全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，14(5)：374—381
Joumal ofTropical and SubtropicalBotany
农杆菌介导佛手遗传转化主要影响因素的研究
周春丽 ，一，郭卫东 ，路 梅 ，陈 瑾 z，李玉萍 ·
(1．江西科技师范学院生命科学院，南昌330013；2．浙江师范大学环境 生命科学院，
浙江 金华 321004；3．西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 7121oo)
摘要：采用根癌农杆菌介导的佛手叶盘转化法，在建立转海藻糖合酶基因 (TPS)佛于体系过程中，对影响农杆菌转化
频率的各种因素进行了研究。结果表明，佛手叶盘需在黑暗条件下 MT培养基上预培养 2—3 d， 农杆菌共培养 3 d较
合适 ；农杆菌菌液浓度 OD6o约为 0．6—0．8，感染时间 20 min；抑制农杆 菌生 长的抗乍索浓度 以头孢霉素 (Cef)
250 mg L 和羧苄青霉素 (Cb)250 mg L。且延迟筛选时问4 d最好；共培养基中添加 100 ixmol／L乙酰丁 香酮 (AS)和
400 mg L 半胱氨酸 (L—Cys)对佛手遗传转化有明显的促进作用。经 GUS报告基因和 PCR技术检测，初步证实
基因己整合到佛手基因组中，且 GUS报告基因瞬时表达率为5．9％。
关键词：佛手；农杆菌；遗传转化；海藻糖合酶基因 (TPS)
中图分 类号 ：Q813 文献标识码 ：A 文章编号 ：1005—3395(2006)05～0374—08
Factors Efecting the Transformation of Citrus medica L．
var．sarcodactlis M ediated by Agrobacterium
ZHOU Chun一1 i 1,3 GU0 We l—dong ， LU Me i ， CHEN 儿 n ， LI Yu—P ing
(1．Colege of Sciences，Jiangxi Nornwl Universit) of Science and Technology，Nanchang 33001 3，China；
2．A cademy ofL and Environment Science，Zh iang Normal Universit)，Jinhua 321004，China：
3．CoHege ofHorticuhure，Northwest Agricultural and Fore 廿University,Yangling 712100，China)
Abstract： Agrobacterium。mediated transformation of Citrus medica L． var． sarcodactlis was perform ed by leaf
disc． The binary vector harbors the gene of interest TPS and N}’rII gene driven by CaMV 35S promoter． The
presence of Z gene integration in the genome was detected and confirm ed by G US assay and PCR．respectively．
Transform ation parameters optimized were bacterial concentration， pre-culture period， immersion time，
concentrations of antibiotics(cefotaxime，Cef and carbeniciline，Cb)and reagents(acetosyringone，AS and
L—cysteine，L-Cys)．Results were obtained based on the percentage of GUS positive transient expression．A．
tumefaeiens strain LBA4404 at OD6o0 0．6 showed the highest virulence on the leaf explants of C．medica with
20 min of immersion． Two to three days of pre-culture on MT medium in dark and 3 days of co-cultivation were
optimum for e medica． The mixture containing 250 ml L一 Cef and 250 ml L一’Cb gave the highest rate of callus
induction for e rnedica．Addition of 1 00／xmol／L AS and 400 mol／L L—Cys enhanced the transform ation efi ciency
ofC．medica．Under the optimal condition、the percentage of GUS transient expression was 5．9％．
Key words：Citrus medica L．var．sarcodactlis；Agrob(wterium；Genetic transform ation；Trehalose synthase gene
收稿 日期 ：2005—12—16 接受 日期 ：2006—04—17
基金项目：浙江省科技计划项II(2003C32043)资助
通讯作肯 Corresponding author
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第 5期 周春丽等：农杆菌介导佛手遗传转化主要影响因素的研究 375
佛手(Citrus medica L．var．sarcodactylis(Noot．)
Swingle)，为芸香科柑桔属枸橼类植物香橼的变种，
常绿小乔木或灌木。我国的浙江、广东、广西、云南、
四川等地都有零星栽培，其中在浙江金华种植面积
最大，且品质最佳。佛手是我国特有的一种重要赏
果植物，同时又具有良好的药用价值，其根、茎、叶、
花、果均可入药，具有舒肝理气、和胃止痛、祛湿化
痰、抗肿瘤和提高抗应激能力等功效，是传统的名
贵中药【1，开发利用前景广阔。
但是，目前我国佛手品种少，其抗寒力较差，严
重制约了佛手产业的发展。在浙江，佛手必须在塑
料大棚或日光温室内才能安全越冬，这无疑增加了
生产成本。此外，金华现有的佛手品种虽然比广佛
手、川I佛手株形矮小，但还不能满足培育袖珍型佛
手盆景精品的要求。另外，佛手果实贮存过程中失
水萎蔫的现象也有待改善。佛手是由子房壁发育成
果实，不产生种子，进行常规的杂交育种很困难，通
过传统的杂交育种方法改良性状难度较大，而突变
育种又具有盲目性，很难选育出同时改良上述三种
性状的新品种。现今，基因工程已经广泛应用于多
种作物的性状改良，是一种有效的定向改良性状的
技术手段【2_31。海藻糖合酶基因是一种抗寒基因，一
旦整合到佛手基因组中，通过海藻糖合酶基因的表
达使佛手植株内大量累积海藻糖，从而能提高植株
的抗寒能力，当累积量足够大时又能阻碍植物的旺
盛生长，达到矮化目的【4]。同时海藻糖的累积还能使
植物器官离体后不易失水萎蔫，有利于贮藏保鲜。
目前，佛手再生体系和基因转化的研究报道很
少，在国内，仅有广佛手【5j和金佛手组织培养旧及利
用基因枪方法探索转化金佛手171的研究报道。在国
外，尚未见研究报道。本研究利用海藻糖合酶基因
探讨农杆菌介导转化佛手的可行性，对影响农杆菌
介导的佛手遗传转化条件进行初步探索，以期为最
终能建立佛手的转基因技术体系和转基因育种研
究奠定基础。
1材料和方法
1．1植物材料
金 华佛 手(Citrus medica L．var．sarcodactylis
(Noot．)Swingle)，取 自浙江师范大学生化学院实验
材料基地和张锦林佛手基地。取健康幼嫩的佛手叶
片作为外植体。
1．2实验菌株
农杆菌 Agrobacterium tumefaciens LBA4404，
由海南热带农业科学院生物技术研究所提供，含有
目的 TPS基因、 ，(新霉素磷酸转移酶)基因
(抗卡那霉素，Km )，NOS基因、GUS(B一葡糖苷酸
酶)报告基因。以上基因的表达由CaMV35S启动
子调控 。
1．3实验设计
1．3．1菌种的活化和预处理
取出在一70℃下保存的农杆菌菌株 LBA4404，
涂平板接种于附加 50 mg L Km 的 yEp[sJ(Yeast
Extract Peptone)平板上，在 28℃下 倒置培养 36 h，
待菌落长出，挑取一个单菌落，接种于 30 ml附加
50mgL- Kin的 YEP液体培养基中，28~C下置摇床
上震荡培养 (200 r min～，16—20 h)，进行预活化。取
100 l菌液接种于 30 ml相同培养基中，在相同条件
下培养至对数生长期。取对数生长期菌液在室温下
5 465 xg离心 10 min，弃上清液，以 MT(Murashige
and Tucker)[91液体培养基 (不加琼脂，pH=7)重悬
菌体 (1：100)，用于转化。
1．3．2佛手叶预培养
把佛手叶用 自来水漂沈 ，70％乙醇消毒 30 s，
0．1％的升汞消毒 20—25 min，无菌水冲洗 3—4遍，剪
成约 0．5 cm x 0．5 cm大小的叶盘，接种于愈伤组织
诱 导培养基 MT(含 1．5 mg L 2．4一D，1．0 mg L
NAA和 0．4 mg L 6-BA)上预培养 0 d、1 d、2 d、
3 d、4d。预培养条件：28℃，暗培养。
1．3．3农杆菌介导佛手过程
设置不同浓度的农杆菌和侵染时间 (图 1)，其
问不停摇动。将侵染后的外植体取出，用无菌滤纸
将多余菌液吸干，移至诱导培养基 MT上，进行共
培养 ，用 附加有 500 mg L一头孢 霉素 (Cef)和
400 mg L 羧苄青霉素 (Cb)的无菌水洗 3—4遍，再
用无菌滤纸吸干残留液体，最后分别转接到附加不
同浓度的Cef和 Cb的 MT培养基中，进行抑菌处
理，最后转移到筛选培养基 (MT+50 mg L Km+)上
培养 2周。农杆菌介导的佛手转化过程见图 1。
1．3．4乙酰丁香酮(AS)和半胱氨酸 (L—Cys)的添加
AS的添加设计：YEP+100 Ixmol／L AS，MT；
YEP+1 00 txmol／L AS， MT+1 00 Ixmol／L AS； YEP。
MT+100 Ixmol／L AS；设空白对照 YEP，MT。
L—Cys的添加设计 ：MT+400 mg L～L．Cys；设
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376
空白对照 MT。
菌种的活化和预处理
佛手叶的预培养
农杆菌侵染
其培养
抑菌抗生素处理
筛选培养
参数设定
YEP+i00 Ⅱmol／L AS EF
预培养时间( ： - ．1、2、3、4
馒染时间(mit+：5、l0、 2o、,-,q、
侵染浓度(。D 、：n 3、0．5、u 、 ll_·、1 1
第 14巷
行适当 进，将离心转速设为 24 336 xg，65℃水浴
保 温 时 设 为 40 min。PCR (Polymerase chain
reaction)特异性引物为p l：5’．GCGGATCCATGGC—
TCCTCCCCACCAG-3’：p2：5’-CCGGGCCCTC A-
TCCCTGCACATGCAGTTCG．3’。 反 程 序 为 ：
94℃预变 性5 rain；94℃变性 l rain，58℃退火
l rain，72℃延伸 2．5 rain，循环 35次；72℃延伸
5 rain，4℃保存。卒白对照为不加模板 DNA。
M
其
T
培养
M
吲
T+ L-C
=。 ：、= 、 2
结果和分析 ys(400 mgL一。) ， I ’／ 0 0
MT+Cef I500 mg L一‘)
PdT+Cb (5(j0 mg L‘1
MT+Cef(250 mg L- )+Co(250 mg L『 )
抑菌处理时间(d)：2、4、f=1
MT+50 mg L一 Ks
抗性愈伤组织诱导捡测
I转化参数仇化步骤
Fig．1 Procedure for screening optimum parameters
孝『l体字示最优参数，各步最优参数均作为后步实验参数。The
optimum parameters are presented in bold which are used for the
following steps．
1．4抗性愈伤组织诱导检测
1．4．1抗性愈伤组织观察
统计分析叶盘的愈伤组织诱导 农”1 被
抑制的情况。愈伤组织质地疏松，黄绿 儿；， 曲
者是抗 Km，反之，则为不抗 Km。
1．4．2 GUS报告基因活性的检测
G 组 织 化 学 染 色 液 膦 峻 缓 冲 液
1 00 mmol／L， Na2EDTA 1 0 mmol／L， K3Fe(CN)6
0．5 mmol／L，K4Fe(CN)6 0．5 mmol／L，TritonX-100
0．1％ ，MeOH 10％ ，X-gluc 0．5 mg ml。。
染色操作步骤 按王关林等 1的方法。在浸
染后的叶盘中加入 GUS染液至淹没叶衙；真 抽气
5 min，37℃温育 3 h；置 FAA同定液脱色 3 h：依次
用 20％和 50％乙醇浸泡 2 h；用 80％乙醇的FAA【卉J
定液脱色脱 色；镜检，照相，统计蓝色反应叶盘
数和蓝色斑点数昼；将染色后的材料放任含 80c／c乙
醇的FAA固定液⋯1长期保存。
l-4-3 PCR检测
佛手总 DNA的提取，参照 卜化 ⋯J的办法进
2．1预培养时间对遗传转化的影响
预培养可以促进细胞分裂，分裂状态的细胞更
容易整合外源 DNA，『人J而可以提高转化效率【l21。在
农杆菌感染叶片之前，对外植体进行 一定时间的预
培养叮以提高转化率，未经预培养直接用农杆菌感
染，叶盘褐化现象 卜分严重且出现大量死亡，在筛
选培养 中几乎得 到愈伤组织，预培养时间过短
(1 d)叶盘愈伤组织诱导不明显或微弱，感染后也
会产生较严重的褐化和死 现象，转化率较低，若
预培养时问超过 4 d，外植体伤口处呈膨大疏松状，
且伤口逐渐愈合致使农杆菌难以浸染，从而使愈伤
组织诱导率和转化效率降低。从表 1可见，进行 2—
3 d的预培养可以得到较高的Km抗性愈伤组织诱
导率，分别为 5-38％和 7．25％。
Table I Effect ofpre—culture period on transformation
预培养时间 接种 植体数 f 组
of
织
cal
诱
lu
导
s w
率
ith
Pre-culture time( ) N。‘ phm r
2．2农杆菌感染时间和菌液浓度对遗传转化的影响
农杆菌感染的浓度和时f白J是影响转化率的一
个 要凶素。从表 2可看出，佛手叶片在农杆菌
OD6o值为 0．5、0．7，感染 20 rain时效果较好，抗性
愈伤组织诱导牢分别达到 2．38％和 2．44％。采用
OD 仇 0．3一1．1进行短时 感染 (5 min)，尽管褐
化 他减轻， 感染时问过如， 仃 未能充分吸
⋯ ⋯”受伤处 胞， 『fj执 愈伤细 ： 率
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第 5期 川 r川 ：农¨ 介 佛 遗 转化 i 影响 豢的研究
表 2农杆菌感染时间和浓度对遗传转化的影响
Table 2 Effect of bacterial concentration and immersion time on transfonnation
低；感染时间超过 30 min时，即使菌液浓度较低
(OD~0值 0．5—0．9)，叶片也会出现褐化现象，且抗
性愈伤组织诱导率降低。
2．3 共培养时间对遗传转化的影响
共培养是转化过程中最为关键的一一环。T．DNA
的转移及整合都存此时完成。农杆菌附着外植体后
不能立即转化，附着 l6 h之后才能诱发肿瘤经过
“细胞 调节期 ”，使 T．DNA发生转移_1]， 此 共培
养时间必须长 l6 h。但共培养时问过长，也可能
导致农杆菌过度增 使植物细胞受到毒害而死1、：。
农杆芮过度增 1 I1他染时的蔺液浓度过 引
起，L人1此他染闲液必须稀释剑合适浓J ⋯
不同的物种和外植体，农杆荫的最佳共培养时间也
不同。对于佛手叶而言，共培养 3 d是最合适的，超
过 3 d，农杆菌 长过度，外植体受剑毒害， 筛选
过程中很快褐化、死亡 (农 3)。
表 3共培养时 间对遗传转化的影响
Table 3 Effect ofCO．culture time on transformation
共培芥il,j nl】I 外f『{体数
Co—culture time(d) No．of explants
l 85
245
233
2fn
打[性愈伤组纵诱 导半
Frequency of callus with
Km (％)
1．OO
l 4l
2 44
l {
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378 热带亚热带植物学报 第 14卷
2．4抗生素的抑菌处理对遗传转化的影响
2．4．1不同抗生素的抑菌效果
目前最常用 的抑菌 抗生 素有羧苄 青霉 素
(Carbenicilin，Cb1，头孢霉素(Cefotaxine，Cef)。由表
4可知，以单独用 Cb(500 mg L。)抑菌 时，对 农杆
菌的抑制最明显 (外植体死亡率最低，为43．78％)，
而单独使用 Cef(500 mg L。)对农杆菌的抑制最不
明显 (外植体死亡率升高达 67．35％)，Cb+Cef组合
(浓度各为 250 mg L )的抑菌效果介于上述二者
之间，但愈伤组织诱导率最高。可见，两种抗生素组
合使用的抑菌效果较好。
2．4．2抑菌处理时间对遗传转化的影响
使用 以250 mg L。Cef和 250 mg L Cb为组
合，进行抑菌处理，结果见表 5。可见，以抑菌处理
4 d的效果最佳，抗性愈伤组织诱导率达到 7．5％
(表 5)，且褐化率最低，为 4．7％。
表 4 不 同抗生素对农杆菌抑菌效果及遗传转化的影响
Table 4 Efect ofdifferent antibiotics on the inhibition ofAgrobacterium and transformation
表 5 抑菌 处理时间对遗传转化 的影响
Table 5 Effects ofdays ofantibiotic treatment on transform ation
2．5 AS和 L—Cys对佛手转化效率的影响
有研究证明，酚类化合物中诱导效果最佳的是
AS，最适浓度为 50 mg Ll【lOl。本研究经 3代(6周)筛
选，发现在 YEP液体培养基和共培培养基(MT)中
同时加入 lO0 txmol／L AS所诱导的抗性愈伤组织
f88．2％1明显高于其它处理，这说明AS对其转化有
明显的促进作用。在共培养基中添加 L—Cys的卡那
霉素抗性愈伤组织诱导率是不加 L—Cys的 1．74倍。
2．6 G吣 瞬时表达率的影响
适当的菌液浓度对遗传转化的成败至关重要，
菌液浓度过低时，会由于农杆菌细胞数 目不足使得
转化效率较低，而菌液浓度过高，则由于营养不足
造成菌液中死菌数 日过多，具有感染能力的农杆菌
数 目实际减少，此外，菌体会产生某些有害代谢产
物对植物细胞造成伤害。从表 7可以看出，在其它
条件均为最优时，当菌液浓度 OD60值小于 0．6，GUS
表 6 AS和 L．Cys对遗传转化率的影响
Table 6 Efects of AS and L-Cys on transform ation
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表 7 不 犀浓度苗{馥对 的GUS瞬时表 选率的影 响
l"ah]e El1cct 0fdill~renl concentrations 0fb~clemml on ￡ trdnsient c pression
浊 非l望f0D 】
B~lctcrial r【ncentralion
{1 2
¨4
1)6
I)H
GUSI~ilc 选 ：# l*J PercentageofGU,S
positive transienl exprcssion
均没f 瞬时丧迭． 1 OD 值为0．6 Il1『．GU．h瞬l时表
哒率哒5 9％+ ’1On 值达到 0．8时，f 的瞬时表
达率 降到 3 8嘶r．O 恤继续增 刮 1．0 l,j． ￡
小丧哒 练台 2结 ．发现OD 皿为(1．5—0 8：i十
刈 Ffl"j愈伤 }纵诱 ,Ff件々 化 较近 f 的瞬
时表达情况 2 蕊色 点 (箭1上所示) 为(；t／5
爱边．：
2．7抗r眭愈伤 组织的分子 生物 学鉴定
山进 m止仳 r 转化成 ．从 筛选
养巷 h J【 常生长的愈协虮织rlI随机挑取 7块进
PCR榆删，结 3所示 ：l 2块经 埔得到
基 片段，该片段 大小 M制分 J‘lJ}-约
2 2 kb) 致．j 余抗 ：愈伤tl织未扩增 暖尢小
片段 雠明经过铷步选择筛选 l的转化作． 1 l
}M高．需要影种分子 I。毫 学方法 以牲刖．j -l】1 !
块虽然扳{ r⋯ 扩 片l析，办 l能仞步断定为转
化休，还需受进 作站占分f }l拗‘≯梭删
， 硼 ∞
、 0 ，
m 0
槲 一
一
洲
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扎 l互
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3讨论
小研究以 华佛丁叶黼为受体材料，通过抗
Km筛选，探讨了叶傩 培养、农杆菌浸染、 培养
时问、AS及 L．Cys添加等多种Ij=f素刈农忏菌介导
佛于转化n勺影响，确定J，适 n勺转化条什 。比较各
种参数，我们认为 AS平1 L．Cys的添加对转化影响
较人。刘I JJ忠【 】、林树州 ”I、l 永勤I蚓等 进行农卡T
茼介导 n勺圳 萝 卜(Dal(-ItS f-arot~)怂浮细 胞 、人
(GIycim，lI(L~)、小麦 (Triticu" aestit)l／m)转化 【1l
采Jl】_r AS，他们仅 )L培养 、预培养 {】添J【J
AS，取得了显符的效 。本研究发现，同时存培养农
¨ 』L培养过 l1】添加 lO0 I~mol／L AS 显 提
^机 0袭愈伤 勺诱导牢。L．Cys具何抑制
变l 门作Jf JI”1。Olhofl通过 培养摹 { 附J口适
的疏化物 也手千硫 酸钠 、dithiothreitol币I L．Cys共 培
乔，扶 从、 均 0．7％增加到 l6．4％的转化牢 】。Pei
人 遗传转化l{J的 培养 t{J加入 400 mg L。’
L．Cys，增加 农 茼浸染能力、提高了转化效率，
、卜衡 _r除 剂选择压和农杆菌浸染之间的关系，优
化了选择体系[I9】。本研究参考 Pei的方法，在共培养
基『fJ添加 400 mg L—L．Cys，发现其明显抑制了佛下
叶盘褐化。这与Pei的研究结论相吻合。此外，许多
试验研究了菌液浓度和浸染时 、共培养、预培
养[20-21对转化的影响，尽管所试材料和菌株 同，但
获得的 一般结果是：预培养 2—3 d， 培养 3—4 d，菌
液浓度 OD 0．5—1．0，浸染时间 15—20 min。本研究
与此一致。
选择适宜的能抑制农杆菌，1 长的抗生素也是
必须的，Cef、Cb、Cef+Cb均可达到除菌效果，芸香
科植物因晶种 同所用抑菌抗牛素种类和浓度也
同，转化枳壳 (Poncirus trifoliat．)用 300 mg L。的
Ccf[21，而 转 化 沙 田 柚 (Citrus grandis)采 用
50 mg L Cb抑菌[231。本实验 中使用 250 mg L
Cef+250 mg L Cb，与荨麻科植物苎麻 (Boehmeria
nivea)所用抑菌抗生素种类一致，但浓度不同【24J。抑
菌处理可以使经农杆蔺感染后的外植体生理状态
有一个恢复过程，有利于转化细胞的增殖。另外，当
外源基因进入受体细胞后，整合与表达以及表达量
的积累都需要有一个过程 。前人 研究西兰花
(Brassica oleracea var． itcdica)和 卷 心 菜 (B．
oler倒Pa var．capitata)转化lf、『，认为抑芮处理l1、f『HJ的
14卷
长 l 会影响刽转化的成败I! 。术 究结果 他们的
结 论 ‘敛。
佛 为 香科植物，绝人多数 乔科的柑橘品
种都对农杆闲比较敏感”1，佛于也 例外。水文利用
农杆 力 法转化海藻糖合酶 ，优化了 系列影
响转化的 f，扶 外源J{ 的瞬lI、『表达，利用
分子 物学 ‘法 步榆测剑外源 I★1整合剑植物
_JI￡ ·{i。我们也曾利用 1人】枪 法探索佛手转化
条什 ，川f 筛选 j 影 响此 力‘法转化效率的几个关
键 子 ，j』= j 较 高n勺GUS瞬lI’』衷达牢 (最高瞬时
表 哞 l7．8％)， 术得到 Gt／S的稳定表达 。我
们认为， 种方法各仃优缺^，农杆l埘方法步骤繁
琐，j 作f 人，但实验成本低，常 19实验器材和药
t i,j-操作。 『大1枪力‘ 步骤 ．易行，但实验成
本 - ，特刖是 枪仪器昂贵。 为 种方法
的幔 次数仃 ，从 步得 的 验结 植物材
料特 ：¨z之，我们建议使用农杆 ‘； ，既 约成
本，义能达剑 I t的。
对 卡』J少 定的抗性愈伤 织，【1前 要的
作是建 佛 南效再牛体系。I刮时，还需要做进 ‘
步分子乍物学榆测，如 GUS稳定表达和 Southern
杂交。
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