全 文 ：收稿日期： 2013–03–06　　　　接受日期： 2013–05–02
作者简介： 高蓝(1964 ~ )，女，教授，研究方向为植物分子生物学。
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: gaolangdpu@yahoo.cn
热带亚热带植物学报　2013， 21(5)： 439 ~ 445
Journal of Tropical and Subtropical Botany
栀子(Gardenia jasminoides)为茜草科(Rubiaceae)
栀子属植物，原产于亚洲，有上千年的种植历史。
栀子果实被用于提取染料和食用色素，在中国也是
传统的中草药。藏花素、藏花酸和京尼平苷是栀子
果实中的主要次生代谢产物[1]。藏花酸是一种阿朴
类胡萝卜素，具有 C20 骨架，两端各有 1 个羧基。藏
花素是藏花酸的单或双糖苷类物质，其中藏花酸的
二龙胆糖苷 , 即藏花素-1 (Crocin-1), 是栀子果实中
的主要藏花素成分。栀子果实的橙色或红色主要
来自藏花素和藏花酸，藏花素和藏花酸也是栀子中
的两种主要活性成分[2–3]。
栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析
高蓝*, 朱碧云
(广东药学院基础学院，广州 510006)
摘要： 为探讨栀子(Gardenia jasminoides)果实中藏花素的合成机理，克隆了栀子类胡萝卜素生物合成的关键酶八氢番茄红素
合成酶(GjPSY)基因的全长 cDNA。结果表明，推导的 GjPSY 氨基酸序列与双子叶植物来源的 GjPSY 亲缘关系较近。采用
HPLC 检测栀子果实中的藏花素-1 含量为(3.96 ± 1.48) mg g–1，在叶片中未检出。通过 RT-PCR 分析表明，GjPSY 在栀子叶片
和果实中均有表达，且表达水平一致。因此推测，GjPSY 的转录水平与果实中藏花素-1 的合成无关。
关键词： 栀子； 阿朴类胡萝卜素； 藏花素； 八氢番茄红素合成酶； 基因表达
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2013.05.010
Isolation and Expression of Phytoene Synthase Gene in Gardenia jasminoides
GAO Lan*, ZHU Bi-yun
(School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)
Abstract: In order to understand the synthesis mechanism of crocin in Gardenia jasminoides fruits, the full-length
cDNAs of phytoene synthase gene GjPSY from G. jasminoides were cloned. The results showed that the deduced
amino acid sequence of GjPSY had close relation with those from dicotyledonsous plants. The content of crocin-1
in fruits was (3.96 ± 1.48) mg g–1 by HPLC, while crocin-1 was not detected in leaves. It was revealed that
crocin-1 exclusively accumulated in fruits. The RT-PCR analysis revealed that the expression of GjPSY in fruits
was not differences from that in leaves. Therefore, it was suggested that the crocin synthesis in G. jasminoides
fruits had not correlation with transcription level of GjPSY gene.
Key words: Gardenia jasminoides; Apocarotenoids; Crocin; Phytoene synthase; Gene expression
类胡萝卜素多为 C40 骨架化合物，植物、真菌
和细菌中的红、黄和橙色多是由类胡萝卜素产生。
在类胡萝卜素合成途径中的第 1 个 C40 化合物是
八氢番茄红素，其合成酶——八氢番茄红素合成
酶(PSY, Phytoene synthase)是类胡萝卜素合成途径
中的 1 个关键酶，它将两个 C20 化合物香叶基香叶
基 焦 磷 酸(GGPP, Geranylgeranyl pyrophosphate)分
子催化缩合为八氢番茄红素(图 1)。八氢番茄红素
合成酶目前已从多种植物中分离获得，其基因 PSY
也已克隆得到，如辣椒(Capsicum frutescens)[4]、拟
南芥(Arabidopsis thaliana)[5]、玉米(Zea mays)[6]、 柑
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橘(Citrus sinensis)[7]、中粒咖啡(Coffea canephora)[8]
等。同时，有些植物中含有单一的 PSY 基因，有
些 则 含 有 多 种 PSY 基 因，如 番 茄(Lycopersicum
esculentum)[9–10]、木 薯(Manihob esculenta)[11]和 一 些
禾本科(Poaceae)植物有 2 种 PSY 基因[12]；禾本科的
水 稻(Oryza sativa)、高 粱(Sorghum vulgare)和 玉 米
中含有 3 种 PSY 基因[13]。在藏红花(Crocus sativus)
中，藏花酸和藏花素由类胡萝卜素类的玉米黄素衍
变而来，其中藏花酸是由玉米黄素双加氧酶裂解玉
米黄素后再经氧化产生[14]。在栀子中藏花素是通
过糖基转移酶将藏花酸糖苷化产生[15]。
栀子果实中能积累藏花酸和藏花素，但是对其
生物合成途径中的相关酶类尚未明晰，对八氢番茄
红素合成酶的研究有助于了解类胡萝卜素生物合
成的调控机理，分离藏花酸和藏花素合成过程中的
相关酶对了解其合成及合成的调节机理具有重要
意义。本研究克隆了栀子类胡萝卜素合成的关键
酶八氢番茄红素合成酶基因(GjPSY)的全长 cDNA，
测定了栀子果实和叶片中的藏花素-1 的含量，并首
次报道了 GjPSY 在栀子叶片和果实中的表达水平，
为通过基因工程方法提高栀子中藏花酸和藏花素
类物质含量提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
栀子(Gardenia jasminoides)植株培养于广东药
学院。采集栀子成熟叶片和花后 16 周的栀子果实，
果肉为橙色。所有材料贮存于 –80℃。CreatorTM
SMARTTM cDNA 文 库 构 建 试 剂 盒 购 自 Clontech
公 司。Primescript one step RT-PCR 试 剂 盒 购 自
TaKaRa 大连公司。藏花素-1 (Crocin-1)的对照品
购于 Sigma-Aldrich 公司。乙腈、甲醇为色谱纯，其
它生化试剂等为分析纯。
1.2 藏花素-1含量的测定
以改良的 HPLC[16]测定栀子叶片和果实中藏
花素-1 (Crocin-1)的含量。叶片和果实在液氮中
研磨后以 50% (V/V)的甲醇 -水溶液提取，在超声
处理 30 min 后以 10000 ×g 离心 10 min，取上清液
在 –20℃下贮存。HPLC 分析时，上清液以 0.45 μm
滤 膜 过 滤，以 DiamonsilTM C18 (2) 柱(250 mm ×
4.6 mm, 5 µm)(Dikma 公司，中国)分析， 梯度洗脱。
仪器为 Waters 2995 HPLC 仪(Waters 公司 , 美国)，
配备 2996 光电二极管阵列检测器检测。数据分析
图 1 Crocin 的生物合成途径[16]。IPP：异戊烯焦磷酸 ; DMAPP：二甲基丙烯焦磷酸； GPP：香叶基焦磷酸； GGPP：香叶基香叶基焦磷酸。
Fig. 1 Biosynthesis pathway of crocin[16]. IPP: Isopentenyl diphosphate; DMAPP: Dimethylallyl diphosphate; GPP: Geranyl diphosphate; GGPP:
Geranylgeranyl pyrophosphate.
第5期 441
以 Empower 2 软件完成。洗脱条件为： 10% ~ 20%
乙腈溶液(乙腈 / 水，V/V)， 0 ~ 20 min； 20% ~ 50%
乙腈溶液，20 ~ 25 min，流速为 1 mL min–1，检测波
长 440 nm。目标峰通过与藏花素-1 对照品的保留
时间和吸收光谱的比较而确定。通过标准曲线确
定藏花素-1 的含量，共进行 3 次重复实验。
1.3 GjPSY基因的克隆
以 CTAB (Hexadecyl trimethyl ammonium
bromide)法[17]提 取 栀 子 果 实 中 的 总 RNA。 按 照
CreatorTM SMARTTM cDNA 文库构建试剂盒的说明
书从总 RNA 构建栀子果实的 cDNA 文库。将获得
的 SMART 双链 cDNA 克隆接入 pDNR-LIB 载体
并转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH-5α。
根据植物八氢番茄红素合成酶基因 PSY 的保
守区设计简并引物，F1：5′-ATHTGGGCNATHTAY-
GTNTGG-3′ 和 F2：5′-RAARTTRTTRTARTCRTTN-
GCYTC-3′，从 cDNA 文库的细菌裂解液中扩增 PSY
基因。获得了 GjPSY 基因的中间片段，将该片段
回收并测序，命名为 GjPSY-M。根据 GjPSY-M 片
段序列分别设计 5′ 端特异引物 GSP1：5′-GCGATA-
CAACAATAGCGATGCCCATACAG-3′ 和 3′ 端 特
异 引 物 GSP2：5′-GTGCAGGAGAACGGATGAGC-
TGGTT-3′，配合文库构建试剂盒提供的 5′ 端和 3′
端的质粒检测通用引物，采用 RACE 方法从 cDNA
文库中获得 GjPSY 基因的 5′ 端和 3′ 端序列。获得
的片段分别命名为 5′GjPSY 和 3′GjPSY，将片段回收
和测序并进行序列分析，与 GjPSY-M 拼接出 GjPSY
的全长 cDNA。根据全长 GjPSY 序列，经过 BLAST
比对和开放阅读框(ORF)序列分析，分别设计引
物 F1：5′-CGCCATTAATATGTCTGTCGCTTTGC-
TATGGGTTG-3′和 F2：5′-ATGCTCGAGGGCCTT-
TGCTAGTGGAGATGATGTTCT-3′，从 cDNA 文库
的细菌裂解液中扩增得到 GjPSY 的 ORF 序列。
1.4 GjPSY基因的表达分析
从栀子果实和叶片中分别提取总 RNA，采用
Primescript one step RT-PCR 试 剂 盒 进 行 RT-PCR
分析，反应所用 GjPSY 特异引物分别为 F1：5′-GAC-
ATACTTGCTGGAAAGGTCAC-3′ 和 F2：5′-GCTA-
GTGGAGATGATGTTCTTGG-3′。以组成性表达的
RPS25-1 基因(40S 核糖体小亚基蛋白 25-1 基因，
GenBank 登录号： GU797554)为内参，RPS25-1 基
因的特异引物分别为 F1：5′-CAGAAGAAGAAGA-
AGTGGAGCAA-3′ 和 F2：5′-TGGTAGCTCTGGT-
GTATATCTGC-3′。RT-PCR反应程序为： 95℃ 2 min，
接着 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共 30 次循环，
最后 72℃延伸 7 min。扩增产物用 1.2% 琼脂糖凝
胶电泳检测。
2 结果
2.1 栀子叶片和果实中藏花素-1的含量
使用甲醇-水溶液提取栀子叶片和果实中的藏
花素-1，提取液用于 HPLC 分析。通过与 crocin-1
对照品的保留时间和吸收光谱进行比较，在果实
样品中观察到 crocin-1 峰，在叶片样品中未观察到
crocin-1 峰(图 2)。同时，检测到果实中 crocin-1 的
含量为(3.96 ± 1.48) mg g–1。
2.2 GjPSY 基因的克隆
为 了 克 隆 GjPSY 基 因，构 建 了 栀 子 果 实 的
cDNA 文库，以简并引物从 cDNA 文库中扩增得到
GjPSY 基 因 cDNA 的 中 间 片 段 GjPSY-M，长 度 为
688 bp。接着通过 5′ RACE 获得了长度为 1596 bp
的 5′GjPSY 片段；通过 3′ RACE 获得了长度为 956 bp
的 3′GjPSY 片段。将 5′GjPSY、GjPSY-M 和 3′GjPSY
共 3 个片段序列进行拼接，得到全长 cDNA，长度
为 1876 bp。根据全长序列从 cDNA 文库中扩增得
到 ORF 序列(图 3)；经序列分析，此全长 cDNA 含
有 1314 bp 的 ORF，5′ 端 非 翻 译 区 为 393 bp，3′
端非翻译区为 169 bp，命名为 GjPSY (GenBank 登
陆号： HQ599860)。预测 GjPSY 基因编码的蛋白质
含有 437 个氨基酸，分子量为 49.3 kDa，等电点为
8.82。
2.3 GjPSY的序列分析
GjPSY 的氨基酸序列经 BLAST 分析，结果表
明，GjPSY 与多种植物的八氢番茄红素合成酶的
序列相似，它们均含有两个保守的富含天冬氨酸的
模体 DXXXD。这个模体被认为可通过 Mg2+ 结合
于底物的焦磷酸基团，在八氢番茄红素合成酶催化
两个 GGPP 分子缩合的反应中发挥重要作用[18]。
采 用 ClustalW2 软 件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/
index. html)对相似度较高(相似度为 55% ~ 93%)的
18 条来自多种植物的八氢番茄红素合成酶序列进
高蓝等：栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析
442 第21卷热带亚热带植物学报
行同源进化比对，采用 Mega 4.1 软件构建氨基酸
序列的 NJ (Neighbor-joining)系统进化树，用重复
1000 次的自展支持率(Bootstrap)检验各分支的置
信值(图 4)。结果表明，GjPSY 与中粒咖啡的 PSY
最为相似，与番茄和拟南芥 PSY 的相似度均大于
来自禾本科的玉米及水稻的。而在与玉米和水稻
的各 3 种 PSY 的比对中可知，GjPSY 与 PSY1 最
为相似，而与 PSY3 关系最远。
2.4 GjPSY的表达分析
分别提取栀子叶片及果实中的总 RNA，采用
RT-PCR 法分析 GjPSY 的表达水平(图 5)。以组成
性表达的 RPS25-1 为内参。结果表明，GjPSY 的
转录水平在叶和果实中表现一致。
3 讨论
类胡萝卜素是异戊烯类色素，在植物的光合
作用和光保护作用中发挥作用，是人体中重要的营
养物质，是维生素 A 的前体。由类胡萝卜素衍生
的阿朴类胡萝卜素，如藏花酸和藏花素既可作为色
素使用，也具有药用作用。有研究表明，藏花素和
藏花酸具有防止动脉粥样硬化、抗炎、抗细胞增殖、
预防视网膜变性、神经保护作用和改善胰岛素抵抗
等作用。八氢番茄红素合成酶是类胡萝卜素生物
合成中的第一个限速酶，PSY 基因在单子叶和双
子叶植物中广泛存在基因复制现象，这个基因家族
中各个基因的表达往往具有组织特异性，或对环境
胁迫等因素产生应答。目前对多种植物的 PSY 基
因的分离、表达及转基因植物的分析研究方兴未
艾[19–22]。
在柑橘果实中，PSY 基因随着果实的成熟表
达上调，不同品种上调幅度不同[7]，可见柑橘的 PSY
图 2 栀子果实的甲醇-水提取液的 HPLC 图谱。主峰是 crocin-1, 检测波长 440 nm，插图为 crocin-1 的在线吸收光谱。A: 果实；B: crocin-1 对照品。
Fig. 2 HPLC of methanol-water extract from Gardenia jasminoides fruits. The main peak is crocin-1 monitored at 440 nm of wave length. A: Fruits; B:
Standard for crocin-1. Illustrations are showing online absorption spectrum of crocin-1.
图 3 栀子 GjPSY 基因的 PCR 扩增图谱。M: DL 2000 marker; 1: GjPSY-
ORF。
Fig. 3 Amplification of GjPSY gene. M: DL 2000 marker; 1: GjPSY-
ORF.
第5期 443
表达模式与 GjPSY 不同。番茄中有两个 PSY 基
因：PSY1 和 PSY2，它们均在幼苗、成熟叶片及果
实中表达。PSY1 在幼苗和果实成熟后期的表达
高于 PSY2，而 PSY2 主要在成熟叶片中表达[23]，推
测 PSY1 是由 PSY2 经基因扩增产生的平行同源
基因[24]。GjPSY 的氨基酸序列与番茄的 PSY2 的
氨基酸序列较相似(相似度达 81%，与 PSY1 的相
似度为 75%)，并且在果实中的表达水平与叶中相
近，提示它不是与果实成熟相关的基因。两个番茄
PSY1 突变体，一个是 W180* 无义突变，一个是一
个氨基酸替换突变体 P192L，对它们果实中的类胡
萝卜素的含量和比例进行了分析[25]。W180* 的果
实为黄色果肉，直到成熟颜色都不发生变化，代谢
分析表明在果实中没有类胡萝卜素，其 PSY1 蛋白
失去活性，证明 PSY1 是唯一在果实成熟过程中发
挥作用的 PSY。P192L 果实也为黄色，直到破色期
后的第 3 天才转为红色，这是由于八氢番茄红素合
成的减少造成番茄红素和 β- 胡萝卜素的积累延迟，
其 PSY1 蛋白的活性被抑制。与 GjPSY 的氨基酸
序列比对表明，W180* 发生突变的氨基酸对应于
GjPSY 的 W204，P192L 突变体的氨基酸相当于
GjPSY 中的 P216，这两个氨基酸均在两个 DXXXD
模体之间，且在多种植物的 PSY 中高度保守。
木薯中的两个 PSY 基因在不同组织中的表达
也不相同，叶中 PSY1 和 PSY2 均有高水平的表达，
在根和花药中的表达水平均较低，但根中 PSY2 的
表达是 PSY1 的 10 倍[11]。另外，木薯的 PSY1 可对
高盐胁迫响应[11]，PSY2 中的单碱基突变导致的单
氨基酸突变(A191D)可使木薯根中的类胡萝卜素含
量提高 20 倍[26]。A191 氨基酸位于两个 DXXXD
图 4 来自不同植物的 18 个 PSY 的亲缘关系图谱。节点上的数字为重复 1000 次的自展支持率(Bootstrap)。
Fig. 4 Phylogeny of 18 PSY amino acid sequences from different plants. Bootstrap support values (1000 replicates) are shown at nodes.
图 5 栀子叶和果实中 GjPSY 基因的转录水平
Fig. 5 Transcription expression of GjPSY gene in Gardenia jasminoides
leaves and fruits
高蓝等：栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析
444 第21卷热带亚热带植物学报
模体之间的较保守的区域。本研究中分析的来自
12 种植物的 18 条 PSY 氨基酸序列中 A191 均为
丙氨酸。GjPSY 的氨基酸序列与木薯 PSY2 的相
似度为 76%，与 PSY1 相似度为 74%，所以更接近
PSY2。但从以上与番茄和木薯的序列比对及表达
分析还难以明确判断 GjPSY 的功能。
玉米、高梁、小麦和水稻各有 3 个 PSY 基因，
都编码有功能的八氢番茄红素合成酶。小麦中的
3 个 PSY 基因中，只有 PSY1 与面粉的黄色素含量
有关，PSY2 只获得了部分序列，PSY3 的启动子
区存在可应答脱落酸 ABA 的顺式作用元件。其
PSY1 的表达与籽粒中类胡萝卜素的积累正相关，
PSY2 则与叶中类胡萝卜素的合成相关，在叶中表
达最多[13,27]。PSY3 在未受到胁迫的叶中的表达比
PSY1 和 PSY2 低，在根中稍多一点。在外源 ABA
且受胁迫的根中，3 种 PSY 的表达均有增加，以
PSY3 的增加最多，即 PSY3 对 ABA 的反应远大于
PSY1 和 PSY2[27]。与小麦的比较分析也难以判断
GjPSY 的种类和作用。玉米的 PSY1 主要在叶片和
胚乳中表达，并与胚乳中类胡萝卜素的积累呈正相
关关系；其 PSY2 的表达则与光诱导的脱黄化过程
正相关；PSY3 在根和胚乳中大量表达，可被干旱、
高盐和外源 ABA 处理所诱导[6]。水稻胚乳中不含
类胡萝卜素，3 种 PSY 基因在胚乳中都无表达；而
在进行光合作用的组织中，3 种基因都有表达[13]。
水稻的 OsPSY1 和 OsPSY2 在根和叶中的表达均高
于 OsPSY3，其中 OsPSY1 和 OsPSY2 均受光调控，
OsPSY1 表达最多。OsPSY3 不被光诱导但在根中
的表达可被高盐或干旱所诱导[13]。通过分析水稻、
玉米和拟南芥的 PSY 基因的结构及它们的启动子
区，认为 OsPSY1 是单子叶和双子叶植物的古老
PSY 基因的遗存，OsPSY2 和 OsPSY3 均是 OsPSY1
的平行同源基因[13]。因此，我们推测 GjPSY 相当于
玉米和水稻中的 PSY1。
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