全 文 ：第 26卷第 5期
2006年 5月
生 态 学 报
AC IA ECOLOGICA SINICA
Vo1．26．No．5
May，2006
对降解喹啉的厌氧生物反应器中重要功能菌群的鉴定
刘彬彬 ，张 峰 ，冯晓西 ，刘勇弟 ，张晓君 ，赵立平 ’
(1．上海变通大学生命科学与技术学院微生物分子生态学与生态基因组学实验室．上海 200240；
2．华东理T大学资源与环境T程学院，上海 2(10037)
摘要：通过把微生物区系组成的分子水平的动态变化情况与微生物群落的整体功能变化相关联，鉴定重要的功能类群是微生物
分子生态学研究的一个重要的策略。应用分子生物学的方法，对一个实验室规模的用于降解喹啉的厌氧反应器生物膜样品的
微生物区系组成变化进行解析，找出可能的主要功能菌。通过 DGGE对反应器的种子污泥和运行稳定的厌氧生物膜反应器的
微生物区系组成进行了对比分析，并对主要的优势条带进行了分子鉴定。同时对以上两个样品构建 16S rDNA克隆文库，通过
统计学分析对克隆文库的有效性进行验证，并对文库进行测序分析。DGGE条带及克隆文库的序列分析均表明，在驯化过程
中，Gamma Proteobacteria亚纲与Desulfobacterpostgatei种的微生物显著增加，这种动态变化表明这些细菌可能是在厌氧条件下对
喹啉的降解起关键作用的微生物。
关键词 ：生物膜；厌氧反应器；DGGE；16S rDNA克隆文库
文章编号：1000-0933(2006)05—1390-06 中图分类号：Q143，Q938 文献标识码：A
Identifcation of functionally important microorganisms in a lab-scale anaerobic
biofdm reactor for quinoline-degradation
LIU Bin—Bin。
，
ZHANG Feng2
，
FENG Xiao—Xi ，LIU Yong—Di2，ZHANG Xiao—Jun。，ZHAO Li—Ping 、 (1
． 。rⅡ ry
Molecular Microbial Ecology and Ecogenomics，Colege ofLife Science and Biotechnology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 2002A0，China；2．Colege of
Resource Science and Enviromnental Enginering，Eastern China University ofScience and Te~nology，Shanghai 200237，China)．Actu Ecolo~ca Siniea。2006。
26(5)：1390—1395． ．
Abstract：Microbial community structure in a lab·-scale quinoline-degrading anaerobic biofilm reactor was dissected in comparison
with the seeding sludge to identify the functionally important members．Samples were colected from the biofilm when the reactor
reached the stable quinoline and COD removal efficiency．Total DNA was extracted from the samples．16S rDNA v3 region was
amplifed and DGGE analysis was performed．The dominant bands were excised and the nucleotide sequences of the rRNA genes
were determined．At the same time，a near-ful length 16S rDNA library was constructed．Nucleotide sequences of 100 randomly
selected clones were determ ined and identified by nearest neighbor analysis．Comparison analysis with the seeding sludge indicated
a significant increase of the Gamma Proteobacteria and Desulfobacter postgatei during the acclimation period in the reactor，this
suggested that these microorganisms may be functionally impo rtant for quinoline—degradation under anaerobic conditions．
Key words：biofilm；anaerobic reactor；DGGE；16S rDNA clone library
利用分子生物学 的技术 ，对 自然及人工的生态系统进行 微生物区系 的解析 ，能够更深入 的了解 和更好 的
基金项目：国家 863发展计划资助项目(2ootAA21413I)；国家自然科学基金资助项目(30470061)
收稿日期：2005．12．15；修订日期：2006-03—15
作者简介：刘彬彬(1978一)，男，内蒙古赤峰人，博士生，主要从事微生物分子生态学研究．E mail：liubinbin@situ．edu．cn
*通讯作者 Coresponding author．E-mail：lpzhao@sjtu．edu．ca
致谢：James Bomeman(Department of Plant Pathology，University ofCalifornia，Riverside)博士对英文摘要进行了修改润色，在此谨表谢意
Foundation item：The pmject was supproted by Hish Tech．Development Program of China(863)(No．2001AA214131)；National Natural Science Foundation of
China(No．30470061)
Ra~eived date：2005—12·15；Accepted da te ：2006—03—15
Biography：LIU Bin—Bin，Ph．D．candidate，mainly engaged in microbial ecology．E—mail：liubinbin@sjtu．edu．ca
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5期 刘彬彬 等：对降解喹啉的厌氧生物反应器中重要功能菌群的鉴定
利用这些系统。废水处理系统是 目前研究较多的人工生态系统之一 ，而厌氧条件下的生物处理 目前是很多废
水处理系统的一个重要组成部分。当代废水处理的一个主要的变革就是将厌氧过程组合到废水处理中，使好
氧和厌氧状况在反应体系中同时存在或反复周期地实现 。许多在好氧条件下难以发生的反应，如多氯芳烃
的脱氯，芳香族化合物和杂环化合物的开环，均可在厌氧条件下发生。但是厌氧微生物往往难以培养和分离，
这使得人类对厌氧微生物的研究远远低于对好氧微生物的研究水平 。近年来随着研究技术的发展，尤其是
分子生物学的手段应用于解析环境样品中微生物的区系组成，使得人们对厌氧微生物的认识有了很大的进
展。并不断有新的物种被发现，Chouari等最近还在厌氧的废水处理系统中发现了一个新的微生物类群 。
这些发现有利于对废水的厌氧处理过程进一步的深入理解与改 良．
传统的分离培养方法研究废水处理系统时，一个主要的问题就是将在实验室分离到的具有重要功能的微
生物投回废水系统中时，该微生物很难发展成为系统中的优势种。这主要是由菌种本身的生存能力及其降解
有机物的能力所决定的 。分子水平的方法与传统培养方法的区别在于，传统方法是先进行菌种分离然后
鉴定其功能与分类地位，也就是说其功能是在实验室条件下的功能，而分子方法是根据系统的功能直接鉴定
其优势功能菌 ，避开 了培养过程的选择性造成的偏差 ，所鉴定出的微生物 已经具有 了在废水处理系统 中发展
成为优势种的潜力 ，这对于工业废水处理过程的运行和改进具有指导意义。
微生物在废水的生物处理过程中起着重要的作用。随着分子技术应用于环境样品微生物区系的研究，通
过对直接从环境 中提取的 DNA进行扩增 、克隆测序 ，人们得 到了越来越多的 rRNA基 因序列 。但这些序列
大多与已经培养得到的细菌的亲缘关系较远，无法用已知的信息对其进行鉴定。通过对微生物所在的系统功
能与这些序列进行关联 ，可以得到一些关于这些微生物的功能方面的信息 ，从而可以鉴定 出该系统 中的优
势的功能均 。
喹啉是一种主要 的含氮杂环化合物 ，是存在于某些土壤 和水体 中的主要含氮污染物之一 ，实验表 明喹啉
具有毒性和致癌性 。而在工业废水处理过程中，喹啉也是一种常见的难降解的复杂有机物之一。近年来，
由喹啉污染引起 的大众健康问题越来越多的受到人们的重视 。¨’“J。
在本实验中，建立了一个能够稳定降解喹啉的厌氧生物膜反应器，应用 DGGE和构建克隆文库的方法，对
其微生物组成进行了解析，并与种子污泥的微生物 区系组成进行对比分析 ，通过分析微生物 区系组成的变化
来找出厌氧条件下对喹啉的降解起主要作用的功能菌，这对研究废水中含氮杂环化合物的降解具有一定的意
义。
1 实验方法
1．1 装置调试与样 品采集
反应器的体积为 18L，鞣性材料作为填料。种子污泥采集于上海焦化厂废水处理系统的二沉池。该系统
利用种子污泥进行挂膜 ，人工合成废水的成分为喹啉 、葡萄糖 、(NI-I,) so,和 K2HP04。喹啉为 40mg／L，保持系
统中碳 、氮 、磷的比 150：5：1。合成废水 由一个 电磁刻度泵 (ES series，IWAKI，Japan)连续加入反应 器中并保
持水力停留时间为 24h，系统的温度 由一个电子加热器(YH，China)控制在 30℃。经过 6周的调试 ，反应器达
到了一个稳定的状态 ，连续 5d监测喹啉和 COD去除效率。COD由Greenberg国际标准方法测得 。喹啉的浓
度由 HPLC(high performance liquid chromatography，GC7890，Techcomp，Shanghai China)法测定。pH值和溶解氧
(DO)分别由 pH计(pHS．3C，Leici，China)和氧气表 (Oxi330i，wTW，C~rman)进行测定。当系统达到稳定状
态后，采集生物膜样品进行微生物组成分析。
1．2 样 品预处理和 DNA提取
本实验使用的种子污泥同文献 ¨，种子污泥的处理过程详见文献 。
1．2．1 样品预处理 在生物膜样品中加 5倍体积的 TENP缓 冲液(50mmol／L rifts，20mmol／L EDTA，100mmol／L
NaC1 0．01g／ml PVP，pill0)及玻璃珠充分旋涡(5min)。11821 r／min(10000g)，4E离心5rain，收集沉淀。加5倍体
积的 PBS缓冲液(8g／L NaC1，0．2g／L KC1，1．44g／L Na2 HPO ，0．24g／L KH2PO ，pH7．4)，旋涡，收集沉淀(重复 2
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次)。加 PBS缓冲液悬浮，分装到 10ml离心管，每管加 4ml悬浮液和 lml甘油，一部分样品进行 DNA的提取，
暂时不用的样品放在 一70~C保存。
1．2．2 DNA的提取 将前处理好的样品分装到 1．5ml离心管中，11821r／rain(10000g)，4℃离心 5min，收集 50
— 100rag样品，加 2ootd抽提缓冲液(100mmol／L Tris，100mmol／L EDTA，200mmol／L NaC1，1％ PVP，2％ CTAB，pH
8．0)，加 2粒玻璃珠，旋涡5min，使样品充分悬浮。加入 2ootd SDS缓冲液 (2％SDS)，上下颠倒 5min，放置冰
上。样品进行 13479drain(13000g)离心 10rain，将上清液转移到一个新的离心管内。加入400ta苯酚颠倒离心
管混匀样品。样品进行 13479r／rain(13000g)离心 15rain，将上清液转移到一个新的离心管内。同样方法用
400 苯酚和氯仿(1：1)及 400p．1氯仿各抽提 1次，在上清液中加入 0．6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀后置于
一 20％沉淀过夜，13987r／rain(14000g)离心样品 20rain，倒掉上清液。用 70％乙醇洗涤两次，冷冻干燥 30rain，
用 10o 双蒸水悬浮样品。加入 1．5td RNaseA(20ms／m1)37％消化 20rain。得到的 DNA样品于一20~C保存。
1．3 16S rRNA基因 V3区 PCR扩增及变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析
16S rRNA基因的 V3区扩增采用细菌通用引物 P2，P3[】引。PCR扩增体系及程序采用 Muyzer等人的方
法 引。PCR产物通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分析(Dcode system，Bio．Rad)。其中变性剂梯度为 35％
一 60％(100％变性剂相当于 7mol／L的尿素和 40％的去离子甲酰胺)。实验采用 8％聚丙烯酰胺凝胶 ，电泳缓
冲液为 1×Tris—Acetate．EDTA(TAE)(pH8．4)。电泳在 200V电压、60％条件下运行 200rain，电泳结束后用
SYBR green工(Amre~o)染色。DNA通过 UVI凝胶成像系统(UVhec，Cambridge，United Kin#om)进行分析。对
图谱中的主要条带进行割胶回收，通过重新扩增 、克隆、测序并对其序列进行分子鉴定。
1．4 16S rRNA基因全长扩增 ，克隆文库构建
16S rRNA基因的全长扩增采用细菌通用引物 Po，P6[】 。PCR扩增体系及程序采用 Di celo等人的方
法u 。PCR扩增产物通过连接酶连接至 pGEM T．easy克隆载体(Pmmega)，通过电击转化法(BIO．RAD)转化到
大肠杆菌 DI-Sa中。筛选 100个阳性克隆构建克隆文库 。
1．5 测序及 序列分析
对文库 中的 100个克隆首先用 P0引物测序一个反应，共得到 100个序列，测序委托上海英骏生物技术公
司完成，一个反应大约得到 500bp左右的有效序列，以序列相似性 99％为标准，将这 100个序列划分为临时分
类操作单元(OTU，provisional operational taxonomic units)。对每个 OTU选取一个代表克隆利用载体引物 17和
SP6进行全长测序。所得的序列在 RDP数据库中进行嵌合体(chimera)检测 ¨。
为了检测克隆文库的测序量是否充分，采用了 Kemp等人 ¨的渐进采样法。通过随机采样，构建不同大
小的假克隆库(pseudo—librariy)。对每一个克隆库，根据 Kemp等人的方法n。 计算两个 estimators，S h舳l¨ 驯和
s^cE 。克隆文库的数据输入一个在线的计算程序，得到的结果同样根据 Kemp等的方法进行处理 ¨。
为了对文库中的克隆的进化地位进行鉴定，在 GenBank(htp：／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／)数据库中
对全长序列进行 比对分析 ，寻找亲缘关系最近的细菌或克隆。构建进化树(Phylogenetic tree)。
1．6 核酸序列登录号(Accession number)
本研究中所得的生物膜样品的 DGGE条带的序列及克隆文库 16S rRNA基因序列在 GenBank数据库中的
登录号为 DQ296464．DQ296465和 DQ296466．DQ296474。
2 结果分析
2．1 反应器的运行状况
经过6周的驯化，反应器达到的了稳定的运行状态，系统的 pH值为7．0。溶解氧(DO)<0．1mg／L。经过
5d对喹啉和 COD去除效率的连续监测，得到的平均喹啉去除效率为53．6％，平均 COD去除效率为 60．4％。
2．2 DGGE图谱及主要条带的分子鉴定
提取种子污泥和生物膜样品微生物群落的基因组总 DNA，用细菌通用引物扩增 16S rDNA V3区，通过
DGGE分析得到的图谱见图 1。对其中的主带(条带 a—e)进行割胶，重新扩增，克隆测序分析。在 GenBank
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5期 刘彬彬 等：对降解喹啉的厌氧生物反应器中重要功能菌群的鉴定 1393
(htp：／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／)数据库中进行比对分析，发现与条带 a的序 列同源性最 高的是
Pseudomonas sp．PCP2(AF326380)，与条带 b同源性最高的是 Desulfobacterpostgatei(AF418180)。而种子污泥中
的优势条带(c～e)与 3个尚未得到纯培养的微生物具有最高的同源性n ，而 a和b条带在种子污泥中几乎看
不到，这一结果表明，在驯化过程中，条带 a和 b所代表的微生物的种类显著增加。而驯化是在含有喹啉的厌
氧条件下进行的，所富集的微生物很有可能就是厌氧条件下降解喹啉的主要功能菌。
e
d
C
b
*条带编号与左图中编号相对应 Bands were excised from DGGE gel shown left
图 1 厌氧反应器中的种子污泥及稳定状态的生物膜样品的微生物区系DGGE图谱及其中主要条带的分子鉴定结果
Fig．1 DGGE analysis of 16S rDNA v3 region amplified from the seeding sludge an d the biofilm in the an aerobic reactor．The denaturing gradient was from
35％ to 6o％ ．Table 1 shows the result of the sequence analysis of ban ds obtained from DGGE gel
1：种子污泥样品 Lanel：Seeding sludge；2：厌氧反应器生物膜样品 Lane 2：Anaerobic Rector
2．3 16S rRNA基因全长文库 的有效性
种子污泥克隆文库的分析见 ，生物膜样品得到了97个有效的克隆(其中3个被检测为嵌合体)，为了验
证所建的文库是否足 以用来准确 的预测样 品的丰度 (phylotypes richnes)。采用 了 Kemp等人 ” 的渐进采样
(progressive sampling)的方法 。结果如图 2所示 ，从图中可以看出，两个 estimator均达到饱和状态，说明所建 的
文库测序量充分。
2．4 克隆文库的序列分析 2o
生物膜样品文库中的所有克隆按99％序列同源性 导
的标准，共得到9个有效的OTU，对每个OTU的全长序 吾
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析表明Gamma Proteobacteria亚纲和Desulfobacterpostgatei种的微生物在文库中占有优势地位。在 DGGE图谱分
析中，条带 a的序列同源性最高的是 Pseudomonas sp．PCP2，这是一个典型的 Gamma Proteobacteria亚纲的微生
物，因此两部分实验结果均表明 Gamma Proteobacteria亚纲和Desulfobacterpostgatei种的微生物是反应器中的优
势微生物。在种子污泥中，这些微生物并不是优势种 。也就是说当反应器在具有了厌氧条件下降解喹啉
的功能时，其微生物区系中相应的一些微生物得到富集，所以本实验中鉴定出的优势种很有可能就是在厌氧
条件下降解喹啉的主要功能菌。
group
图3 生物膜样品克隆文库中所有 OTU及其在 GenBank中的亲缘关系最近的序列所构建的系统发育树
Fig．3 Dendrogram of 16S rDNA 8eqlen~ showing the phylogenetic afiliation of the OTUs in AR．Neighbor joining tree was constructed of the near-ful-
length 16s rDNA sequences of the representative clones of each OTU and the retrieved sequences from the GenBank databases．The OTU nanle and the number
of clones belongs belonging to that phylotype are shown in the square brackets．Th e scale bar representss 5 nucleotide substitutions per 100 nucleotides ．
Bootstrap value(100 replicates)above 50％ are shown at nodes
虽然本实验鉴定出了一些主要的功能菌，但这些菌的生理特性及其降解复杂有机物的能力尚不能准确得
知。这些信息可以通过功能基因多样性分析 ，荧光原位杂交技术(FISH)，稳定性同位素探测技术 (SIP) 以
及对已经鉴定的优势种进行分离等方法进行深入的研究。
References：
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
Dal Z S，Zhang J，Yu E J，et a1．The application potential of the anaerobic—oxic activated sludge method．China Water＆Wastewater，1994，10(4)：35
～ 37．
Ling D W．The development of the research on anaerobe ．Buletin of Microbiology，1995，22(4)：245—252．
Chouari R，Le Paslier D，Dauga C，et a1．Novel major bacterial candidate division within a municfpal anaerobic sludge digester．Appl Environ Microbiol，
2005，71(4)：2145—2153
Stephenson D and Stephenson T．Bioaugmentation for enhancing bidogical wastewater treatment．Biotcchnol Adv，1992，lO(4)：549～59．
Bokhamy M，Deront M，Adler N，et ．Survival and activity of Comamonas testosteroni in mixed population．Water Research，1997，31(11)：2802—
2810．
Pace N R．A molecular view of microbial diversity and the bios phere．Science，1997，276(5313)：734—740．
Torsvik V and Ovreas L．Microbial diversity and function in soil：from genes to ecosystems．Cur Opin Microbiol，2002，5(3)：240—245．
Minako N，Takio Y，Yuko S，et a1．Mutagenicities of quinoline andits derivatives．Mutation Res，1977，42：335—342．
维普资讯 http://www.cqvip.com
5期 刘彬彬 等 ：对降解喹啉的厌氧生物反应器中重要功能菌群的鉴定 1395
[9] Azhar N and Stuckey D．The influence of chemical structure on the anaerobic catabolism of refractory compounds：a case study of instant cofee wastes．Wat
Sci Technol，1994，30：223～232．
[1O]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
l8
l9
20
2l
22
[23]
O’Loughlin E J，Kehrmeyer S R，Sims G K．Isolation，Characterization，and Substrate Utilization of a Quinoline-Degrading Bacteria．International
Biodeterioration＆ Biodegradation，1996，38：107～l18．
Stuermer D H，Ng D J，Morris C J．Organic contaminants in groundwater near an underground coal gasification site in northeastern Wyoming．Environ．Sci．
Technol，1982，16：582～587．
Greenberg A E，Clesceri L S，Eaton A D．Standard methods for the examination of water and wastewater，18th ed．American Public Health Association，
American Water Works Association，and Water Environment Federation，Washington D．C．，1992．
Liu B B，Zhang F，Feng X X，et a1．Thaltera and ：∞rc哪 as functionally important genera in a denitrifying quinoline-removal bioreactor as revealed by
microbial community structure comparison．FEMS Microbiology Ecology，2006，55(2)：274～286．
Muyzer G，de Wna l E C，Uitterlinden A G．Profiling of complex mi crobial po pulations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of po lymerase chain
reaction-amplifed genes ceding for 16S rRNA．Appl Environ Microbiol，1993，59(3)：695～700．
Di Cello F，Bevivino A，Chiarini L，et a1．Biediversity of a Burkholderia cepacia population isolated from the maize rhizasphere at diferent plant growth
stages．Appl Environ Microbiol，1997，63(11)：4485～493．
Cole J R，Chal B，Marsh T L．et o2．The Ribosomal Database Project(RDP-I)：previewing a new autoaligner that alows regllar updatcs and the new
prokaryotic taxonomy．Nucleic Acids Res。2003，31(1)：42～43．
Kemp P F and Aller J Y．Bacterial diversity in aquatic an other environments：what 16S rDNA libraries can tel us．FEMS Microbio1．Ecol，2004，47：161
～ 177．
Kemp P F and Aler J Y．Estimating prokaryotic diversity：When are 16S rDNA libraries large cnsngh?Limno1．Oeanogr．Methods，2004．2：114～125．
Chao A．Estimating the population size for capture-recapture data with unequal catchability．Biometrics，1987，43：783～791．
Chao A．Nonparamctric estimation ofthe number of classesin apopulation．Scand．J．Stat，1983,，11：265～270．
Chao A，Ma M C，Yang M C K．Stopping rules and estimation for recapture debussing with unequal failure rates．Biometrika，1993，80：193～201．
Lee N，Nielsen P H，Andreasen K H，et a1．Combina tion of fluorescent in situ hybridization an d mi croautoradiography-a new tool for structure-function
analyses in microbial ecology．Appl Environ Microbiol，1999，65(3)：1289～1297．
Manefield M，Whiteley A S，Grifiths R I，et a1．RNA stable isotope probing．a novel means of linking microbial community function to phylngeny．Appl
Environ Microbiol，2002，68(11)：5367—5373．
Ginige M P，Hugenhohz P，Daims H， et a1． Use of stable—isotope probing， full-cycle rRNA analysis． and fluorescence in situ hybridization．
microautoradiography to study a methanol·fed dcnitrifylng microbial cormnunity．Appl Environ Microbiol，2OO4，70(1)：588～596．
参 考文献 ：
[1] 戴镇生，张杰，于尔捷，等．厌氧．好氧活性污泥法的应用前景．中国给水排水，1994，10(4)：35～37
[2] 凌代文．厌氧微生物研究的新进展．微生物学通报，1995．22(4)：245～252．
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