液的配制
精确称取一定量的琥珀酸、甲酸、乙酸、乳酸，用
超纯水配制成有机酸标准混和溶液，各有机酸的质
量浓度（ Q P (）分别为琥珀酸 %. #，甲酸 %. #，乙酸
%. #，乳酸 %. #。
%. $! 发酵液样品预处理
将发酵液经冷冻离心机以 %# ### B P 3DN的速率
离心 %$ 3DN后，上清液经 #. "" !3微孔滤膜过滤后
进样。
%. 0! 发酵液样品中有机酸的定性定量分析
在相同色谱条件下，将发酵样品色谱图与有机
酸标准液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品
中各有机酸的峰。有机酸的定量在样品进样量和标
样相同的情况下，采用有机酸标准曲线确定。
#" 结果与讨论
". %! 有机酸标准曲线的绘制
". %. %! 由 %. K 标准曲线绘制方法，作琥珀酸，甲酸，
乙酸，乳酸出峰色谱图，得出琥珀酸，甲酸，乙酸，乳
酸的保留时间分别为为 %#. /,%、K. */K、0. "*-、
$. $$/ 3DN。并且得出各有机酸的标准曲线线性参
数见表 %。
表 %! 标准曲线的线性参数
R4S57 %! R97 5DN74B 7T246DMNF MU F64NV4BV 82BC7F
有机酸 回归方程 相关系数
线性范围 P
（Q P (）
检出限 P
Q
琥珀酸 ! W K-K *0%. */" , O " X %* K$K. %/" -0 #. ,,$ /%- % Y $ 0. K#$ - O %# Z-
甲酸 ! W "0% $-". #-$ * O " Z /" ,#*. *%/ ", #. ,,/ #0- % Y $ $. ,#* %0 O %# Z,
乙酸 ! W "#$ K%#. #-$ * O " Z 0 "%0. *%/ "-0 #. ,,, $0$ % Y $ ". $#* $" O %# Z-
乳酸 ! W %-0 #KK. #-$ * O " X / 0$,. "-$ *%/ #. ,,- 0*- % Y $ %. ,-# ## O %# Z-
". "! 有机酸混合标准液的色谱分离
按照 %. / 的方法对 / 种有机酸混合标准液进行
分离，实验结果如图 % 所示。
从图 % 可知，以 "$ 33M5 P ( 磷酸二氢钾（ 1&
". $）作为流动相，可以达到四种有机酸的完全分
离。
". K! 精密度、重复性与回收率实验结果
". K. %! 精密度实验
取一经稀释的发酵样品按照 %. $、%. 0 的方法，
在相同色谱条件下，重复进样 $ 次。
". K. "! 重复性试验
取 K 个不同琥珀酸浓度的发酵液，分别取样 K
次，重复测定 K 次。结果见表 K。
其他 K 种有机酸测定的重复性实验采取同样方
法测定，由于篇幅关系，数据略。
万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 # 期
%：甲酸（ &’()*+ ,+*-）；#：乳酸（ .,+/*+ ,+*-）；
$：乙酸（,+0/*+ ,+*-）；1：琥珀酸（23++*4*+ ,+*-）
图 %! 有机酸混合标准液的色谱分离图
5*67 %! 89(’),/’6(,) ’& 2/,4-,(- ’(6,4*+ ,+*- 2,):.02
表 #! 精密度实验结果（! ; "）
<,=.0 #! >023./2 ’& :(0+*2*’4（! ; "）
分析次数
琥珀酸质量
浓度 ?（6 ? @）
甲酸质量
浓度 ?（6 ? @）
乙酸质量
浓度 ?（6 ? @）
乳酸质量
浓度 ?（6 ? @）
% $7 AAB A $7 A%B B #7 C1D $ #7 CEB #
# #7 BA# " $7 A"E C #7 CDA 1 $7 A1D #
$ $7 %%# C #7 CC# C $7 A$E # #7 CCD "
1 #7 CA% C $7 A#" $ $7 ADE E $7 ADD #
" #7 DEC E #7 CD1 C #7 CAB % $7 A#C C
相对标准偏差 17 B#F %7 A"F #7 #BF %7 $BF
表 $! 重复性实验结果（! ; $）
<,=.0 $! >023./2 ’& >0:0,/,=*.*/G
样品
琥珀酸质量浓度（平均值）?
（6 ? @）
相对标准偏差 ?
F
% A7 B"$ # #7 %E
# #7 BE1 D $7 %B
$ 17 "E$ % 17 A$
#7 $7 $! 回收率实验
测定一经稀释的发酵液样品，然后分别加入标
样进行测定。结果见表 1。
表 1! 回收率实验结果
<,=.0 1! >023./2 ’& (0+’H0(G（! ; $）
样品组分
样品质量
浓度 ?（6 ? @）
加标量 ?
（6 ? @）
加标实测值 ?
（6 ? @）
回收率 ?
F
相对标准
偏差 ? F
琥珀酸 %7 BD# " %7 AAA A #7 DBC A CE7 BE %7 "C
#7 AAA A $7 B%A $ CB7 $C #7 AD
$7 AAA A "7 A#" B %A$7 %" $7 DC
甲酸 %7 E## " %7 AAA A #7 "D1 E CB7 %D #7 B$
#7 AAA A $7 E1E $ %AA7 EE %7 DE
$7 AAA A 17 EBA " %A%7 #" %7 "$
乙酸 A7 $E% B %7 AAA A %7 $1D 1 CB7 C1 A7 BD
#7 AAA A #7 $E" $ %AA7 %" #7 A1
$7 AAA A $7 1#1 A %A%7 B" %7 #C
乳酸 %7 "#1 E %7 AAA A #7 1$% D CE7 $% #7 A"
#7 AAA A $7 1"# D CD7 CE A7 BC
$7 AAA A 17 1$# $ CD7 CE %7 "%
#7 $7 1! 发酵液中有机酸的分析
由 %7 E 分析方法，取发酵液在上述分离条件下
进行色谱分离得到色谱图，结果如图 #。
%：甲酸（ &’()*+ ,+*-）；#：乳酸（ .,+/*+ ,+*-）；
$：乙酸（,+0/*+ ,+*-）；1：琥珀酸（23++*4*+ ,+*-）
图 #! 发酵液中有机酸色谱分离图
5*67 #! 89(’),/’6(,) ’& &0()04/,/*’4 =(’/9
从图 # 可知：本方法能将发酵液中琥珀酸，甲
酸，乙酸和乳酸完全分离并准确定量。
!" 结" 论
采用反相 I(0H,*. 8%B 色谱柱，以 #" ))’. ? @ 磷
酸二氢钾（:J #7 "）作为流动相，在流速 % )@ ? )*4、
波长 #%A 4)下检测，能将发酵液中琥珀酸，甲酸，乙
酸和乳酸完全分离并准确定量。琥珀酸等有机酸的
回收率在 CEF K%A1F之间。实验证明本方法能够
快速、精确测定发酵样品中主产物琥珀酸与其它有
机酸含量，对于指导生物法代谢调控生产琥珀酸具
有重要意义。
参考文献：
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（上接第 TT 页）
!" 结" 论
本文尝试了不同功能基团的聚苯乙烯树脂进行
’O海因酶的固定化，结果表明氨基树脂功能基为伯
氨基和仲氨基效果较好。从酶活回收率，固定化酶
的使用寿命，聚苯乙烯树脂价格等方面综合考虑，认
为采用聚苯乙烯树脂 ’S" 所制备的固定化酶具有
应用价值。采用该树脂制备固定化酶的最优条件
是：酶质量浓度 X +1 2 +3、温度 "$ ]、时间 &" A。所
得固定化酶的最适作用温度 T$ ]，最适作用 IB 为
.- $，且作用温度及适宜作用 IB 较广，!+为游离酶
的 &- . 倍，且储存稳定性、操作稳定性较好。T$ ]
下进行连续反应，其半衰期为 && E。
参考文献：
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万方数据