全 文 ：第 26 卷第 12 期
2006 年 12 月
生 　　态 　　学 　　报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 26 ,No. 12
Dec. ,2006
互作对水稻白叶枯病菌 JXO Ⅲ和 JXOⅤ
超氧阴离子释放的调控
李　欣1 , 李红玉1 , 3 , 庞新跃1 , 冯汉青1 , 王金生2
(11 兰州大学生命科学学院 , 兰州　730000 ; 21 南京农业大学植物保护学系农业部病虫监测与治理重点实验室 , 南京　210095)
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (36070070 ,30170238)
收稿日期 :2005209228 ;修订日期 :2006204212
作者简介 :李欣 (1979～) ,女 ,河北邯郸人 ,博士生 ,主要从事植物2病原菌相互作用研究. E2mail :lixin2004 @st . lzu. edu. cn3 通讯作者 Corresponding author. E-mail :lihy @lzu. edu. cn
Foundation item :The project was financially supported by National Natural Science Fundation of China (No. 36070070 ,30170238)
Received date :2005209228 ;Accepted date :2006204212
Biography :LI Xin , Ph. D. candidate , mainly engaged in the interaction between plant and pathogen. E2mail : lixin2004 @st . lzu. edu. cn
摘要 :水稻白叶枯病菌能够引起水稻的白叶枯病等一系列水稻病害。水稻白叶枯病菌 JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ细胞中超氧阴离子的释
放水平存在显著的差异 ,并进一步显示在两者亚细胞组分的超氧阴离子释放水平上。这种差异暗示致病性不同的病原菌中 ,
O -2 可能具有信号传导及毒性因子的不同作用。亲和性不同的植物2病原菌互作过程对病原菌 JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ的超氧阴离子释
放具有不同的调控作用。对自身 O -2 水平很低的 JXO Ⅲ来说 ,亲和互作和非亲和互作过程都可诱导 JXO Ⅲ中 O -2 的释放 ;然而
在自身 O -2 水平较高的 JXO Ⅴ中 ,则随亲和性不同而表现出诱导或抑制的不同调控作用。无论是在 JXO Ⅲ还是在 JXO Ⅴ中 ,互
作后分离得到的病原菌仍然能够显示出互作对其 O -2 释放的显著影响 ,这种调控作用很可能具有一定的遗传稳定性。虽然机
制还不清楚 ,但是推测这种调控可能和互作的走向相关。
关键词 :白叶枯病菌 ;致病性 ;超氧阴离子 ;电子自旋共振 ( ESR) ;互作
文章编号 :100020933(2006) 1224192206 　中图分类号 :S432. 1 　文献标识码 :A
Regulation on superoxide anion production in Xanthomonas oryzae pv. oryzae , JXO
Ⅲand JXO Ⅴby host2pathogen interaction
LI Xin1 , LI Hong2Yu1 , 3 , PANG Xin2Yue1 , FENG Han2Qing1 , WANGJin2Sheng2 　(11School of Life Sciences , Lanzhou University ,
Lanzhou 730000 , China ; 21 Key Laboratory of Monitoring and Management of Plant Diseases and Pests , Ministry of Agriculture , Department of Plant Protection ,
Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China) . Acta Ecologica Sinica ,2006 ,26( 12) :4192～4197.
Abstract : Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( Xoo) causes bacterial leaf blight , a serious disease of rice. With electron spin
resonance , we found that the superoxide anion productions in JXOⅢand JXOV , two Xoo strains , were distinct from each other ,
and this difference was also observed in their subcellular fractions. It implies that the superoxide anion likely plays different roles ,
such as signaling molecule or virulence factor , in strains with various pathogenicities. Strikingly , interactions between rice and
JXOⅢ or JXO Ⅴ also had different impacts on the superoxide anion production by bacteria. For JXO Ⅲ, superoxide anion
production was intensely increased by either compatible or incompatible interactions with plants. But for JXOⅤ, the original high
superoxide anion production was further enhanced by the compatible interaction while depressed by the incompatible interactions
with plants. Furthermore , these impacts were maintained in both JXOⅢand JXO Ⅴcells separated from plants correspondingly
treated with each of them , which indicated the transmissibility of the effects on bacteria by interaction between plant and pathogen.
It elucidates that the regulation of superoxide anion depends on the compatibility between plant and pathogens. However , the
pathological mechanisms remain unclear.
Key words : Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( Xoo) ; pathogenicity ; superoxide anion (O -2 ) ; electron spin resonance ( ESR) ;
interaction
　　病原侵染植物后 ,互作体系中快速、短暂、大量的活性氧产生称为氧化爆发 (Oxidative burst) [1～3 ] 。超氧阴
离子的产生和释放是氧化爆发中的活性氧的主体之一[4 ] 。动植物与病原互作过程中都发现 ,不仅寄主能够释
放超氧阴离子 ,病原中也能够有大量超氧阴离子产生[5～7 ] ,这些超氧阴离子不仅对病原菌自身细胞具有重要
的生理学功能[7～11 ] ,在互作过程中也具有重要的作用[12 ] 。
在植物病原真菌灰葡萄胞病菌中和动物病原细菌肠球菌中已发现超氧阴离子释放相关调控基因的表达
以及细胞中的超氧阴离子水平均对病原菌的致病性有显著的影响 ,超氧阴离子的释放与菌株的致病性密切相
关[3 , 6 ] 。之前作者报道了在许多植物病原细菌株系中具有自身释放超氧阴离子的现象 ,其释放规律与菌株的
致病性可能存在一定的关系[13 , 14 ] 。为进一步了解植物病原细菌超氧阴离子释放、调控的机制与这些超氧阴
离子释放与互作进程、菌株致病性的联系 ,作者以黄单胞菌属两个典型的、同一小种但是致病性不同的菌株2
水稻白叶枯病菌日本小种菌株 JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ为对象 ,对上述疑问进行了探讨。
1 　材料与方法
111 　药品
Tiron (1 , 22dihydroxybenzene23 , 52disulfonic acid) 购自 Sigma 公司。对氨基苯磺酸、α2奈胺、盐酸羟胺购于上
海 Sangon 公司。
112 　水稻品系和菌株
水稻品种采用圣稻 301 和豫粳 6 号 ,购自河南省洛阳市农业科学研究所。
黄单胞菌属水稻白叶枯病菌 ( Xanthomonas oryzae pv. oryzae)日本系统菌株 JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ,由南京农业大
学植物保护学系农业部病虫监测与治理重点实验室提供。
采用 NA 培养基 (pH 710) :蔗糖 10gΠL ,蛋白胨 5gΠL ,酵母粉 1gΠL ,牛肉浸膏 3gΠL ,琼脂 16gΠL。将上述菌株
接种于 NA 液体培养基中 , 28 ℃振荡培养至菌液混浊 ,备用。
113 超氧阴离子检测
(1)羟胺氧化法 :按照 Schneider K. 等的羟胺氧化法进行样品中超氧阴离子浓度的测定[15 ] 。
(2)电子自旋共振法 ( ESR) [16 , 17 ] :检测时将各菌株的菌悬液稀释至相同浓度 ,严格意义上比较样品的超氧
阴离子水平。ESR 检测时均将培养 36h 的对数期菌悬液稀释至 109 cfuΠml ,检测样品中的超氧阴离子信号。
以 Tiron 为超氧阴离子的特异性捕捉剂 ,将 Tiron 加入样品溶液中 ,使捕捉剂终浓度为 10mmolΠL ,混匀 ,立
即吸入一端封闭的玻璃毛细管中 ,5 min 时放入德国 Bruker ER2200D 型 ESR 波谱仪的样品腔中检测超氧阴离
子信号。
测试条件 :微波频率 ,9145GHz ; 微波功率 ,10mW ; 调制频率 ,100kHz ; 调制 ,1Gpp ; 增益 ,5 ×105 ; 时间响
应 ,015S ; 中心磁场 ,3380G; 扫场宽度 ,200G。
114 　分级分离制备各细胞组分
菌悬液培养至对数期 36h ,同时分级分离 JXO Ⅲ、JXO Ⅴ两个菌株的各亚细胞组分。对数期菌悬液低速离
心 (3300 g , 10 min)得到菌体细胞 ,为了排除培养基的干扰 ,用等体积无菌水重悬 ,得到菌悬液样品。取出 1Π10
体积水悬菌液用 0122μm 微孔滤膜过滤 ,得到滤液组分[13 ] ;余下菌悬液用石英砂破碎细胞 ,离心除去未破碎的
细胞。上清离心 (25000 g , 20 min)得到细胞壁组分的沉淀[18 ] ,上清备用。细胞壁沉淀用上清等体积水重悬得
到细胞壁样品 ;上清超速离心 (103000 g , 30 min)得到细胞膜组分沉淀[19 ] ,用等体积水重悬细胞膜样品。重复
3 次以上分级分离制备各组分 ,用 ESR 法同时检测各组分中的超氧阴离子信号。
115 　与寄主植物互作对病原菌自身超氧阴离子水平的影响
(1)将上述菌株 JXO Ⅲ及 JXO Ⅴ的 109 cfu. ml - 1菌液用剪叶法侵染圣稻 301 及豫粳 6 号水稻三叶期幼苗 ,约
4d 后开始发病。取回接种叶片 ,分离病原菌。同时将未互作处理的菌种在琼胶平板上划线培养 ,以作对照。
391412 期 李欣 　等 :互作对水稻白叶枯病菌 JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ超氧阴离子释放的调控 　
(2)分别挑取对照菌株及互作处理后分离出的菌株的单菌落 ,液体培养至 36h。
(3)比较对照菌株与互作处理后菌株细胞中的超氧阴离子水平。
116 　统计学分析
用 Spss 进行统计学分析。
2 　实验结果
211 　JXO Ⅲ及 JXO Ⅴ细胞中超氧阴离子水平比较
3 次重复的 ESR 检测具有稳定的结果 (图 1) ,在相同菌悬液浓度下 ,对它们 36h 菌悬液的 ESR 检测结果显
示二者信号强度差异极显著 ( p < 0101) :JXO Ⅴ菌悬液中的 O -2 信号很强 ,与此相反 ,JXO Ⅲ中没有检测到明显
的 O -2 信号。
图 1 　菌株 36h 菌悬液中超氧阴离子 ESR 信号
Fig. 1 　ESR signals of O -2 in suspensions 36h inoculated
对照是 Tiron 空白信号 Control is Tiron only
212 　JXO Ⅲ及 JXO Ⅴ各组分超氧阴离子释放活性比较
为了确定菌悬液中没有检测到 O -2 信号的菌株
JXO Ⅲ的亚细胞组分是否完全不具有 O -2 释放活性 ,以
及 JXO Ⅲ、JXO Ⅴ各组分的 O -2 释放活性是否与它们的
O -2 水平差异相关。检测 JXO Ⅲ、JXO Ⅴ的各亚细胞组分
中 O -2 释放活性。
图 2 　JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ各个组分超氧阴离子 ESR 信号比较
Fig. 2 　ESR signal intensity of O -2 in cellular fractions of JXO Ⅲand JXO Ⅴ
A : 空白 Tiron only ;B : 菌悬液 Bacterial suspension ;C : 滤液 Filtrate ; D :
细胞壁 Cell wall ; E : 细胞膜 Cytomembrane
21211 　羟胺氧化法检测 　结果显示 ,JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ的
细胞中 O -2 水平具有极显著的差异 ( p < 0101) 。JXO Ⅴ
细胞中具有较高的 O -2 水平 ( (27178181 ±51767327)
μmolΠL) ,分级分离后得到的各个组分中 ,滤液组分中的
O -2 释放能力最强 ( (18165512 ±41902672) μmolΠL) ,细胞
壁和细胞膜中检测到极微弱的 O -2 释放活性 (分别为 (01161959 ±01014823) μmolΠL 和 (01585577 ±01007411)
μmolΠL) 。JXO Ⅲ细胞中的 O -2 水平极低 ( (21742024 ±01252067)μmolΠL) ,同时滤液、细胞壁和细胞膜中也检测
到极微弱的 O -2 释放活性 (分别为 (61705591 ±11109642) μmolΠL , (0111137 ±01003098) μmolΠL 和 (01184861 ±
01006614)μmolΠL) 。以上结果说明 ,病原菌细胞中普遍存在细胞壁及细胞膜等多位点的O -2 释放活性。同时 ,
病原菌细胞 O -2 释放的主要位点可能是在胞外 ,菌株细胞中的 O -2 水平越高 ,滤液中的 O -2 释放活性越强。
21212 　ESR 法检测
与羟胺氧化法的结果一致 ,3 次 ESR 检测的统计学结果显示 (图 2) ,菌悬液中 O -2 水平极低的 JXO Ⅲ在滤
液中检测到微弱 ESR 信号。JXO Ⅴ滤液中检测到极显
著强于 JXO Ⅲ滤液组分的的 O -2 释放信号 ( p < 0101) ,
JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ的细胞膜和细胞壁样品中基本检测不到
O -2 的 ESR 信号 ,与作者之前在白叶枯病菌 OS214 中实
验结果相符[14 ] ,白叶枯病菌 JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ的 O -2 释放
很可能也是来源于滤液组分。白叶枯病菌甚至病原菌
细胞中 O -2 释放的主要位点可能普遍是在胞外。
213 　互作对病原菌超氧阴离子释放的调控
21311 　互作对 JXO Ⅲ超氧阴离子释放的影响 　水稻品
种豫粳 6 号接种白叶枯病菌 JXO Ⅲ后 ,接种切口出现黄
色细条状斑 ,有个别叶片出现黄褐色斑点 ,表现为非亲
和互作 ;而 JXO Ⅲ接种于水稻圣稻 301 后 ,大部分水稻
叶片出现黄褐色病斑 ,且有扩大的趋势 ,表现为亲和互
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作。病原菌接种后 4d 开始出现病斑 ,6d 后病斑范围已经较大 ,选病斑较大的叶片开始分离病原菌。
JXO Ⅲ与圣稻 301 互作 6d 后分离菌株 ,涂平板培养 48h 开始有白叶枯病菌菌落出现 ,48h 至 96h 之间选单
菌落培养 ,得到的菌株记为“JXO Ⅲ2301”;JXO Ⅲ与水稻豫粳 6 号互作 6d 后分离菌株 ,得到的菌株记为“JXO Ⅲ2
豫粳”。
将培养 36h 的各类 JXO Ⅲ菌悬液稀释至 109 cfuΠml ,ESR 法比较对照菌株与互作后菌株细胞中 O -2 水平的
变化 ,如图 3 所示。
图 3 　JXO Ⅲ与互作后菌株 36h 超氧阴离子释放能力比较
Fig. 3 　Comparison of O -2 production on suspensions 36h inoculated among JXO Ⅲand strains interacted
A1 空白 Tiron only ; B1 JXO Ⅲ对照菌株 JXO Ⅲ; C1 JXO Ⅲ2301 JXO Ⅲ2301 ; D1 JXO Ⅲ2豫粳 JXO Ⅲ2Yujing
3 次重复的结果均显示 :JXO Ⅲ对照菌株胞内的 O -2 水平极低 ,亲和与非亲和互作后分离得到的两个菌株
JXO Ⅲ2301 和 JXO Ⅲ2豫粳与对照菌株的 O -2 信号相比均有极显著的增强 ( p < 0101) 。非亲和互作后分离得到
的菌株 JXO Ⅲ2豫粳的增强幅度更大。互作后分离得到的菌株在培养的过程中 ,已经经历脱离互作体系后的
长时间繁殖过程。但是病原菌的 O -2 释放仍然显示出受到互作过程的影响 ,说明互作过程可诱导 JXO Ⅲ菌中
O -2 的释放 ,非亲和互作过程对病原菌胞内 O -2 水平的诱导作用更强。这就意味着在不释放 O -2 信号的 JXO Ⅲ
菌中无论亲和互作还是非亲和互作 ,都有诱导 JXO Ⅲ菌中 O -2 的释放增强的作用 ,并且在互作后仍然具有对
病原菌 O -2 释放的影响。这种影响很可能在病原菌中具有一定的遗传稳定性。
21312 　互作对 JXO Ⅴ超氧阴离子释放的影响 　JXO Ⅴ与圣稻 301 互作后分离得到的菌株记为“JXO Ⅴ2301”;
JXO Ⅴ与水稻豫粳 6 号互作后分离得到的菌株记为“JXO Ⅴ2豫粳”。与 JXO Ⅲ相反 ,水稻品种豫粳 6 号与白叶
枯病菌 JXO Ⅴ表现为亲和互作 ,大部分叶片出现病斑 ;而 JXO Ⅴ对水稻圣稻 301 是非亲和互作现象 ,叶片基本
不出现染病现象。将培养 36h 的各类菌悬液稀释至 109 cfuΠml ,用 ESR 法比较对照菌株与互作后菌株细胞中
O -2 水平的变化 ,重复 3 次检测得到稳定的结果 ,如图 4 所示。
互作后两个菌株的细胞中 O -2 信号与 JXO Ⅴ原始菌株相比均发生变化 (图 4) 。其中 JXOV 与水稻豫粳 6
号的亲和互作过程极显著提高 JXO Ⅴ细胞中的 O -2 水平 ( p < 0101) 。而 JXO Ⅴ与水稻 301 的非亲和互作过程
中却显著降低 JXO Ⅴ细胞中的 O -2 水平 ( p < 0101) 。因此 ,互作对 JXO Ⅴ菌株 O -2 释放的调控作用明显不同于
JXO Ⅲ菌。在 JXO Ⅴ菌中 ,互作发生前 JXO Ⅴ菌中 O -2 的释放已经较强 ,互作既可促进 JXO Ⅴ菌中 O -2 的释放 ,
也可抑制 JXO Ⅴ菌中 O -2 的释放。
3 　分析与讨论
水稻白叶枯病菌日本小种菌株 JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ是黄单胞菌属两个典型的、同一小种但是致病性相反的菌
株。JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ都具有致病性 ,但针对同一寄主品系时二者致病性往往相反。JXO Ⅲ与水稻 IR26 是亲和
互作 ,与水稻早生爱国者 3 号是非亲和互作 ;而 JXO Ⅴ则正好相反[20 ] 。水稻 IRBBXa4 与 JXO Ⅲ是亲和的 ,与
JXO Ⅴ非亲和[21 ] 。本实验中 ,JXO Ⅲ与实验水稻圣稻 301 表现为亲和互作 ,与水稻豫粳 6 号表现为非亲和 ;JXO
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图 4 　JXOV 与互作后菌株 36h 超氧阴离子释放能力比较
Fig. 4 　Comparison of O -2 production on suspensions 36h inoculated among JXOV and strains interacted
A1 空白 Tiron only ,B1 JXOV 对照菌株 JXOV ; C1 为 JXOV2301 JXOV2301 ; D1 JXOV2豫粳 JXOV2Yujing
Ⅴ则正好相反。本实验以这两个致病性相反的典型菌株为对象 ,分析二者细胞中 O -2 释放的差异 ,并比较与
水稻的互作过程对它们 O -2 释放的调控 ,尝试了解 O -2 在病原菌致病过程中的作用。
以往的化学法结果表明 ,JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ,都有释放 O -2 现象 ,但是释放水平有显著的差异[14 ] 。本实验的
ESR 检测结果进一步证明 ,JXO Ⅲ和JXO Ⅴ中O -2 释放水平存在极显著的差异 ,JXO Ⅴ细胞中维持很高的O -2 水
平 ,而 JXO Ⅲ细胞中的 O -2 水平极低。JXO Ⅴ的滤液组分中具有显著强于 JXO Ⅲ组分的 O -2 释放活性 ,暗示病
原菌滤液中的胞外组分可能对细胞 (如 JXO Ⅴ)中所需的较高 O -2 水平有重要的贡献。
已有实验显示 ,在合适的浓度下 ,O -2 在细胞信号途径中起重要的调控因子的作用。在膜受体的信号转
导等其他生理功能中发现了 O -2 的信号分子作用[22 ] ,O -2 在转录因子 SoxR 的活化等基因调控信号的传递中也
起到重要的作用[11 ] 。另一方面 ,有氧环境中 ,在胞内产生的 O -2 对细胞具有潜在的毒性。当细胞内 O -2 浓度
过高时 ,就会引起大分子如脂质、蛋白和 DNA 的损伤[11 ] 。致病性不同的病原菌细胞中 O -2 水平的差异 ,初步
显示致病性不同的病原菌中 ,O -2 可能具有不同的作用。据推测 ,高 O -2 水平的细胞 (如 JXO Ⅴ) 中 ,O -2 可能不
仅在细胞中起到传导信号的作用 ,更可能作为病原菌侵染植物时的一种毒性因子 ;O -2 水平低的细胞 (如 JXO
Ⅲ)中 ,O -2 可能仅仅起到传导信号的作用。
为了了解互作过程是否不仅影响寄主植物 ,对病原菌的 O -2 释放也有调控的作用 ,JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ侵染亲
和性不同的寄主植物后 ,本实验从互作体系中分离病原菌。在实验中观察到两种互作调控病原菌 O -2 释放的
形式 ,对自身 O -2 水平很低的 JXO Ⅲ来说 ,亲和互作和非亲和互作过程都可诱导 JXO Ⅲ中 O -2 的释放增强 (图
3) ;第二种调控形式存在于自身有 O -2 水平较高的 JXO Ⅴ中 ,则随亲和性不同而表现出诱导或抑制的不同调
控作用 (图 4) 。无论是在 JXO Ⅲ还是在 JXO Ⅴ中 ,互作后分离得到的病原菌仍然能够显示出互作对其 O -2 释
放的显著影响 ,显示互作可能对病原菌具有调控作用 ,这种作用很可能具有一定的遗传稳定性。但互作过程
中病原菌是否受到更强的调控作用 ,并且在基因水平上也受到显著的影响从而导致这种长效效应 ,还有待更
深入的分析结果。虽然由于寄主植物2病原菌互作体系的复杂性以及实验技术的局限 ,目前仍无法阐明亲和
性不同的植物2病原菌互作过程调控病原菌 JXO Ⅲ和 JXO Ⅴ的超氧阴离子释放的病理学意义 ,但本实验的结果
显示互作有可能对病原菌超氧阴离子释放造成长久的影响 ,这些实验证据将有助于从活性氧这个新的角度去
理解植物病原细菌的致病机理以及寄主植物2病原菌相互作用的机理。
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