全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
-:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ
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GB@"&%2(/*/6_2@00C2&*$ =(*!2$%&%2%#2%%#
收稿日期"$%%/ =&% =(&
基金项目"国家科技支撑计划资助项目#$%%Y5&$*Y%$
作者简介"王"健#&/!&$男山东潍坊人工程师研究方向"微生物药物和天然药物的提取工艺%张雪霞#联系人$高级工程师TRA,@."
9:,C H^E^@,9^^ c&*(2IBA
超滤法提纯万古霉素的应用
王"健张雪霞王海燕李晓露张金娟张"丽
#华北制药集团 新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心石家庄 %)%%&)$
摘"要"采用W.?F,RD.B超滤系统提纯未经任何预处理的万古霉素发酵液( 结果表明"万古霉素收率由传统工艺#板
框加压过滤$的 !i提高到 /#i滤液的透光度比传统工艺提高了 $)i%系统平均膜通量可达 &$% V6#A$$:$%被
污染的膜经清洗后与新膜没有明显差异%合理加水量为投料量的 $d) 倍( W.?F,RD.B超滤系统完全能代替传统工艺(
关键词"发酵液%提纯%超滤%万古霉素
中图分类号"f7%$!d!""""文献标志码"5""""文章编号"&*$ =(*!#$%&%$%# =%%& =%)
W34.7.:5F.2/27Z5/:2GA:./JA 36F457.6F45F.2/
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K0A L24I1"DEFAEC?,?@BC 8FB?:% 1HF@D@I,?@BC% H.?F,D@.?F,?@BC% \,CIBCAKI@C
""万古霉素是一种糖肽类窄谱抗生素临床上主
要用于治疗由去甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌
# a`Q5$引起的感染( 它由美国礼莱公司开发
&/)! 年获U35批准上市*& =(+ ( 万古霉素的临床应
用越来越受到人们的重视( 我国有多家制药企业
正在研究万古霉素的生产工艺其中浙江新昌制药
公司第一个被批准生产产生了显著的社会)经济
效益*#+ ( 万古霉素主要采用发酵法生产其发酵液
成分复杂除目标产物外还含有金属离子)菌丝体
和菌体分泌的多种蛋白质)以及细胞所释放的大量
胞内物质*)+ ( 目前国内外普遍采用传统的过滤工
艺#板框加压过滤$来提纯万古霉素即将发酵液加
入一定量的助滤剂)絮凝剂后用板框加压过滤的
分离法除去这些杂质此法存在操作工艺繁琐)滤
液质量不高)收率较低)生产环境差)劳动强度大等
问题( 鉴于此亟须有新型的分离技术来取代传统
分离方法(
""本文采用超滤法** =+代替传统的过滤工艺来提
纯万古霉素发酵液以简化操作工艺流程提高滤
液质量和过滤收率为目的进行实验研究(
D?材料与方法
D D^?材料
""W.?F,RD.B超滤系统WU中试设备%平板薄层复合
超滤膜#膜面积 &d%! A$截留相对分子质量为 &) j
&%
#
$厦门 QHC?,F膜科技公司%fW &!%% Q;-紫外
可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司%万
古霉素标准品Q@JA,公司%万古霉素发酵液只经
酸化处理14( 左右不添加任何助滤剂)絮凝剂
华北制药股份公司(
D B^?实验过程
""万古霉素发酵液经泵加压后进入 W.?F,RD.B超
滤分离系统万古霉素透过膜流进清液贮罐而菌
丝体)蛋白质和固体悬浮颗粒等杂质被截留经换
热器冷却后#因泵运行后会放热使料液温度升高$
送回发酵液贮罐进一步浓缩当浓缩液固含量达到
一定比例时再用一定量的水清洗使滤渣中残留
的万古霉素被充分洗涤出来工艺流程见图 &(
&&发酵液贮罐%$&温度计%(&泵%#&阀门%
)&压力表%*&清液贮罐%&超滤系统%!&换热器
图 D?工艺流程
N.;=D?N62L:-54F27942:011
D M^?透光度测定
""用去离子水将试样稀释 &) 倍用紫外可见分光
光度计在 $!% CA处测透过率(
D @^?膜通量测定
""水通量#即单位时间)单位膜面积水的透析量$
测定"在每次超滤发酵前用泵打水循环操作压力
%d( ;`,压力稳定后用秒表测定 ( A@C用合适的容
器收集透析的水测定水的体积并根据膜面积计算
出单位时间)单位膜面积的水通量值(
""料通量#即单位时间)单位膜面积滤液的透析
量$ 测定"在超滤开始)进料压力稳定后用秒表计
时( 测定超滤过程中某一时间的通量情况"从该点
计 ( A@C收集 ( A@C 内超滤系统透析的滤液并计
算出单位时间)单位膜面积滤液的通量值(
""整批通量测定"记录超滤过程用时#即从进料开
始至停止进料所用时间$测定系统该批滤液透析总
体积并计算出单位时间)单位膜面积滤液的通量值(
D P^?万古霉素效价的测定
""采用4;V-法色谱条件"色谱柱 3@,ABC0@.-&!
##d* AAj$)% AA)
"
A$%柱温为 #% e流动
相为G#乙腈$pG#%d%) AB.6VN4
$
;>
#
$ m!p/$流
速为 &d% AV6A@C%检测波长为 $!% CA进样量为
$%
"
V( 在该色谱条件下万古霉素的保留时间为
&%d) A@C(
""标准液的配制"精密称取 $d% AJ万古霉素标
准品于 )% AV棕色容量瓶中加水稀释至刻度配制
成 )#%
"
J6AV的质量浓度每次使用后于 # e下避
光保存(
""发酵液效价测定"精确量取万古霉素发酵液
&% AV置于 &%% AV试管中加乙醇定容至 &%% AV
在 (% e下浸泡 # :过滤外标法*!+测定滤液效价
#
"
J6AV$即万古霉素发酵液的效价 m滤液
效价j&%
""超滤液效价测定"按照外标法测定)计算超滤
液效价#
"
J6AV$(
D Q^?膜的清洗
""每批实验结束后要进行膜的清洗( 实际工业
生产中一般可连续运行 &$ k&! : 后再清洗不必
停机只要通过阀门切换到清洗模式即可进行循环
清洗( 清洗步骤如下"&$排出滤渣用清水洗去系
统残余的滤渣%$$将 QHC?,F公司的 QR%%&s清洗剂用
纯化水配成质量分数为 &i的清洗液在() k#% e)
%d$) ;`,下循环清洗 #) A@C 后排出清洗液%($用
纯化水洗至中性(
B?结果与讨论
B D^?超滤膜通量的影响因素考察
""超滤过程中操作压力)料液的温度以及固含
量是影响膜通量的主要因素为了使万古霉素发酵
液超滤过程中的膜通量达到最佳值实验组对影响
膜通量的主要因素"操作压力)料液的温度和料液
的固含量进行了实验考察(
$d&d&"操作压力对膜通量的影响
""取一定体积的发酵液用 W.?F,RD.B超滤设备进
!& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
行实验超滤过程中控制料液温度 &) e通过控
制不同的操作压力 %d$)%d()%d))%d* 和 %d ;`,
来测定操作压力对超滤膜通量的影响实验结果
见图 $(
图 B?膜通量随操作压力的变化关系
N.;=B?)/7630/:02729045F./; 940113402/G0GJ45/0763[
""从图 $ 可以看出"在低压阶段膜通量随着压
力的升高而增大达到某一值后膜通量又会呈现
逐渐衰减的趋势( 主要原因是"&$系统压力过大
导致膜被压实所致%$$浓差极化的影响膜表面出
现凝胶层并且固化( 考虑到生产中设备的震动)
料液不均匀的流动等都会对系统的压力造成影
响故 可 以 选 择 系 统 的 操 作 压 力 为 %d#) k
%d)% ;`,(
$d&d$"料液温度对膜通量的影响
""取一定体积的发酵液用 W.?F,RD.B超滤设备在
%d#) k%d)% ;`,下进行超滤实验通过控制不同的
料液温度 !d() &$d&) &$d!) &)d%) $%d*) $)d$ 和
(%d# e来测定不同的料液温度对超滤膜通量的影
响实验结果见图 ((
图 M?膜通量随料液温度的变化关系
N.;=M?)/7630/:027F0G9045F3402/G0GJ45/0763[
""从图 ( 可以看出"系统的膜通量随着料液温度
的升高而逐渐上升因此在不使万古霉素发生热降
解的前提下#万古霉素在 &! e以下稳定$尽可能
地提高超滤温度使系统的膜通量提高( 因此综合
考虑选定超滤的料液温度为 &) k& e(
$d&d("料液固含量对膜通量的影响
""取一定体积的发酵液用W.?F,RD.B超滤设备进行
超滤实验控制操作压力 %d#) k%d)% ;`,料液温
度 &) k& e随着清液的透过发酵液会逐渐被浓
缩其中固含量也会提高测定固含量#质量分数$
为 (%i)()i)#%i)#)i和 )%i的料液对超滤膜通
量的影响实验结果见图 #(
图 @?膜通量随料液固含量的变化关系
N.;=@?)/7630/:027126.I:2/F0/F2/G0GJ45/0763[
""从图 # 可以看出"系统的膜通量随着料液固含
量的升高膜通量逐渐减低当固含量达到 #%i以
后膜通量迅速减低( 主要原因是"&$浓差极化它
使膜面上的溶质局部浓度增加即边界层流体阻力
增加使传质推动力降低%$$膜孔的堵塞与阻塞使
膜通量降低(
B B^?料液固含量对操作时间的影响
""在保证万古霉素过滤收率相同的条件下料液
体积越小所需的清洗加水量就越小且体积越小
操作时间就越短但随着浓缩的进行固含量将增
大滤速会逐渐下降操作时间将大大延长*/+ ( 因
此需要找到最佳浓缩点即最佳料液固含量来保
证操作时间最短( 取一定体积的发酵液在操作压
力 %d#) k%d)% ;`,料液温度 &) k& e条件下用
W.?F,RD.B超滤设备进行超滤实验超滤过程中控制
料液固含量为 (%i)()i)#%i)#)i和 )%i来进行
水洗通过调节水洗量来保证过滤收率相同由此
来测定不同的料液固含量对操作时间的影响实验
结果见图 )(
""从图 ) 可以看出 在保证万古霉素收率一定的
情况下 即当发酵液固含量为()i k#%i时进行
/&"第 # 期 王"健等"超滤法提纯万古霉素的应用
图 P?操作时间随料液固含量的变化关系
N.;=P?)/7630/:027:2/F0/F27126.I2/29045F./; F.G0
加水实验可以保证操作时间最短( 因此确定超滤
过程中水洗前最佳料液固含量为 ()i k#%i(
B M^?顶洗加水量实验
""取一定体积的发酵液用 W.?F,RD.B超滤设备进
行实验超滤过程中控制料液温度为&) k& e操
作压力为 %d#) k%d)% ;`,当料液的固含量达到
()i k#%i时进行加水实验通过控制加水量为
发酵液投料量的 &d%)&d))$)$d) 和 ( 倍来测定不
同加水量对万古霉素过滤收率的影响实验结果
见图 *(
""从图 * 可以看出顶洗加水量达到发酵液投料
量的 $d) 倍体积时万古霉素的收率达到了 /)i
之后随着加水量的提高收率增加明显放缓( 综合
考虑确定合理的加水量倍数为发酵液体积的 $d)倍(
在工业生产中需根据料液的性质适当调整加水量(
图 Q?过滤收率随加水量的变化关系
N.;=Q?)/7630/:027L5F04O35/F.FA 2/7.6F04./; A.06I
B @^?膜的清洗恢复性
""当膜通量突然衰减较多过滤速度太慢时膜
由于吸附产生污染堵塞此时要进行膜的清洗为
了考察清洗后膜的恢复性能在中试车间开展了 *
批次的超滤实验前 ( 批的超滤膜采用已清洗好的
旧膜后 ( 批换用新膜( 操作条件为操作压力
%d#) k%d)% ;`,)料液温度 &) k& e加水前发酵
液固含量为 ()i k#%i顶洗加水量为发酵液投料
量的 $d) 倍体积( 超滤完毕后分别测定操作时间)
膜通量和过滤收率实验结果见表 &(
表 D?超滤实验结果
E5J60D?Y0136F12736F457.6F45F.2/0[904.G0/F1
检测项目 旧膜 %/%& 旧膜 %/%$ 旧膜 %/%( 新膜 %/%# 新膜 %/%) 新膜 %/%*
膜通量6#V!A=$!: =&$ &$&d$ &$*d$ &&/d) &$)d& &$%d# &&/d&
过滤收率6i /)d$ /#d) /#d! /)d& /)d# /#d%
操作时间6A@C &#! &)% &) &)# &)* &))
""从表 & 可以看出被污染的膜经清洗后与新膜
在操作时间)膜通量和过滤收率上没有明显差异
说明超滤膜的清洗恢复性能很强(
B=P?膜通量)滤液质量和过滤收率
""为了验证W.?F,RD.B超滤系统提纯不经预处理的
万古霉素发酵液的膜通量)超滤液质量和过滤收率
情况在中试车间进行了 ) 个批次的发酵液超滤实
验操作条件见表 $(
超滤完毕后分别测定膜通量)超滤液的透光度)
过滤收率及终产品的含量实验结果见表 (( 由表 (
可以看出"W.?F,RD.B超滤系统运行稳定正常平均膜通
量可达&$% V6#A$!:$%超滤液的平均透光度较传统
工艺的 )&d(i#生产车间提供数据$提高到 *d(i
提高幅度为 $)i( 平均过滤收率较传统工艺的
!d%i#生产车间提供数据$提高到 /#i( 随着滤液
质量的提高终产品#盐酸万古霉素$的含量也相应
得到了一定幅度的提高较传统工艺的 /%d%i#生产
车间提供数据$提高到 /#d)i提高幅度为 #d)i(
%$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 B?万古霉素发酵液的超滤操作条件
E5J60B?6F4576.F45F.2/:2/I.F.2/127Z5/:2GA:./704G0/F5F.2/J42F-
中试批次 平均温度6
e
平均操作压力6
;`,
料液固含量6
i
顶洗加水量6
倍
投料体积6
V
操作时间6
A@C
14
& &*d)& %d#! () $d) &)% $#( (d%
$ &)d/* %d#! () $d) &)% $#* (d$
( &*d() %d#/ #% $d) &)% $(! $d/
# &*d%% %d)% #% $d) &)% $(( (d$
) &*d!# %d)% () $d) &)% $#% (d&
平均值 &*d(( %d#/ ( $d) &)% $#% (d&
表 M?超滤实验结果
E5J60M?Y0136F12736F457.6F45F.2/0[904.G0/F1
中试批次 膜通量6#V!A=$!: =&$ 过滤收率6i 超滤液透光度6i I#产品$6i
& &&!d& /#d! *d) /#d)
$ &$%d# /(d$ )d/ /#d$
( &&/d& /(d *d) /#d!
# &$&d* /#d( *d% /#d%
) &$%d! /#d% *d* /)d%
平均值 &$%d% /#d% *d( /#d)
M?结?论
""采用W.?F,RD.B超滤系统过滤万古霉素发酵液
与传统工艺#板框加压过滤$相比简化了操作工艺
流程提高了滤液质量)过滤收率以及终产品含量
降低了生产成本( 万古霉素的收率由传统工艺#板
框加压过滤$的 !i提高到 /#i滤液的透光度比
传统工艺提高了 $)i系统平均膜通量可达
&$% V6#A
$
!:$且W.?F,RD&B超滤系统具有很强的清
洗恢复能力膜介质可重复使用( 本研究证明"超
滤系统完全能代替传统过滤工艺过滤时无需添加
助滤剂)絮凝剂既节省了成本减少了环境污染
又增加了附加收益(
参考文献"
*&+" I`-BFA@Ih `4Q?,Fh [ `;@?ECJEFOTE?,.2b,CIBAKI@C,
CEZ,C?@8@B?@I2M"I:EA@I,.,CG 8@B.BJ@I,.1FB1EF?@E0*]+25C?@8@B?
5CCH&/))R&/)*("*%&R*&&2
*$+"陈代杰2抗菌药物与细菌耐药性* +`2上海"华东理工大学出
版社$%%&"&(&2
*(+"李太生盛瑞媛2万古霉素治疗重症 Ol球菌感染的有效性和
安全性*]+2中国新药杂志$%%&&%#!$"*&)R*&2
V@f,@0:ECJQ:ECJaH@KH,C25I.@C@I,.0?HGKBD?:EED@I,IK,CG
0,DE?KBD\,CIBAKI@C @C ?FE,?AEC?BDJF,AR1B0@?@\E8,I?EF@,.@CDEIR
?@BC0*]+2-:@C,]BHFC,.BD+EZ3FHJ0$%%&&%#!$"*&)R*&2
*#+"陈代杰李继安邹韵华等2万古霉素的研究开发*]+2中国抗
生素杂志$%%#$/#&$"!R&%2
-:EC 3,@_@EV@]@g,CPBH LHC:H,E?,.2;FBIE00GE\E.B1AEC?BD
\,CIBAKI@C*]+2-:@CE0E]BHFC,.BD5C?@8@B?@I0$%%#$/#&$"!R&%2
*)+"邬行彦熊宗贵胡章助2抗生素生产工艺学* +`2北京"化学
工业出版社&//#"(((R(()2
**+"张玉忠2液体分离膜技术及应用* +`2北京"化学工业出版社
$%%#"&$*R&)!2
*+"李秀芬休学起2膜分离技术在抗生素提炼过程中的应用*]+2
膜科学与技术$%%&$&#*$"#&R#!2
V@S@HDECS@H SHEX@2511.@I,?@BC BDAEA8F,CE0E1,F,?@BC @C E^R
?F,I?@BC 1FBIE00E0DBF,C?@8@B?@I0*]+2` EA8F,CEQI@ECIE,CG fEI:R
CB.BJK$%%&$&#*$"#&R#!2
*!+"汪葆浚高华寿2分析化学* +`2北京"高等教育出版社&//)"
#%/R#&%2
*/+"TF@h00BC ;2+,CBD@.?F,?@BC E^?ECG0?:EF,CJEBDAEA8F,CED@.?F,?@BC
*]+2TC\@F;FBJ&/!!#&$")!R*$2
&$"第 # 期 王"健等"超滤法提纯万古霉素的应用