全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (4): 424–431, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00424
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收稿日期: 2013-11-22; 接受日期: 2014-03-31
基金项目: 广东省科技计划(No.2010A020507001)
* 通讯作者。E-mail: li_haihang@yahoo.com
化橘红果实生长发育过程中类黄酮的动态变化
韩寒冰1, 2, 李海航2*, 曾祥有3, 赵俊生3
1广东石油化工学院化学与生命科学学院, 茂名 525000
2华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州 510631
3茂名市水果科学研究所, 茂名 525000
摘要 该研究建立了化橘红(Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’)果实中4种类黄酮成分的提取分离、HPLC定量和指纹图谱分析
方法, 利用该方法测定了果实生长发育过程中类黄酮的动态变化。结果表明, 用60%乙醇超声辅助提取果实干燥粉末2小时,
柚皮苷提取率达到98%以上。用HPLC分离和测定提取物中柚皮苷、野漆树苷、柚皮素和芹菜素的含量及其指纹图谱。结
果显示, 15–60天不同果龄的果实中类黄酮含量(占果实干重)随着果龄的增大而降低, 柚皮苷、野漆树苷、柚皮素和芹菜素
分别从52.5%、0.74%、0.57%和0.23%降低至16.1%、0.11%、0.06%和0.03%; 每果中类黄酮总量则随着果龄的增加而大
幅提高, 从15天的0.55 g提高至60天的7.99 g。上述研究结果表明, 果龄对化橘红类黄酮含量、产量及药材质量均有很大的
影响。该研究为化橘红的工业生产和质量监控提供了重要依据。
关键词 化橘红, 柚皮苷, 柚皮素, 野漆树苷, 芹菜素
韩寒冰, 李海航, 曾祥有, 赵俊生 (2014). 化橘红果实生长发育过程中类黄酮的动态变化. 植物学报 49, 424–431.
化橘红为芸香科植物化州柚(Citrus grandis cv.
‘Tomentosa’)(又名化橘红)的未成熟或近成熟的干燥
外层果皮, 临床用于治疗风寒咳嗽和喉痒痰多等症
(陈志霞等, 2003; 袁旭江和林励, 2003; 国家药典委
员会, 2010)。化橘红胎是化橘红未成熟的干燥全果,
为化痰镇咳常用中药。有研究表明, 化橘红的类黄酮
含量为16%–50%(林励等, 2010; Han et al., 2014),
其中柚皮苷(naringin)和野漆树苷(rhoifolin)(二者占类
黄酮总量的84%以上 )为其主要成分 (刘晓涵等 ,
2010)。柚皮苷和野漆树苷水解后可分别形成苷元柚
皮素和芹菜素。化橘红胎中同时含有柚皮素(naring-
enin)和芹菜素(apigenin)等类黄酮, 具有抗氧化、清
除自由基、抗突变、抗肿瘤和抑菌等作用(刘安成等,
2011; 邓少东等, 2012)。邓少东等(2012)研究表明,
绝大多数黄酮苷口服后可转变成相应的黄酮苷元被
吸收, 大部分黄酮苷元的抗氧化活性较黄酮苷强。目
前, 关于化橘红总黄酮和柚皮苷的研究较多, 但结果
差异较大, 其原因主要是样品的采收期不一致。袁旭
江等(2003)研究表明, 化橘红果实的类黄酮和柚皮苷
含量随着果龄的增大而急剧递减, 但只局限于总黄酮
和柚皮苷。本研究以化橘红的一个品系假西洋为研究
对象, 同时研究4种主要类黄酮成分在不同生长发育
时期的动态变化, 了解其变化规律, 以期为化橘红的
工业生产、质量控制和抗氧化活性研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
2013年1月13日, 在化州市平定镇马力村, 选定5株
树龄10年以上已开花的化橘红(Citrus grandis cv.
‘Tomentosa’)品系假西洋。每隔5天每株选择标记20
朵开放的小花, 60天后(2013年3月15日), 分株分批
次采集生长一致的10个样品, 测量鲜果直径和重量,
烘干测定干重, 经粉碎和过40目筛得到小于40目(或
≤380 μm)的粉末用于提取。
柚皮苷标准品(No.110722-200810)由中国药品
生物制品检定所提供, 柚皮素(No.120824)、野漆树
苷(No.120711)和芹菜素(No.120906)均由四川省维
克奇生物科技有限公司提供。以上标准品纯度均≥
98%。HPLC用甲醇为色谱级 , 购自美国的Fisher
·研究报告·
韩寒冰等: 化橘红果实生长发育过程中类黄酮的动态变化 425
Scientific公司。其它试剂均为分析纯。
HPLC色谱仪SPD-20A、LC-20AT UV检测器和
UV-2550紫外-可见光分光光度计购自日本岛津公司。
DL-6000低速冷冻大容量离心机购自上海安亭科学
仪器厂。KQ5200B超声波清洗器购自江苏省昆仑山
市超声仪器有限公司。XY-FD-8L冷冻干燥机购自上
海欣谕仪器有限公司。
1.2 HPLC检测条件
测定波长的选择: 分别配制一定浓度的柚皮苷、野漆
树苷、柚皮素和芹菜素标准品溶液, 另取化橘红果实
溶液适量, 分别测定各溶液在210–750 nm处的吸收
光谱。根据标准品和样品提取液的吸收峰值, 确定柚
皮苷和柚皮素的检测波长为283 nm, 野漆树苷和芹
菜素的检测波长为340 nm。
指纹图谱和类黄酮分析: 样品的指纹图谱和样品
中4种类黄酮化合物的定性与定量分析使用SPD-20A
HPLC(日本岛津公司)。检测条件: 分离柱为Thermo
ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 流动相A为纯
甲醇, B为1%冰醋酸水溶液, 梯度洗脱(0–10分钟,
35%A; 10–30分钟 , 35%A–65%A; 30–35分钟 ,
65%A; 35–42分钟 , 65%A–35%A); 流速为每分钟
1.0 mL; 柱温40°C; 进样量10 μL; LC-20AT UV检测
器, 柚皮苷和柚皮素在283 nm处检测, 野漆树苷和
芹菜素在340 nm处检测; 在325 nm处进行指纹图谱
测定。样品中的目标成分根据HPLC的保留时间、样
品与标准品的相加实验进行定性鉴定, 用峰面积法进
行定量分析, 根据各化合物的定量标准曲线计算。
定量标准曲线的制作如下: 精密称取柚皮苷、野
漆树苷、柚皮素和芹菜素标准品适量, 置于10 mL容量
瓶中, 加甲醇溶解定容至刻度, 制成1 mg·mL–1的标准
品混合溶液, 用60%乙醇将柚皮苷溶液稀释成50、
100、150、200、250 μg·mL–1的系列浓度, 将野漆树
苷、柚皮素和芹菜素溶液稀释成2.5、5.0、7.5、10.0、
12.5 μg·mL–1的系列浓度, 再进行HPLC检测。柚皮苷
和柚皮素的检测波长为283 nm, 野漆树苷和芹菜素的
检测波长为340 nm。以各化合物的浓度为横坐标, 峰
面积为纵坐标, 绘制各自的定量标准曲线。
1.3 样品的提取
提取溶剂和提取时间的筛选: 称取1 g样品粉末, 加
10 mL不同乙醇浓度的提取溶剂, 在30°C水浴中超声
提取不同时间; 以柚皮苷提取率为标准, 检测不同乙
醇浓度和不同提取时间的提取效率, 从而确定最佳提
取溶剂和提取时间。
样品的提取: 分别称取0.25 g样品粉末, 置于25
mL提取管中, 加入60%乙醇溶液25 mL, 充分摇匀,
30°C超声水浴2小时, 7 500×g低温离心10分钟, 以
上清液作为供试品溶液。
所有样品分析重复3次。取3次重复的平均值作为
检测结果, 计算标准差。
2 结果与讨论
2.1 不同果龄果实的性状指标
不同果龄化橘红果实的直径、鲜重和干重测定结果见
表1。从表1可以看出, 果实的直径和鲜重是关联果龄
的最直接指标, 因此, 按直径和鲜重是分级采收过程
中最直观和最实用的方法。在分析果实中各种类黄酮
百分含量的基础上, 通过果实干重计算各生长阶段单
果中各种类黄酮的总量, 能达到全面评价化橘红质量
和产量之间关系的目的。
2.2 样品提取与分析
2.2.1 提取溶剂和提取时间
分别用不同乙醇浓度的溶剂(体积为材料干重的10倍)
浸泡提取化橘红果实材料1小时, HPLC检测各提取液
中的柚皮苷含量, 结果如图1A所示。从图1A可以看
出, 60%乙醇提取液的提取率最高。用60%乙醇分别
浸泡提取不同时间, 显示在2小时内, 随浸泡时间的
增加, 提取率有所增加, 2小时后溶液中柚皮苷含量
基本达到最高, 继续延长浸泡时间, 提取率不再增加
(图1B)。因此, 可以确定的提取条件是60%乙醇提取
液浸泡提取2小时, 在此条件下柚皮苷的提取率可达
98%以上。

2.2.2 样品的HPLC分离与检测条件的确定
图2显示了4种类黄酮化合物的标准品和化橘红果实
样品的紫外吸收光谱。从图2可以看出, 柚皮素的2个
吸收峰分别为291和330 nm(图2A1), 柚皮苷的2个吸
收峰分别为283和330 nm(图2A2); 二者在283 nm处
的吸收均较强, 故选择此波长同时检测柚皮素和柚皮
426 植物学报 49(4) 2014
表1 不同果龄化橘红果实的直径、鲜重和干重(平均值±SE, n=5)
Table 1 Fruit diameter, fresh weight and dry weight of Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’ at different fruit-age (means±SE, n=5)
Fruit-age (d) Diameter (cm) Fresh weight (g·fruit–1) Dry weight (g·fruit–1)
15 1.65±0.03 3.05±0.08 1.01±0.02
20 2.10±0.05 5.60±0.12 1.50±0.04
25 2.51±0.06 7.71±0.14 2.10±0.05
30 3.09±0.06 13.79±0.22 3.51±0.08
35 4.02±0.11 28.76±0.71 6.60±0.13
40 4.96±0.13 50.02±1.04 10.85±0.22
45 6.02±0.16 85.69±2.12 18.15±0.45
50 7.02±0.18 132.61±3.35 28.08±0.68
55 7.91±0.19 186.31±4.89 39.00±0.91
60 8.65±0.22 243.12±6.32 49.02±1.25




图1 乙醇浓度(A)和提取时间(B)对化橘红果实中类黄酮提取
的影响

Figure 1 Effects of ethanol concentration (A) and extraction
time (B) on flavonoids extraction in fruit of Citrus grandis cv.
‘Tomentosa’


苷。芹菜素与野漆树苷在283 nm附近的吸收均较弱,
它们的主吸收峰在340 nm处, 次峰在265 nm处(图
2B1, B2), 故选择340 nm同时检测芹菜素与野漆树
苷。因样品中的类黄酮成分主要为柚皮苷, 故样品的
吸收光谱与柚皮苷标准品相似(图2C)。此外, 图2C显
示标准品和样品在325 nm处均有紫外吸收 , 故可
用此波长对样品中的类黄酮化合物进行指纹图谱分
析。
通过对系列的HPLC分离和分析条件研究, 获得
了同时分离和检测4种类黄酮化合物的最适条件。在
此条件下, 4种类黄酮化合物可获得良好的分离和定
量分析(图3)。图3A显示, 在283 nm处检测到1个柚皮
苷优势峰和其余3种类黄酮的峰, 柚皮素的峰虽小,
但峰形对称性好, 与相邻峰彼此分离, 故可用此波长
来检测柚皮苷和柚皮素。而在340 nm条件下, 标准品
和样品中野漆树苷和芹菜素的紫外吸收峰均明显增
大, 故在此波长下可同时检测野漆树苷和芹菜素(图
3B)。

2.2.3 定量标准曲线
分别以4种标准品的浓度为横坐标, 峰面积(A)为纵坐
标绘制定量标准曲线并建立回归方程。得到柚皮苷的
回归方程为: A=18 669x–9 844.8, R2=0.999 7, 线性
范围为50–250 μg·mL–1; 野漆树苷的回归方程为 :
A=1 258.8x–64.679, R2=0.999 6, 线性范围为2.5–
12.5 μg·mL–1; 柚皮素的回归方程为: A=3 289.4x–
85.036, R2=0.999 3, 线性范围为2.5–12.5 μg·mL–1;
芹菜素的回归方程为 : A=3 257.8x–831.33, R2=
0.999 5, 线性范围为2.5–12.5 μg·mL–1。

2.2.4 精密度分析
用标准品混合溶液连续进样5次, 在283 nm波长处检
测柚皮苷和柚皮素, 在340 nm波长处检测野漆树苷
韩寒冰等: 化橘红果实生长发育过程中类黄酮的动态变化 427

图2 类黄酮标准品和样品提取液的紫外吸收光谱
(A1) 柚皮素; (A2) 柚皮苷; (B1) 芹菜素; (B2) 野漆树苷; (C) 化橘红果实提取液

Figure 2 UV absorption spectra of standard flavonoids and sample extracts
(A1) Naringenin; (A2) Naringin; (B1) Apigenin; (B2) Rhoifolin; (C) Ethanol extract from Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’


和芹菜素, 计算各自峰面积的RSD值。多次重复的误
差均介于1.2%–1.6%之间, 说明仪器分析和进样精
密度良好。

2.2.5 重复性检测
取5份提取液样品, 用HPLC检测各样品中的4种化合
物(柚皮苷、柚皮素、野漆树苷和芹菜素), 根据峰面
积计算RSD值。柚皮苷、柚皮素、野漆树苷和芹菜素
的RSD值分别为1.53%、2.27%、1.22%和2.62%, 表
明样品分析的重复性良好。

2.2.6 样品的稳定性分析
将样品提取液在室温下分别放置0、2、4、6和8小时
后, 用HPLC测定其中4种类黄酮化合物, 分别计算其
峰面积的RSD值。RSD值均小于1%, 说明样品提取
液在8小时内稳定。

2.2.7 加标回收率测定
取30天果龄的样品粉末0.25 g分别加入标准品柚皮
苷100 mg, 柚皮素、野漆树苷和芹菜素各10 mg, 按
照2.2.1节所述的方法制备提取液, 用HPLC测定各化
合物的回收率。柚皮苷、柚皮素、野漆树苷和芹菜素
的加标回收率分别为99.1%、102.2%、101.5%和
98.5% (n=3)。
2.3 不同果龄类黄酮化合物的指纹图谱
图4为15–60天果龄的化橘红果实提取液的HPLC指
纹图谱(检测波长为325 nm)。从图4可以看出, 随着
果龄的增加, 柚皮苷含量迅速降低(图4A), 野漆树
苷、柚皮素和芹菜素的含量也逐渐下降(图4B)。检测
428 植物学报 49(4) 2014

图3 类黄酮标准品和样品在283 nm (A)和340 nm (B)处的HPLC色谱图

Figure 3 HPLC chromatograms of standard flavonoids and sample extracts detected at 283 nm (A) and 340 nm (B)


到的绝大部分化合物含量均随着果龄的增加呈降低
趋势, 这可能是由于次生代谢产物的合成跟不上果实
生长和干物质积累速度所致。
2.4 不同果龄类黄酮化合物的含量变化
化橘红从盛花期后的15天开始至60天, 每隔5天检测
各样品中4种类黄酮化合物的含量, 结果见表2。以果
实干重为基础计算, 柚皮苷、野漆树苷、柚皮素和芹
菜素的含量均随着果龄的增加而减少。4种类黄酮化
合物中, 柚皮苷含量最高, 远高于其它3种类黄酮。
20天幼果的柚皮苷含量占干重的50%以上, 到60天
果龄时, 柚皮苷的百分含量也超过16%。4种类黄酮
化合物中, 芹菜素的含量最低, 在幼果中最高含量仅
为0.2%。用4种类黄酮化合物含量的总和代表总黄酮
含量, 从表2可以看出总黄酮含量的变化趋势与柚皮
苷一致。
类黄酮化合物含量是化橘红质量控制的重要指
标。低果龄时类黄酮含量高, 质量好, 但果实小, 干
物质少, 产量低。要实现质量和产量双赢, 必需平衡
类黄酮化合物的百分含量与单果中类黄酮化合物的
总量。不同果龄中单果类黄酮化合物的含量变化见图
5。从图5可以看出, 单果中的芹菜素含量最低, 果龄
35天每果不足10 mg, 45天后基本不再增加, 稳定在
每果16 mg的水平; 单果中的柚皮素在45天后的增加
速率渐趋缓慢, 野漆树苷、柚皮苷和总黄酮的增长趋
势基本一致, 前30天内增长缓慢, 30天后开始快速增
长, 60天它们的总量分别达到每果54.4、7 887和7 990
mg。从图5中单果类黄酮化合物的变化趋势可以看出,
单果类黄酮化合物总量随着果龄的增大还会继续增
加, 但类黄酮化合物占果实干重的百分含量急剧下降,
从而使产品质量和药用价值降低。因此, 要辩证地考
虑类黄酮的百分含量和单果中的总量, 在保证质量的
基础上, 尽可能地提高产量。目前, 果农一般在果龄55
天、鲜果直径约8 cm时采收, 此时单果中总黄酮的含
量为17.8%, 类黄酮的总质量为6.9 g。该时期采收, 既
能保证产品的质量, 又能获得较高的产量。
韩寒冰等: 化橘红果实生长发育过程中类黄酮的动态变化 429


图4 不同果龄化橘红果实中类黄酮化合物的指纹图谱(B图为A图的放大)

Figure 4 HPLC fingerprints of fruit extracts from Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’ at different fruit-age (Figure B is enlarged from
Figure A)



表2 不同果龄化橘红果实中类黄酮化合物的含量变化(平均值±SE, n=5 )
Table 2 Flavonoid contents in the fruits of Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’ at different fruit-age (means±SE, n=5)
Fruit-age (d) Naringin (mg·g–1) Rhoifolin (mg·g–1) Naringenin (mg·g–1) Apigenin (mg·g–1) Total flavonoids (mg·g–1)
15 525.1±8.8 7.35±0.13 5.71±0.12 2.31±0.06 540.5±15.6
20 511.2±9.0 6.33±0.10 5.24±0.11 1.98±0.06 524.8±12.1
25 482.8±6.9 5.48±0.10 4.35±0.10 1.91±0.05 495.5±9.5
30 444.5±8.5 4.12±0.09 3.15±0.08 1.62±0.04 453.4±8.9
35 402.9±9.5 3.36±0.05 2.06±0.05 1.38±0.03 409.7±9.2
40 347.4±5.0 2.36±0.05 1.59±0.03 1.01±0.03 352.4±7.5
45 276.3±4.8 2.19±0.04 1.25±0.03 0.81±0.02 280.6±6.4
50 206.9±3.6 1.51±0.03 0.98±0.01 0.57±0.02 210.0±5.3
55 175.6±3.5 1.24±0.03 0.77±0.01 0.42±0.01 178.0±5.3
60 160.9±2.4 1.11±0.04 0.65±0.01 0.34±0.01 163.0±4.5

430 植物学报 49(4) 2014


图5 不同果龄化橘红单果类黄酮化合物含量的动态变化
(A) 柚皮苷和总黄酮; (B) 野漆树苷、柚皮素和芹菜素

Figure 5 Dynamic changes of flavonoids contents per fruit
in different age fruits of Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’
(A) Naringin and total flavonoids; (B) Rhoifolin, naringenin
and apigenin

2.5 讨论
2010年版药典一部规定中药化橘红中的柚皮苷含量
不少于3.5%。事实上, 地道化橘红中的柚皮苷含量均
远远超过规定的标准。林励等(2010)的研究表明化橘
红中的野漆树苷含量为0.62%–0.88%, 而光橘红中
的野漆树苷含量仅为化橘红的1/10左右。野漆树苷含
量及其特征性指纹图谱是判断化橘红真假和质量高
低的有效方法。柚皮素和芹菜素分别是柚皮苷和野漆
树苷的苷元, 苷元及其相应的苷含量均随着果龄的增
加而减少。植物经过次生代谢形成稳定的柚皮苷贮存
起来, 幼果期的柚皮苷含量可超过干物质的50%, 但
它的苷元柚皮素含量始终保持在较低水平。在4种类
黄酮化合物中, 芹菜素的含量最低。柚皮素和芹菜素
含量尽管比柚皮苷低得多, 但由于比柚皮苷容易被肌
体吸收和具有更强的生理活性, 备受人们的关注。
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韩寒冰等: 化橘红果实生长发育过程中类黄酮的动态变化 431
Dynamic Changes in Flavonoid Content During Fruit Growth and
Development of Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’
Hanbing Han1, 2, Haihang Li 2*, Xiangyou Zeng3, Junsheng Zhao3
1College of Chemistry and Life Sciences, Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming 525000, China
2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China
Normal University, Guangzhou 510631, China; 3Fruit Institute of Maoming City, Maoming 525000, China
Abstract Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’ is an important traditional Chinese medicine agent; naringin and other flavon-
oids are the main functional and quality control compounds. We established methods for extraction, high-performance
liquid chromatography (HPLC) quantitative and fingerprint analyses of flavonoid content of C. grandis cv. ‘Tomentosa’
and analyzed dynamic changes in content during fruit growth and development. The powder from fruit was extracted with
60% ethanol for 2 h by ultrasound-assisted maceration extraction. The extraction of naringin reached ≥98%. Separation
and quantitative determination of flavoloids and fingerprint analysis of extracts by HPLC involved Thermo C18 columns
and a gradient eluent of 35% to 65% acidic methanol. Content of the 4 main flavonoids was analyzed every 5 days from
days 15 to 60. Total flavonoid content increased significantly with fruit age from 0.55 to 7.99 g·fruit–1. However, on a fruit
dry-weight basis, content of flavonoid decreased significantly with fruit age and that of naringin from 52.5% to 16.1%,
rhoifolin from 0.74% to 0.11%, naringenin from 0.57% to 0.06%, and apigenin from 0.23% to 0.03%. Fruit age had a great
impact on fruit flavonoid content, yield and quality of medicinal material from fruit. We provide important information for
industrial production and quality control of C. grandis cv. ‘Tomentosa’.
Key words Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’, naringin, naringenin, rhoifolin, apigenin
Han HB, Li HH, Zeng XY, Zhao JS (2014). Dynamic changes in flavonoid content during fruit growth and development of
Citrus grandis cv. ‘Tomentosa’. Chin Bull Bot 49, 424–431.
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* Author for correspondence. E-mail: li_haihang@yahoo.com
(责任编辑: 孙冬花)