全 文 ：核 农 学 报 2015，29 ( 2 ) : 0270 ～ 0277
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期: 2014-01-23 接受日期: 2014-09-20
基金项目:“十二五”国家科技计划课题 ( 2011AA100209-2 )
作者简介:代小梅，女，助理研究员，主要从事观赏植物分子育种研究。Email: aileenxiaomei @ 126． com
通讯作者:孙振元，男，研究员，主要从事观赏植物分子育种、园林植物生理生态研究。E-mail: sunzy@ caf． ac． cn
文章编号: 1000-8551 ( 2015 ) 02-0270-08
草地早熟禾愈伤组织诱导及柠檬酸对
其褐化的抑制效应
代小梅 孙振元 韩 蕾
( 中国林业科学研究院林业研究所 /林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091 )
摘 要:本研究以草地早熟禾新歌莱德、午夜、纳苏 3 个品种的成熟种子为材料，研究了浸泡、研磨和接种
方式等因素对愈伤组织诱导率和出愈时间的影响以及不同浓度的柠檬酸对其愈伤组织褐化的抑制效
果。结果显示，浸泡 48h 处理有利于种子愈伤组织诱导，随着浸泡时间延长愈伤组织平均诱导率逐渐下
降，且 3 个品种的出愈时间均推迟 ;在浸泡 48h 处理下，无论采取机械接种或随机接种方式接种，研磨处
理与未经研磨处理所得到的 3 个品种种子愈伤组织诱导率均无明显差异; 在种子浸泡 48h，未经研磨处
理条件下，分别采用随机接种与机械接种方式所得到的 3 个品种种子愈伤组织诱导率差异极显著。此
外，研究表明在愈伤组织的继代培养中对愈伤组织褐化抑制效果较好的浓度是 2mg·L － 1，培养 2 周未见
有褐化现象，而随柠檬酸浓度升高褐化率逐渐增加，且对照的褐化率达到 25% ～ 37. 5%。经试验观察
发现 2 mg·L － 1柠檬酸浓度对愈伤组织的增殖和分化再生无明显影响，新歌莱德、午夜、纳苏的胚性愈伤
组织分化率分别为 75%、50%、70%，生根率分别为 85%、70%、80%。本研究初步探讨了影响草地早熟
禾愈伤组织诱导的因素，解决了草地早熟禾愈伤组织继代培养中的褐化现象，完善了草地早熟禾愈伤组
织诱导和再生体系建立，为利用愈伤组织再生体系进行基因工程改造研究奠定了重要的技术基础。
关键词:草地早熟禾 ; 组织培养 ;柠檬酸 ;褐化
DOI: 10. 11869 / j． issn． 100-8551. 2015. 02． 0270
草地早熟禾( Poa pratensis L． ) 是我国南北方广泛
应用且适应性很强的冷季型草坪草，具有耐践踏、绿期
长等优良特性，且具有良好的坪观效果，常作为建植草
坪的重要草种，已被广泛应用于公共绿地、家庭庭院、
公路护坡、运动场和高尔夫球场的建设，但同时也具有
易感病、耐旱性差、温度敏感等缺点［1 － 3］。草地早熟禾
是一种复杂的多倍体及兼性无融合生殖方式植物，常
规的父母本杂交及理化诱导突变体等方式进行目的性
状改良具有改造周期长的问题。近些年来，一些实验
室利用基因工程技术对早地早熟禾品种进行针对性目
的性状改造获得成功［4 － 6］。草坪草愈伤组织通常作为
农杆菌介导转化法和基因枪法转化的受体，因此建立
草坪草高频再生体系以及研究草坪草愈伤组织培养是
十分必要的［7 － 9］。
外植体褐变是在植物组织培养过程中影响组织培
养成功的关键因素［10］。外植体发生褐化现象是由植
物材料受伤后体内释放的酚类物质在酚氧化酶的作用
下被氧化成褐色的醌类物质导致的结果。褐化所产生
的醌类物质对外植体材料将产生毒害作用，影响外植
体生长和分化，严重时导致死亡。褐化现象在植物组
织培养中普遍存在，主要与植物材料的基因型和生理
状态、取材时期、培养基以及培养条件等因素有关［11］。
对植物材料预处理、调整培养基、控制培养、添加防褐
剂等方面控制褐化的研究已有大量报道［12 － 19］。其中
关于在培养基中添加防褐剂的研究和应用最多，常用
的主要防褐剂有吸附醌类物质的吸附剂和防止酚类物
质氧化的抗氧化剂。
本研究对生产上常用的 3 个草地早熟禾品种愈伤
组织诱导率和出愈时间进行系统研究，试验以草地早
熟禾成熟种子为外植体，研究浸泡、研磨和接种方式等
072
2 期 草地早熟禾愈伤组织诱导及柠檬酸对其褐化的抑制效应
因素对愈伤组织诱导率的影响，以期为优化组织培养
体系奠定基础。试验以继代培养中愈伤组织的褐化控
制为目的，通过在愈伤组织诱导培养基中添加不同浓
度的柠檬酸，以优化选择能够有效控制愈伤组织褐化
的柠檬酸浓度，从而较好地解决多年生黑麦草愈伤组
织继代培养中的褐化问题。
1 材料和方法
1. 1 试验材料
试验于 2013 年在中国林业科学研究院国家重点开
放实验室进行，供试材料为草地早熟禾新歌莱德、午夜、
纳苏品种成熟种子，购自北京绿冠草业股份有限公司。
表 1 草地早熟禾不同品种成熟种子各个处理下不同编号说明
Table1 Different number of different varieties of Kentucky bluegrass mature seeds under each treatment
品种
Varieties
接种方式
Transferring ways
浸泡 48h
Soaking for 48h
浸泡 72h
Soaking for 72h
研磨
Grinding
未研磨
Without grinding
研磨
Grinding
未研磨
Without grinding
新歌莱德 机械接种 X211 X221 X311 X321
‘Nuglade’ 随机接种 X212 X222 X312 X322
午夜 机械接种 W211 W221 W311 W321
‘Midnight’ 随机接种 W212 W222 W312 W322
纳苏 机械接种 N211 N221 N311 N321
‘Nassau’ 随机接种 N212 N222 N312 N322
1. 2 主要试剂及培养基配方
试验主要试剂如下 : 吐温 － 20 ( Tween-20 ) 、蔗糖、
琼脂粉、次氯酸钠溶液 ( 活性氯﹥ 5% ) 为北京化工厂
生产; 2，4-二氯苯氧基乙酸 ( 2，4-dichlorophenoxy acetic
acid) 、6-苄氨基腺嘌呤 ( 6-Benzylamino purine ) 等植物
激素均购自北京化学试剂公司。
愈伤组织诱导及再生培养基配方［9］如下 :
愈伤组织诱导培养基: MS［20］培养基添加3mg·L － 1
2，4-D、蔗糖 30g·L － 1、琼脂粉 6 g·L － 1，pH 值 5. 8 ;
愈伤组织分化培养基: MS 培养基添加0. 1mg·L － 1
2，4-D、2. 0mg·L － 1 6-BA、蔗糖 30g·L － 1、琼脂粉 6 g·
L － 1，pH 值 5. 8 ;
生根培养基: 1 /2MS 添加蔗糖 20g·L － 1、琼脂粉 6
g·L － 1，pH 值 5. 8。
1. 3 种子消毒与去皮
称取适量成熟种子于 50mL 离心管中，加入 25mL
次氯酸钠溶液、15mL 蒸馏水和 1 ～ 2 滴吐温 － 20，在磁
力搅拌器 ( S21-3 型，上海予腾生物科技有限公司 ) 上
消毒 1h，以无菌水冲洗 3 ～ 5 次［21］。
1. 4 诱导愈伤组织前无菌材料的处理方法
1. 4. 1 浸泡处理 消毒处理的草地早熟禾成熟种子
加入 20mL 无菌水，将种子置于 4℃黑暗条件下分别浸
泡处理 48h 和 72h，每种处理 3 个重复，接种样本量为
60 粒 /皿。在操净工作台内以无菌水冲洗 2 次，再次
以 25mL 次氯酸钠溶液添加 15mL 无菌蒸馏水消毒
20min，无菌水冲洗 5 ～ 6 次后，用无菌滤纸吸干多余水
分备用。
1. 4. 2 研磨处理 接种前，分别将经过浸泡处理的种
子在无菌研钵中研磨损伤 1min( 简称研磨 ) 或不研磨，
研磨程度以磨破种皮为宜，每处理 3 个重复，接种样本
量为 60 粒 /皿。
1. 4. 3 接种方式 本研究根据种子在培养基上的放
置方式不同，经过研磨和未研磨的种子分别以随机接
种和机械接种方式接种于愈伤组织诱导培养基上。机
械接种:将种子种脐朝下，按粒排列接种于培养基上，
每皿种子数为 60 粒。随机接种:将一定数目的种子随
机放置于培养基上，使种子呈自然分散状态［22］，每皿
种子数为 60 粒。每处理重复 3 次。不同的处理方法
下培养的材料编号见表 1。
1. 5 愈伤组织的诱导
将消毒后经过不同处理的种子分别接种于愈伤组
织诱导培养基上，25 ℃黑暗培养。每 2 周更换 1 次新
的培养基。成熟种子在愈伤组织诱导培养基上培养若
干天后，大部分种子开始长芽和根，待芽基部出现白色
的愈伤组织小块后，应及时剪去芽和根，以免培养基养
分流失过快，促进愈伤组织小块的生长［23］。接种 21d
后开始对诱导出的愈伤组织进行继代培养，每 2 周更
172
核 农 学 报 29 卷
换一次新的培养基，愈伤组织继代培养基同诱导培养
基。分别培养 3、5、7、14、21、28、35d 后统计愈伤组织
诱导率。
1. 6 防褐剂的添加
胚性愈伤组织继代培养若干次后，逐渐出现褐化
现象。为了缓解愈伤组织褐化现象，需要在培养基中
添加防褐剂。试验选取的防褐剂为柠檬酸 ( Citric
acid) ，设置 5 个浓度，每个浓度的添加量见表 2。将不
添加任何防褐剂的对照组设置其浓度为 0，共 6 组。
分别记录柠檬酸处理 7、14d 后的褐化率以及在培养基
中添加柠檬酸对愈伤组织生长的影响。
表 2 柠檬酸浓度及添加量
Table 2 The concentration and addition dosage of Citric acid
处理号
Number
柠檬酸浓度
Concentration of Citric acid / ( mg·L － 1 )
1 0
2 2
3 4
4 6
5 8
6 10
图 1 草地早熟禾随机接种培养 14d 后种子出愈情况
Fig． 1 Induced callus of Kentucky bluegrass seeds after randomly inoculated and culture for 14 days
1. 7 愈伤组织的分化和再生
挑选生长良好，紧密，黄色颗粒状胚性愈伤组
织［24 － 25］接种于分化培养基，置于组培室培养架上，
16h /8h( 光照 /黑暗交替处理 ) ，光强 2 000Lx，温度
25℃。待出芽后，转于生根培养基上进行生根培养。
生根后，将小植株转接于生根培养基上进行培养。待
小植株长大，将无菌苗开盖练苗 3d，移苗至装有等量
基质( 营养土 ∶ 草炭 ∶ 蛭石 = 1 ∶ 1 ∶ 1 ) 的 11cm 直径花盆
中，置于 HPG-280B 光照培养箱生长，16h /8h( 光照 /黑
暗) ，光强 2 000Lx，温度 32℃ /22℃ ( 光照 /黑暗) ，相对
湿度 66%。
1. 8 数据处理
对草地早熟禾种子愈伤组织诱导率、褐化率、分化
率、生根率进行统计。
愈伤组织诱导率 = ( 出愈数 /接种外植体数 ) ×
100% ;
愈伤组织褐化率 = ( 愈伤组织褐化个数 /总愈伤
组织数) × 100% ( 愈伤组织出现褐化现象即计入褐化
个数) ;
愈伤组织分化率 = ( 有芽形成的愈伤组织数 /接
种的愈伤组织总数) × 100% ;
生根率 = ( 有根形成的不定芽 /接种的不定芽总
数) × 100%。
所得数据进行方差分析，采用 Duncan 法对愈伤组
织诱导率进行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 浸泡、研磨处理及接种方式对多年生黑麦草种愈
伤组织诱导率的影响
经过处理的外植体接种后诱导培养 7 ～ 10d 后，部
分种子基部出现胚芽。接种 14d 后，多数种子出芽，出
芽后的种子大部分开始出愈( 图 1 ) 。此时分别拔掉和
剪断新长出来的芽和根，以免培养基养份流失过快。
接种 21d，将已经诱导出非胚性愈伤组织的种子进行
第 1 次继代，培养于新的愈伤组织诱导培养基上 ( 图 2
－ A) ;剩余未出愈的种子继续培养观察，避免污染。
接种 28d，即非胚性愈伤组织第 1 次继代培养 7d 后，
非胚性愈伤组织中出现少数胚性愈伤组织( 图 2 － B) ，
272
2 期 草地早熟禾愈伤组织诱导及柠檬酸对其褐化的抑制效应
注 : A: 接种 21d 后第一次继代培养非胚性愈伤组织 ; B: 接种 28d 后非胚性愈伤组织中出现少数胚性愈伤组织 ;
C: 胚性愈伤组织培养 3 周生长增殖情况。X: 新歌莱德 ; W: 午夜 ; N: 纳苏。下同。
Note: A． The first subculture of non-embryogenic callus after inoculated culture for 21 days． B: The embryogenic callus
appeared after inoculated culture for 28 days． C: The proliferation of embryo callus after culture for 3 weeks．
X: ‘Nuglade’，W: ‘Midnight’，N: ‘Nassau’． The same as following．
图 2 草地早熟禾胚性愈伤组织诱导及增殖生长
Fig． 2 Induced embryogenic callus of Kentucky bluegrass and proliferation of embryo callus
接种 35d 后进行第 2 次继代于新的培养基上，观察其
愈伤组织生长增殖情况。第 2 次继代培养的胚性愈伤
组织在新的培养基上生长 3 周后，同一克隆的胚性愈
伤组织生长增殖 1 倍 ～ 2 倍 ( 图 2 － C) ，每 3 周换新的
培养基继代 1 次。
分别在接种培养 5、7、14、21、28d 后对 3 个品种统
计其愈伤组织诱导率，由表 3 可知，种子愈伤组织诱导
率随着诱导培养时间逐渐增加。诱导培养 7、14、21、
28d 后，48h 浸泡处理和 72h 浸泡处理所得到的的 3 个
品种成熟种子的愈伤组织诱导率出现极显著差异，新
歌来得、午夜、纳苏种子在 48h 浸泡处理下所得到的愈
伤组织诱导率最高分别可达 100%、85%、95. 01%，而
在 72h 浸泡处理下得到的愈伤组织诱导率最高分别为
85. 71%、66. 67%、87. 5%。结果表明，浸泡 48h 处理
更有利于种子愈伤组织诱导，而随着浸泡时间延长愈
伤组织平均诱导率逐渐下降，且 3 个品种的出愈时间
均往后推迟。根据以上所得到的结果，后面的研究均
在种子浸泡 48h 处理条件下进行。
由表 3 及图 3 可知，在种子浸泡 48h 条件下，愈伤
组织诱导率分别在培养 5、7、14、21、28d 后，研磨处理
与未研磨处理所得到的 3 个品种种子愈伤组织诱导率
无明显差异。因此，研磨处理或无研磨处理对草地早
熟禾 3 个品种愈伤组织诱导率无明显影响。由表 3 及
图 4 可知，接种方式对种子愈伤组织诱导率的影响十
分重要。结果分析表明，在种子浸泡 48h，未经研磨处
理条件下，种子愈伤组织诱导率分别在培养 7、14、21、
28d 后，分别采用随机接种与机械接种方式所得到的
注 : 利用 Duncan 法进行多重比较。不同大写字母间表示组间
差异极显著 ( P ＜ 0． 01 ) ，不同小写字母者表示组间差异显著
( P ＜ 0． 05 ) 。下同。
Note: Using Duncan multiple comparison． Different capital letters
indicated very significant difference between the groups ( P ＜ 0．
01 ) ， and lowercase letters indicated significant differences
between the groups( P ＜ 0． 05 ) ． The same as following．
图 3 48h 浸泡处理和机械接种方式下研磨
处理对愈伤组织诱导率的影响
Fig． 3 The effect of grinding treatment on the
induction rate of callus under soaking for
48h and mechanical inoculation
种子愈伤组织诱导率差异极显著，结果表明，随机接种
方式更有利于种子愈伤组织诱导。根据以上结果可以
总结，种子浸泡 48h 条件下，无需经过研磨处理，以随
机接种方式接种，更有利于多年生黑麦草 3 个品种愈
伤组织诱导。
2. 2 不同浓度柠檬酸对愈伤组织褐化的抑制效应
外植体接种后在愈伤组织诱导培养基上诱导培养
372
核 农 学 报 29 卷
表 3 各处理下草地早熟禾种子愈伤组织诱导率随诱导时间的变化
Table 3 The change of callus induction rate /% of Kentucky bluegrass seeds at different inducing time under each treatment
品种
Varieties
处理编号
Treatment number
诱导时间 Inducing time / d
5 7 14 21 28
新歌莱德 X211 6． 67 ± 2． 72Ab 33． 33 ± 5． 44B 91． 67 ± 5． 44B 91． 67 ± 5． 44B －
‘Nuglade’ X212 12． 00 ± 0． 82Aa 45． 00 ± 4． 9Aa 100． 00A 100． 00A －
X221 10． 00 ± 2． 71Aa 30． 00 ± 2． 72B 93． 33 ± 4． 78B 93． 33 ± 4． 78B －
X222 10． 00 ± 0． 00Aa 40． 00 ± 2． 45Ab 100． 00A 100． 00A －
X311 0． 00B 23． 81 ± 3． 88C 66． 67D 66． 67D －
X312 0． 00B 33． 33 ± 5． 44B 85． 71 ± 3． 89C 85． 71 ± 3． 89C －
X321 0． 00B 11． 54D 30． 77 ± 3． 14E 30． 77 ± 3． 14E －
X322 0． 00B 24． 00 ± 3． 26C 64． 00D 64． 00D －
午夜 W211 0． 00b 15． 22B 36． 95 ± 3． 54B 50． 00 ± 5． 32B 65． 22 ± 1． 77B
‘Midnight’ W212 5． 00 ± 0． 82a 28． 00 ± 2． 44A 70． 00 ± 1． 63Aa 78． 00 ± 1． 63A 85． 00 ± 0． 81Aa
W221 0． 00b 13． 06 ± 2． 74Ba 39． 34 ± 1． 34B 49． 18 ± 2． 04Bb 57． 38 ± 2． 67C
W222 3． 00 ± 0． 82a 25． 00A 65． 00 ± 4． 08Ab 73． 00 ± 2． 45A 80． 00 ± 1． 63Ab
W311 0． 00b 6． 25 ± 2． 55Cc 12． 50 ± 2． 54D 31． 25 ± 1． 47D 46． 87 ± 2． 55D
W312 0． 00b 13． 00 ± 0． 41Ba 25． 00 ± 2． 56C 55． 55 ± 4． 53Ba 69． 44 ± 2． 26B
W321 0． 00b 1． 67 ± 1． 35Cd 5． 00 ± 1． 36E 16． 67 ± 1． 36E 33． 33 ± 2． 72E
W322 0． 00b 8． 33 ± 1． 36Bb 25． 00 ± 1． 36C 40． 00 ± 2． 54C 66． 67 ± 4． 08B
纳苏 N211 8． 00 ± 1． 63A 36． 00 ± 0． 82Ab 80． 00 ± 1． 69Ba 85． 00 ± 1． 63A 90． 00 ± 0． 81A
‘Nassau’ N212 7． 69 ± 0． 08A 40． 77 ± 1． 62Aa 81． 54 ± 1． 96Ba 87． 33 ± 1． 36A 92． 67 ± 0． 75A
N221 0． 00B 32． 00 ± 0． 82B 75． 00 ± 1． 63Bb 80． 00 ± 1． 63B 85． 00 ± 1． 63B
N222 9． 52 ± 0． 09A 42． 33 ± 1． 65Aa 88． 09 ± 0． 85Aa 90． 33 ± 1． 63A 95． 01 ± 0． 81A
N311 0． 00B 25． 00C 60． 00 ± 1． 63C 65． 00 ± 0． 82C 72． 00 ± 1． 63C
N312 0． 00B 34． 15 ± 0． 68Ab 73． 17 ± 0． 83Bb 78． 78 ± 1． 65B 80． 03 ± 0． 80B
N321 0． 00B 31． 25 ± 1． 69Ab 66． 67 ± 1． 70C 75． 33 ± 0． 47B 81． 94 ± 0． 98B
N322 0． 00B 35． 42 ± 1． 70Ab 75． 00 ± 3． 40Bb 83． 33 ± 1． 70Ab 87． 5 ± 3． 41B
注 : 利用 Duncan 法进行多重比较。同列标有不同大写字母间表示组间差异极显著 ( P ＜ 0. 01 ) ，不同小写字母者表示组间差异显著 ( P ＜ 0. 05 ) 。
Note: Using Duncan multiple comparison． The same column marked with different capital letters indicated very significant difference between the groups( P
＜ 0. 01 ) ，and marked with different lowercase letters indicated significant differences between the groups( P ＜ 0. 05 ) ．
28d 左右，胚性愈伤组织形成，在新的培养基上每生长
3 周更换新的培养基继代 1 次。在胚性愈伤组织形成
后第 3 ～ 5 次继代培养过程中，少数逐渐开始出现褐化
现象。选择继代 3 次生长良好的胚性愈伤组织，分为
6 组，在培养基中添加不同浓度的柠檬酸分别培养 1
周和 2 周。褐化个数统计结果如表 4 所示，不同浓度
的柠檬酸对愈伤组织褐化现象的抑制程度不同，结果
表明在愈伤组织的继代培养中对愈伤组织褐化抑制效
果最好的浓度是 2 mg·L － 1，培养 2 周未见有褐化现
象，而随柠檬酸浓度升高，褐化率逐渐增加，且 3 个品
种对照的褐化率达到 25% ～ 37. 5%。经培养过程中
愈伤组织增殖生长未受明显影响 ; 愈伤组织褐化程度
较为严重的是 10 mg·L － 1柠檬酸处理，与对照褐化率
接近，其生长缓慢甚至趋于死亡。
2. 3 愈伤组织的分化与生根培养
经试验观察发现 2mg·L － 1柠檬酸浓度对愈伤组织
的增殖和分化再生无明显影响，新歌莱德、午夜、纳苏
的胚性愈伤组织分化率分别为 75%、50%、70%，生根
率分别为 85%、70%、80%。本研究建立的草地早熟
禾的高效再生体系，不仅有利于其基因工程改造，也为
472
2 期 草地早熟禾愈伤组织诱导及柠檬酸对其褐化的抑制效应
表 4 不同浓度柠檬酸对草地早熟禾愈伤组织褐化的影响
Table 2 Inhibition effect of different Citric acid concentration on browning of Kentucky bluegrass calli
柠檬酸浓度
Citric acid
concentration /
( mg·L － 1 )
新歌莱德‘Nuglade’ 午夜‘Midnight’ 纳苏‘Nassau’
接种数
Numbers
of callus
褐化数 ( 1 周 )
Numbers of
browning
callusr
( 1 week)
褐化数 ( 2 周 )
Numbers of
browning
callusr
( 2 weeks)
接种数
Number
of callus
培养 1 周
褐化数
Browning
callus after 1
week
培养 2 周
褐化数
Browning
callus after 2
weeks
接种数
Number
of callus
培养 1 周
褐化数
Browning
callus after 1
week
培养 2 周
褐化数
Browning
callus after 2
weeks
0 16 2 4 16 1 4 20 2 7
2 16 0 0 16 0 1 20 0 1
4 16 1 3 16 0 1 20 1 2
6 16 2 3 16 1 2 20 3 5
8 16 2 4 16 2 5 20 4 7
10 16 3 5 16 2 6 20 4 7
图 4 48h 浸泡、无研磨处理下接种方式对
愈伤组织诱导率的影响
Fig． 4 The effect of transferring ways on the
induction rate of callus under soaking for
48h without grinding treatment
其愈伤组织再生体系研究奠定了重要的理论基础。
3 讨论
组织培养中外植体的选择是快速建立再生体系的
关键因素之一。草地早熟禾可以用胚根、胚轴、幼穗、
匍匐茎、茎尖、分生组织、花粉、种子为外植体，其中幼
穗的胚性愈伤组织率在报道中最高，但其取材受季节
限制。因取材方便，本试验采用成熟种子为外植体。
本研究中未经处理的新歌莱德、午夜、纳苏成熟种
子在正常生长状态下的平均发芽率在培养 6d 后达到
最高，分别为 72%、84%、70%，而用水低温浸泡处理
方法可以快速有效地促进种子发芽，这在很多研究报
道中都已被证实。如谷安琳等［26］的研究中，在 25、5、4
和 18℃温度条件下，对根茎禾草羊草和牧冰草种子分
别处理 1 周和 2 周，进行发芽检测，结果表明 : 3 种低
温处理的种子萌发率均有显著提高; 羊草种子在处理
温度为 5、4 和 18℃时萌发率基本一致，显著高于 25℃
处理 ;牧冰草种子随着处理温度的降低，萌发率显著提
高。本研究中低温浸泡 48h 后的种子平均发芽率约为
95% ～ 100%，发芽提前，且出愈率均得到明显提高，可
能是由于浸泡处理不仅打破了种子休眠，而且激发种
子活性，提高种子的发芽率和愈伤组织诱导率。刘雅
丽等［22］用水浸泡处理的方法可以快速有效地促进日
本结缕草种子发芽。方文娟等［25］在对日本结缕草
Zenith 品种浸泡处理时发现，该品种的最佳浸泡时间
为 2 ～ 3d，愈伤组织诱导率增长了 1. 26 倍。而草地早
熟禾 3 个品种的最佳浸泡时间为 2d，随着浸泡时间再
延长，种子因呼吸受阻而生活力下降，愈伤组织诱导率
也相应大大下降。
试验过程中研磨处理时应以种子种皮磨损为宜，
研磨程度过重会导致种子内部受损而破坏种子生活
力，而研磨程度过轻，种皮层并没有受到破坏，种子发
芽率和出愈率也不能得到提高。但是试验中研磨后的
种子愈伤组织诱导率与未研磨处理没有明显差异，这
可能是由于草地早熟禾种子自身种皮薄等生理特性的
原因。
在浸泡 48h 处理下，无论采取机械接种或随机接
种方式接种，研磨处理与未研磨处理所得到的 3 个品
种种子愈伤组织诱导率均无明显差异 ; 而在种子浸泡
48h，未经研磨处理条件下，分别采用随机接种与机械
接种方式所得到的 3 个品种种子愈伤组织诱导率差异
极显著，这表明接种方式对草地早熟禾成熟种子愈伤
组织诱导有很大的影响，而这方面的研究报道极少，也
是本研究的新颖之处。
试验中发现继代时间过短或过长都不利于成熟种
572
核 农 学 报 29 卷
子愈伤组织的分化。随着继代培养时间的延长，愈伤
组织的颜色逐渐变黄，且结构致密，干燥易碎。但是后
期愈伤组织出现不同程度的褐变现象，而愈伤组织的
分化率也随着继代时间的增加先呈上升趋势，然后再
大幅度的下降。这说明愈伤组织继代时间的长短对愈
伤组织的再生有着重要的影响，继代天数过长不利于
愈伤组织的生长，这与杨茹等［27］提出的禾本科草的愈
伤组织再生率随着继代培养时间的延长而降低相一
致，杨茹等［27］以多年生黑麦草的芽尖、根尖、下胚轴、
成熟种子为外植体进行了愈伤组织诱导和分化的研
究，发现继代培养时间对愈伤组织的分化率有很大影
响，成熟种子和下胚轴在继代培养基上继代培养 60d
和 80d 时分化率最高，分别达到 76%和 35%，继代天
数过长不利于愈伤组织的生长。
试验结果表明以柠檬酸作为防褐剂添加在愈伤组
织生长培养基中，可以有效的抑制外植体的褐化现象。
经观察发现，柠檬酸处理后，愈伤组织褐化率降低的同
时，其生长增殖情况未见明显影响，因此选择添加适当
浓度的柠檬酸抑制草地早熟禾愈伤组织褐化现象是一
种可行的方法。王颖等［28］研究了不同浓度的 PVP 和
柠檬酸对烟草愈伤组织褐化的抑制效果，结果表明 :在
愈伤组织的继代培养中，柠檬酸对愈伤组织褐化抑制
效果最好的浓度是 8 mg·L － 1，褐化率为 25%。而周玉
珍等［12］、刘真华等［16］、张淑红等［18］、何松林等［19］等研
究了不同种类的植物激素对冬凌草叶片诱导愈伤组织
及褐化的影响，结果表明培养基中植物激素的种类、浓
度及其组合对愈伤组织增殖及褐变影响较大。适宜浓
度的 2，4-D、IAA 和 NAA 生长素、KT 和 6-BA 细胞分
裂素及 GA3 能不同程度地减轻或抑制褐化，促进愈伤
组织的生长。此外，在组织培养过程中要从多方面预
防外植体发生褐变，首先要尽量减小外植体受伤害程
度，同时保证外植体在空气中暴露的时间不可过长，其
次要考虑选择适当的培养基并及时转移，培养的时间
不可过长等因素。
4 结论
本文分别以草地早熟禾 3 个品种新歌莱德、午夜、
纳苏的成熟种子为材料，研究了愈伤组织诱导率、出愈
时间以及不同浓度的柠檬酸对继代培养中的愈伤组织
褐化和生长状况的影响。结果表明，成熟种子经过低
温浸泡 48h 后，无需经过研磨或其它处理，以随机接种
方式接种，3 个品种愈伤组织诱导率可达最高，分别为
100%、85%、92. 67%。在愈伤组织的继代培养中对愈
伤 组 织 褐 化 抑 制 效 果 的 研 究 中 其 最 佳 浓 度 为
2mg·L － 1，培养 2 周未见有褐化现象，而随柠檬酸浓度
升高褐化率逐渐增加，且对照的褐化率达到 25% ～
37. 5%。试验结果表明 2mg·L － 1柠檬酸浓度对愈伤组
织的增殖和分化再生无明显影响，新歌莱德、午夜、纳
苏的胚性愈伤组织分化率分别为 75%、50%、70%，生
根率分别为 85%、70%、80%。本研究初步探讨了影
响草地早熟禾愈伤组织诱导的因素，解决了草地早熟
禾愈伤组织继代培养中的褐化现象，完善了草地早熟
禾愈伤组织诱导和再生体系建立，为利用愈伤组织再
生体系进行基因工程改造研究奠定了重要的技术基
础。
参考文献:
［1］ Valk P，Ｒuis F，Tettelaar-Schrier A M，Velde C M． Optimizing
plant regeneration from seed-derived callus cultures of Kentucky
bluegrass，the effect of benzyladenine［J］． Plant Cell，Tissue and
Organ Culture，1995，40 ( 1 ) : 101 － 103
［2］ 吕优伟，贺佳圆，白小明，董沁，雷娅伟 ． 9 个野生早熟禾对低温
胁迫的生理响应及苗期抗寒性评价［J］． 草地学报，2014，22
( 2 ) : 326 － 333
［3］ 皮伟，李名扬，郑丽 ． 草地早熟禾组织培养研究［J］． 西南农业
学报，2004，17 ( 2 ) : 267 － 270
［4］ Chai B F，Liang A H，Wang W，Hu W． Agrobacterium-mediated
transformation of Kentucky Bluegrass［J］． Acta Botanica Sinica，
2003，45 ( 8 ) : 966 － 973
［5］ Gao C，Jiang L，Folling M，Han L，Nielsen K K． Generation of
large numbers of transgenic Kentucky blue-grass ( L． ) plants
following biolistic gene transfer［J］． Plant Cell Ｒeports，2006，25
( 1 ) : 19 － 25
［6］ 佘建明，梁流芳，张保龙，何晓兰，陈志一，倪万潮 ． 农杆菌介
导法获得草地早熟禾转基因植株［J］． 江苏农业学报，2005，21
( 2 ) : 102 － 105
［7］ 陈智勇，易自力，蒋建雄，覃静萍，刘清波，蔡能，唐小艳，孙
鏖，草地早熟禾愈伤组织遗传转化受体系统的建立［J］． 中国草
地学报，2007，29 ( 2 ) : 54 － 58
［8］ 高丽美 ．草地早熟禾胚性愈伤组织的诱导和植株再生体系的建
立［J］．山西师范大学学报: 自然科学版，2007，21 ( 1 ) : 99 － 102
［9］ 雷炳琪，代亮，柳玉霞，刘洁，徐筱，徐倩，徐吉臣 ． 不同草地
早熟禾品种愈伤组织再生体系研究［J］． 分子植物研究，2012，
10 ( 6 ) : 751 － 755
［10］ 刘庆昌，吴国良 ． 植物细胞组织培养［M］． 北京 : 中国农业大学
出版社，2003
［11］ 杨雪，董立峰，付金峰郑国勇，王凤宝 ． 低酚酶活性选择对小麦
面粉褐变的影响［J］．核农学报，2014，28 ( 5 ) : 851 － 860
［12］ 周玉珍，张雨清 ． 金叶风箱果初代离体培养中影响外植体褐化
的因素［J］．植物生理学通讯，2001，37 ( 2 ) : 122
［13］ 董浩，夏光利，毕军，朱国梁，史桂芳 ． 玉米幼嫩叶片愈伤诱导及
分化过程优化的研究［J］．核农学报，2013，27 ( 9 ) : 1253 － 1257
［14］ 李东杰，魏景芳，鲁绍伟，张进献，胡玉霞 ． 不同植物激素对冬
凌草愈伤组织增殖及褐化的影响［J］． 水土保持研究，2006，13
( 3 ) : 149 － 150
［15］ 李素娟，樊秀霞，王华，邵健丰，赵辉，解芳，钱前，陶跃之 ．
672
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2015，29 ( 2 ) : 0270 ～ 0277
水稻不同品种组培再生和转基因频率研究［J］． 核农学报，
2013，27 ( 12 ) : 1817 － 1827
［16］ 刘真华，葛红，郭绍霞，刘洪涛，曹灿景，周玉杰，李秋香，蝴
蝶兰组织培养中的褐化控制研究［J］． 园艺学报，2005，32 ( 4 ) :
732 － 734
［17］ 刘兰英 ． 薄壳香核桃组培中的褐化及防止措施研究［J］． 园艺学
报，2002，29 ( 2 ) : 171 － 172
［18］ 张淑红，王蒂，王清 ． 影响马铃薯叶肉原生质体褐化的因素及
对其褐化和分裂的作用［J］．中国马铃薯，2004，18 ( 2 ) : 77 － 81
［19］ 何松林，陈笑蕾，陈莉，孔德政，任凝辉 ． 牡丹叶柄离体培养中
褐化防止的初步研究［J］．河南科学，2005，23 ( 1 ) : 47 － 50
［20］ Murashige T， Skoog F． Arevisedmedium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures［J］． Physiologia Plantarum，
1962，15 ( 3 ) : 473 － 497
［21］ 齐春辉，韩烈保，梁小红，曾会明，刘君 ． 以基因枪法转化日本
结缕草获得转基因植株［J］．北京林业大学学报，2006，28 ( 3 ) :
71 － 75
［22］ 刘雅丽，费永俊，曾会明 ． 影响日本结缕草成熟种子愈伤组织诱
导率和出愈时间的相关因子研究［J］． 长江大学学报: 自然科学
版，2010，7 ( 1 ) : 63 － 66
［23］ 曾升坚，卞建春，方钲，张冬霞，邹新海 ． 多年生黑麦草成熟种
子愈伤组织的诱导和植株再生研究［J］． 安徽农业科学，2009，
37 ( 35 ) : 17343 － 17345，17364
［24］ Lee W L，Chan L K． Establishment of Orthorsiphon stamineus cell
suspension culture for cell growth［J］． Plant Cell，Tissue and Organ
Culture，2004，78 ( 2 ) : 101 － 106
［25］ 方文娟，韩烈保，张振环，曾会明 ． 草地早熟禾悬浮体系的建立
及悬浮过程中细胞形态观察［J］．生物技术通报，2006，39 ( 2 ) :
85 － 87
［26］ 谷安琳，易津，Ｒoman H，Zbigniew B，低温对羊草和牧冰草种
子萌发率的影响［J］．中国草地，2005，27 ( 2 ) : 50 － 54
［27］ 杨茹，袁庆华，曹致中 ． 2，4 － D 和 6 － BA 对黑麦草不同外植
体愈伤组织诱导与分化的影响［J］． 中国草地学报，2008，30
( 4 ) : 34 － 39
［28］ 王颖，刘仁祥，聂琼，李彦竹，陈春艳，李全鑫，丁飞，程俊，
何文伟 ． 不同防褐剂对烟草愈伤组织培养褐化的抑制效应［J］．
贵州农业科学，2012，40 ( 1 ) : 26 － 27
Callus Induction and Inhibition Effect of Citric Acid on
Browning of Kentucky Bluegrass Callus
DAI Xiaomei SUN Zhenyuan HAN Lei
( State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding /Ｒesearch Institute of Forestry，Beijing 100091 )
Abstract: Mature seeds of three varieties of Perennial ryegrass ( Lolium perenne L．) ‘Nuglade’，‘Midnight’，
‘Nassau’were used to investigate the effect of immersion，grinding and transferring way on the callus induction rate and
formation time and the inhibition effect of different citric acid concentration on browning of Kentucky bluegrass callus．
The results showed that soaking for 48h was in favor of callus induction，and the average callus induction rate gradually
decreased with prolonged immersion，while the callus formation time of three varieties were pushed back． Under soaking
for 48h treatment，whether inoculated by mechanical or random transferring way，the average callus induction rate of
three varieties seeds was no significant different． Under soaking for 48h treatment without grinding treatment， the
average callus induction rate of three varieties seeds under random and mechanical transferring way was much
significantly different． In addition，the results showed that the inhibition effect of 2mg·L － 1 citric acid was best and there
was no browning phenomenon during subculture for 2 weeks． While the browning rate increased with the citric acid
concentration increased，the browning rate of the control was 25% to 37. 5% ． The experiment observed no significant
effect of 2mg·L － 1 citric acid concentration on the proliferation， differentiation and regeneration of callus． The
differentiation rate of embryogenic callus of‘Nuglade’，‘Midnight’，‘Nasu’was 75%、50%、70%，and the rooting
rate was 85%、70%、80% ． This study explored the impact factors of Kentucky Bluegrass callus induction，solved the
browning problem in the subculture，improved callus induction and regeneration system of Kentucky bluegrass and laid
an important foundation for genetically engineered technology research used callus regeneration system．
Keywords: kentucky bluegrass，tissue culture，citric acid，browning
772