全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (2): 223~228 223
收稿 2013-11-18　　修定 2013-12-18
资助 国家自然科学基金青年基金(31200511)、国家林业公益性行业科研专项(201104054)和教育部博士点基金新教师类基金
(20110014120004)。
* 共同通讯作者(E-mail: hewei@bjfu.edu.cn和ywwang@bjfu.edu.cn; Tel: 13520517066和13718968958)。
一种高效提取杨树发病树皮总RNA的方法及应用
侯佳1, 孙丰硕2,3,4, 吴秋明2,3,4, 杨玉巧5, 贺伟1,*, 王延伟2,3,4,*
北京林业大学1森林培育与保护教育部重点实验室, 2林木育种国家工程实验室, 3林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 4国
家林业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室, 北京100083; 5濮阳市林业科学院, 河南濮阳457000
摘要: 对杨树发病树皮总RNA的高效提取是开展杨树抗溃疡病基因表达调控的基础, 为了探讨杨树发病树皮RNA的高效提
取方法, 本研究以欧美杨细菌性溃疡病菌侵染后的‘中林46’杨为材料, 比较了包括本研究提出的RNA提取新方法(RNA试剂
盒改良法)在内的6种方法提取的总RNA的质量和浓度。结果显示, 通过RNA试剂盒改良法提取的总RNA 28S rRNA条带亮
度约为18S rRNA条带亮度的2倍且浓度高, 表明该方法更适合感染欧美杨细菌性溃疡病的‘中林46’杨发病树皮总RNA的提
取。为了验证RNA试剂盒改良法对健康杨树树皮及不同胁迫处理、组织RNA提取的适用性, 进一步用该方法提取了‘中林
46’杨、‘107’杨、‘北京’杨健康树皮, 低氮、低磷处理的毛白杨组培苗以及白玉兰花的总RNA。结果表明, 用RNA试剂盒改
良法均能获取高质量的总RNA。所提取的总RNA已成功用于感染欧美杨细菌性溃疡病的杨树树皮转录组测序, 以及低氮处
理的毛白杨组培苗RT-PCR和荧光定量PCR实验, 表明用RNA试剂盒改良法提取的总RNA可以用于后续分子实验。
关键词: RNA提取; 杨树; 侵染; 树皮
An Efficient Method for Total RNA Extraction of Poplar Bark Infected with
Pathogen and the Application
HOU Jia1, SUN Feng-Shuo2,3,4, WU Qiu-Ming2,3,4, YANg Yu-Qiao5, HE Wei1,*, WANg Yan-Wei2,3,4,*
1Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education, 2National Engineering Laboratory for Tree Breeding,
3Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education, 4Tree and Ornamental
Plant Breeding and Biotechnology Laboratory of State Forestry Administration, Beijing Forestry University, Beijing 100083,
China; 5Forestry Research Institute of Puyang, Puyang, Henan 457000, China
Abstract: The highly efficient total RNA extraction of poplar bark infected with pathogen is important for the
expression and regulation research of resistance genes. To explore an efficient method for total RNA extraction
from the lesion bark, 2-year-old seedling stem of Populus euramericana cv. ‘Zhonglin 46’ was inoculated with
the pathogenic bacterium of Lonsdalea quercina subsp. populi and used for RNA extraction. A novel RNA
extraction method was first proposed in this study and named “Improved method of RNA extraction kit”. We
compared the extraction effects among this method and other five methods. The test results showed that RNA
extracted using “Improved method of RNA extraction kit” was of high concentration and the band of 28S rRNA
was nearly twice as bright as that of 18S rRNA. The analysis suggested that “Improved method of RNA
extraction kit” was the most suitable for total RNA extraction from the lesion bark. To test the wider
applicability, we further extracted total RNA from other tissues, including the healthy bark of P. euramericana
cv. ‘Zhonglin 46’, P. euramericana cv. ‘74/76’ and Populus×beijingensis, tissue culture plantlets of Populus
tomentosa treated with low nitrogen or phosphorus stress and the flower of Magnolia denudate. The testing
showed that total RNA could be successfully extracted from all these plant tissues with high quality. The
extracted RNA had been successfully used for transcriptome sequencing of poplar lesion bark, RT-PCR and
qRT-PCR of tissue culture plantlets of P. tomentosa treated with low nitrogen stress. Consequently, the result
showed that total RNA extracted using “Improved method of RNA extraction kit” could be further used in the
subsequent molecular experiment.
Key words: RNA extraction; poplar; infection; bark
植物生理学报224
植物总RNA的高效提取是进行RT-PCR、
cDNA文库构建、分子杂交等分子操作的前提。
目前关于植物RNA提取的方法较多, 如CTAB法、
Trizol法和试剂盒等, 其中改良的CTAB法是提取
杨树、柳树、榛树、杜仲、松树、核桃、枣树等
RNA常用的方法(丁勇等2011; 董宁光等2011; 郭丽
霞等2007; 李继东等2010; 刘晓菊等2008; 孟晓庆
等2013; 王玉成等2003; 严晓丹等2008; Azevedo等
2003)。草本植物较易提取高质量的RNA, 但对于
多数木本植物, 因富含RNA酶、多糖、多酚、蛋
白质以及其他次生代谢物, 使得某些组织总RNA
的高效提取存在一定的困难, 表现为易降解, 质量
差或浓度低等(李晓颖等2010)。因此, 如何快速、
高效地从木本植物中获得高质量的总RNA是研究
者十分关注的问题。
‘中林46’杨(Populus euramericana cv. ‘Zhonglin
46’)属杨柳科杨属黑杨派, 为速生杨, 是木材和造
纸工业的理想材料。但该树种易感染细菌性溃疡
病且发病严重(郭利民等2012), 主要症状包括树干
韧皮部局部坏死, 从中流出有酸臭味白色粘稠状
液体, 严重影响杨树的健康和生长, 甚至造成树木
的死亡。研究溃疡病菌侵染杨树过程中基因的表
达调控是对杨树进行分子改良的基础。目前已有
用改良的CTAB法提取杨树树皮总RNA的报道
(Chen等2012)。但笔者前期以‘中林46’杨感病树皮
(含形成层和部分木质部)为材料, 用该方法提取总
RNA, 效果不好, 对病斑树皮无法获得高质量的总
RNA。因此有必要筛选理想的提取方法或针对性
地对某种方法进行改进。本研究采用改良的CTAB
法、Trizol法、ConcertTM Plant RNA Rea-gent、
RNA试剂盒(离心柱型)、CTAB结合RNA试剂盒
(离心柱型)和ConcertTM Plant RNA Reagent结合
RNA试剂盒(离心柱型)的RNA试剂盒改良法六种
方法提取‘中林46’杨感病植株树皮的总RNA, 发现
RNA试剂盒改良法提取的效果最好且用时最短, 总
RNA的纯度、浓度及完整性高, 已成功地用于感
染欧美杨细菌性溃疡病的杨树树皮转录组测序。
之后将该方法用于‘中林46’杨、‘107’杨、‘北京’
杨健康树皮, 低氮、低磷处理后的毛白杨组培苗
以及白玉兰花的总RNA提取, 所得总RNA质量、
浓度均较高, 其中低氮处理的毛白杨组培苗的总
RNA已成功地用于RT-PCR和荧光定量PCR实验。
材料与方法
1 供试材料
1.1 树木材料
2年生‘中林46’杨(Populus euramericana cv.
‘Zhonglin 46’)苗干, 由河南省濮阳市林业科学院提
供。2年生‘107’杨(Populus euramericana cv.
‘74/76’)和‘北京’杨(Populus×beijingensis W. Y. Hsu)
取自北京林业大学森林保护研究室试验地。实验
用毛白杨(Populus tomentosa Carr.)组培苗品种为
TC1521, 由北京林业大学林木育种国家工程实验
室提供。白玉兰(Magnolia denudate Desr.)花采自
北京林业大学校园内白玉兰树1年生枝条。
1.2 菌株
欧美杨细菌性溃疡病菌(Lonsdalea quercina
subsp. populi)菌株N-5-1由北京林业大学森林保护
教研室提供。
2 试剂与引物
2.1 试剂
RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(离心
柱型)、First stand cDNA synthesis kit、50 bp DNA
Marker购自天根生化科技(北京)有限公司, Trizol、
ConcertTM Plant RNA Reagent为Invitrogen产品,
rTaq酶购自TaKaAa。所用试剂CTAB (十六烷基三
甲基溴化铵)、EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、SDS
(十二烷基硫酸钠)、Tris、PVP-40 (聚乙烯吡咯烷
酮)、亚精胺为Sigma产品, DEPC (焦碳酸二乙
酯)、β-巯基乙醇为Amresco产品, 其余均为国产分
析纯试剂。
CTAB法提取缓冲液、SSTE溶液及RNA提取
所用溶液的配制, 玻璃器皿、试管和枪头等的处
理参照《分子克隆实验指南》(第3版)。
2.2 引物
根据NCBI上已知的杨树内参基因Ubiquitin、
EF1, 利用primer 5.0设计引物, 序列如下:
Ubiquitin: 上游引物PUBQF, 5 CgTggAgg-
AATgCAgATTTT 3 ; 下游引物PUBQR, 5
gATCTTggCCTTCACgTTgT 3。
EF1 : 上游引物PTEF1F, 5 AAgCCAT-
gggATgATgAgAC 3; 下游引物PTEF1R, 5
ACTggAgCCAATTTTgATgC 3。
以上引物在上海英俊公司合成。
侯佳等: 一种高效提取杨树发病树皮总RNA的方法及应用 225
3 方法
3.1 接种方法
实验共用6棵杨树苗木主干。将每棵苗木主
干截为6段, 每段为长30 cm茎段, 共接种36个茎段,
其中对照组6×2共12个茎段, 实验组6×4共24个茎
段。茎段表面用75%酒精消毒后, 用直径6 mm的
打孔器在茎段中部打孔, 将蘸有菌液(对照用无菌
水)的脱脂棉块放在伤口处, 用保鲜膜缠好。接种
菌液浓度为108 cfu·mL-1。
3.2 培养条件
病原细菌于LB液体培养基中, 在温度30 ℃,
转速180 rpm摇床中培养24 h后接种。接种材料置
于温度28 ℃, 相对湿度90%以上, 16 h光照/8 h黑暗
的人工气候箱内培养。毛白杨组培苗培养温度24
℃, 16 h光照/8 h黑暗, 固体培养基为1/2MS+0.3
mg·L-1 IBA。
3.3 胁迫处理方法
取生长60 d毛白杨组培苗, 低氮或低磷处理7
d, 液体培养基配方为1/2MS, 其中低氮胁迫处理氮
浓度为0.01 mmol·L-1 NH4NO3, 低磷胁迫处理磷浓
度为0 mmol·L-1。
3.4 取样方法
‘中林46’杨接种后6 d取样, 取样部位为接种点
下方1 cm×2 cm大小接种后发病的病斑树皮组织。
以上材料收获后用液氮速冻并置于–70 ℃保存。
3.5 RNA提取
3.5.1 改良的CTAB法 参照Chen等(2012)的提取
方法。
3.5.2 Trizol法 按Invitrogen说明书进行。
3.5.3 RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(离心
柱型) 按天根生化科技(北京)有限公司说明书
进行。
3.5.4 ConcertTM Plant RNA Reagent 按Invitrogen
公司提取说明书进行。
3.5.5 CTAB结合RNA试剂盒(离心柱型) 参照
Sangha等(2010)的提取方法。
3.5.6 RNA试剂盒改良法 具体试验步骤如下。向
2 mL离心管中加入1 mL Plant RNA Reagent; 取0.2
g树皮材料于液氮预冷的研钵中, 充分研磨后, 迅
速将研磨好的粉末加入到上述植物提取试剂中,
上下颠倒混匀后将离心管水平静置5 min; 常温条
件下15 294×g离心2 min; 取上清, 加入200 μL 5.0
mol·L-1 NaCl; 加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混
合液, 4 ℃、15 294×g离心10 min; 重复氯仿:异戊
醇抽提1次; 取上清, 按照植物总RNA提取试剂盒
(离心柱型)说明书中第3步, 缓慢加入0.5倍体积的
无水乙醇, 混匀, 如出现沉淀, 则将得到的溶液和
沉淀一起转入吸附柱中, 常温条件下15 294×g离心
30~60 s, 倒掉收集管中的废液; 之后继续按照试剂
盒说明书中第4~11步, 完成实验。
3.6 总RNA纯度及浓度的检测
总RNA进行1.0%琼脂糖凝胶电泳, 在紫外凝
胶成像系统下拍照。用英国WPA公司紫外分光光
度计测定样品的OD260/OD230和OD260/OD280的值及
总RNA的浓度。
3.7 RT-PCR和荧光定量PCR (qRT-PCR)分析
用First stand cDNA synthesis kit进行反转录,
对内参基因进行PCR扩增, 以验证所提的总RNA
是否满足后续实验的要求。反应条件95 ℃ 30 s,
60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环。产物进行3.0%非
变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增专一性。
qRT-PCR实验采用宝生物工程(大连)有限公
司的SYBR®Premix Ex Taq™。使用ABI公司7500
Fast实时荧光定量PCR仪和Bio-Rad公司8联管。反
应体系参照说明书进行。
实验结果
1 不同方法提取的病斑树皮总RNA凝胶电泳分析
以‘中林46’杨病斑树皮组织为试验材料, 用改
良的CTAB法、Trizol法、ConcertTM Plant RNA
Reagent、CTAB结合RNA试剂盒(离心柱型)和本
研究提出的RNA提取新方法(RNA试剂盒改良法)
共六种方法提取总RNA, 经1.0%琼脂糖凝胶电泳,
检验六种方法提取的总RNA的完整性。
结果(图1)显示, 用改良的CTAB法和ConcertTM
Plant RNA Reagent提取的总RNA有DNA污染, 28S
rRNA和18S rRNA条带模糊, 有较严重的弥散现象,
点样孔附近有条带, 说明有蛋白质、多糖等杂质
的污染, 降解较严重。Trizol法提取的总RNA中
5.8S rRNA条带的亮度明显大于28S rRNA和18S
rRNA条带, 说明降解严重, 并且有蛋白质等杂质的
污染。RNA试剂盒(离心柱型)对病斑树皮组织提
取效果不好, 降解严重。CTAB结合RNA试剂盒
(离心柱型)提取的总RNA较为完整, 条带上无明显
植物生理学报226
的DNA污染, 但28S rRNA和18S rRNA条带很弱且
亮度相当, 说明用该方法提取的总RNA浓度低且
有部分降解。RNA试剂盒改良法提取的总RNA点
样孔干净, 条带完整、清晰、亮度高, 无明显的
DNA污染, 且28S rRNA条带亮度约为18S rRNA条
带的2倍, 说明提取过程中总RNA基本没有降解,
DNA和蛋白质、多糖等杂质的污染很少。
综上所述, 比较这六种提取方法的凝胶电泳
结果可以得出, 本实验提出的RNA试剂盒改良法更
适合于‘中林46’杨病斑树皮组织总RNA的提取。
2 不同方法提取的病斑树皮总RNA纯度、浓度的
比较分析
用不同的提取方法获得的‘中林46’杨病斑树
皮总RNA纯度、浓度见表1。由表1结合电泳分析
结果可知, 用改良的CTAB法、Trizol法、RNA试
剂盒(离心柱型)、ConcertTM Plant RNA Reagent提
取的总RNA存在着DNA、蛋白质、多糖、多酚等
表1 不同方法提取的‘中林46’杨病斑树皮总RNA纯度、浓度
Table 1 Purity and concentration of total RNA from the lesion
bark of P. euramericana cv. ‘Zhonglin 46’ with
different extraction methods
方法
病斑树皮组织
OD260/OD230 OD260/OD280 浓度/ng·μL
-1
A 1.530 2.040 294.0
B 0.959 1.893 542.4
C 1.674 2.047 1 159.0
D 1.743 1.787 765.6
E 2.040 2.080 382.0
F 1.974 2.086 1 016.0
　　A: 改良的CTAB法; B: Trizol法; C: RNA试剂盒(离心柱型); D:
ConcertTM Plant RNA Reagent; E: CTAB结合RNA试剂盒(离心柱
型); F: RNA试剂盒改良法。
表2 RNA试剂盒改良法提取的‘中林46’杨病斑树皮总RNA样品检测结果
Table 2 Test results of total RNA extracted rom the lesion bark of P. euramericana
cv. ‘Zhonglin 46’ by “improved method of RNA extraction kit”
样品名称 浓度/ng·μL-1 OD260/OD280 OD260/OD230 RIN 建库类型 结果说明
BIN2 1330.3 2.10 2.32 6.8 RNA-Seq A类
　　BIN2: 病斑树皮; RIN (RNA Integrity Number): RNA 完整性数值。
杂质的污染, 纯度、浓度较低。RNA试剂盒改良
法和CTAB结合RNA试剂盒(离心柱型)相比较, 虽
然两者提取的总RNA纯度都较高, 但前种方法提
取的总RNA质量较好, 浓度有很大的提高, 完整性
也较好, 符合cDNA文库构建质量、纯度和浓度的
要求。
综上所述, 结合电泳分析的结果可以得出, RNA
试剂盒改良法最适合‘中林46’杨病斑树皮组织总
RNA的高效提取。
3 RNA-Seq中RNA质量分析
用RNA试剂盒改良法提取的‘中林46’杨病斑
树皮组织总RNA送深圳华大基因公司进行转录
组测序。表2为RNA试剂盒改良法提取的总RNA
在高通量测序之前Agilent 2100 Bioanalyzer的检
测结果(检测结果分为A~D类, 其中A类结果最好,
D类结果不能满足测序建库的要求)。从表2中可
以看出, 无论是浓度、完整性还是28S/18S的值均
符合转录组测序的要求。目前, 提取的总RNA已
成功地构建了cDNA文库, 进行了转录组测序分
析(另文发表)。
图1 不同方法提取的‘中林46’杨病斑树皮
总RNA凝胶电泳检测
Fig.1 Gel electrophoresis of total RNA extraction from the
lesion bark of P. euramericana cv. ‘Zhonglin 46’
with different extraction methods
A: 改良的CTAB法; B: Trizol法; C: RNA试剂盒(离心柱型); D:
ConcertTM Plant RNA Reagent; E: CTAB结合RNA试剂盒(离心柱
型); F: RNA试剂盒改良法。
侯佳等: 一种高效提取杨树发病树皮总RNA的方法及应用 227
4 RNA试剂盒改良法对树木组织总RNA的提取效果
利用RNA试剂盒改良法提取‘中林46’杨、
‘107’杨、‘北京’杨健康树皮, 白玉兰花的总RNA,
经琼脂糖凝胶电泳检测, 结果如图2所示, 所获得
的总RNA条带完整、清晰, 亮度高, 效果均较好。
总RNA为模板, 进行反转录, 并对内参基因Ubi-
quitin、EF1进行PCR (图4), 从图中可以看出扩增
得到的内参基因条带清晰, 长度与预计的目的片
段大小一致, 能够满足后续分子试验对总RNA质
量的要求。
之后, 进行了Ubiquitin、EF1荧光定量PCR溶
解曲线的检测, 结果显示cDNA扩增产物专一, 并成
功进行了低氮胁迫定量PCR分析实验(另文发表)。
讨　　论
随着杨树基因组全序列的公布, 杨树成为林
木基因组学研究的模式树种(张勇等2006)。和其
他的木本植物一样, 杨树的细胞壁中含有大量的
木质素、纤维素及结构蛋白等组成物质, 使得杨
树材料特别是树皮材料坚韧而不易磨碎; 而细胞
内大量多酚、多糖、单宁等次生代谢物质的存在,
也为杨树RNA的提取带来了很大的困难(郭丽霞等
2007), 特别是发病的杨树树皮局部坏死, 且有白色
粘液, 使得RNA的提取更为复杂, 一些常规的RNA
提取方法和经典试剂盒都无法获得高质量的RNA。
目前, 关于杨树组织RNA提取方法的报道主要是
针对杨树叶片的RNA提取, 如CTAB法、改良的
CTAB法、Trizol法等, 这些方法都有其一定的适
用性。对于杨树不同的生长阶段、不同的组织,
由于其富含物质不同 , 相同的提取方法获得的
RNA质量也不尽相同(任增凯等2008)。本试验前
期使用这几种方法提取‘中林46’杨病斑树皮总
RNA, 均无法获得高质量的总RNA。
5 RNA试剂盒改良法对胁迫处理材料总RNA的提
取效果
为了验证本实验提出的RNA试剂盒改良法提
取胁迫处理的杨树RNA的适用性, 用该方法对低
氮、低磷处理的毛白杨组培苗总RNA进行了提取
(图3)。从图中可以看出, 所获得的总RNA条带完
整清晰, 效果较好。
图2 RNA试剂盒改良法对树木组织总RNA的提取
Fig.2 RNA extraction from arboreous tissues by “improved
method of RNA extraction kit”
1、2: ‘中林46’杨; 3、4: ‘北京’杨; 5、6: ‘107’杨; 7、8: 白玉兰花。
图3 RNA试剂盒改良法对胁迫处理的
毛白杨组培苗总RNA的提取
Fig.3 RNA extraction from Populus tomentosa plantlets with
stress treatment by “improved method of RNA extraction kit”
1、2: 低氮处理; 3、4: 低磷处理。
图4 RNA试剂盒改良法提取的低氮处理毛白杨组培苗总
RNA的RT-PCR检测
Fig.4 RT-PCR of total RNA extracted from Populus
tomentosa plantlets treated with low nitrogen by
“improved method of RNA extraction kit”
M: 50 bp DNA marker; 1: 内参基因Ubiquitin; 2: 内参基因EF1。
6 RNA试剂盒改良法提取的低氮处理毛白杨组培
苗总RNA的RT-PCR和荧光定量PCR检测
为了检验RNA试剂盒改良法提取的总RNA是
否适用于RT-PCR和荧光定量PCR检测, 首先进行
了RT-PCR实验, 以改良法提取的低氮处理组培苗
植物生理学报228
RNA试剂盒改良法与Sangha等(2010)的提取
方法相比较, 在以下方面进行了改良: 将CTAB法提
取缓冲液换成ConcertTM Plant RNA Reagent, 用国产
的吸附柱(TIANGEN)替换进口的吸附柱(QIANGEN)
并加入了高浓度的NaCl溶液, 可有效地去除多糖、
多酚、蛋白质及其他次生代谢物, 并大大缩短了总
RNA提取的时间 , 由原来的3 h缩短为50 min;
Sangha等(2010)的提取方法对‘中林46’杨病斑树皮
组织总RNA的提取结果不稳定 , 且提取出的总
RNA浓度低, 完整性差; 笔者用该方法提取的总
RNA, 不能满足转录组测序中cDNA建库对RNA质
量、浓度和纯度要求。本实验提出的RNA试剂盒
改良法, 与Sangha等(2010)的提取方法相比较, 其优
越性还表现在节省了实验成本, 所提取的总RNA质
量好、浓度高, 能够满足后续分子实验的要求。
本研究采用6种方法提取‘中林46’杨病斑树皮
组织的总RNA, 获得了不同质量的总RNA。杨树
中富含多酚、多糖, CTAB可防止多酚的氧化并能
去除多糖, 基于CTAB法进行改良已成功提取了杨
树嫩叶的RNA (郭丽霞等2007)。但本实验用改良
的CTAB法和Trizol法提取杨树树皮总RNA的过程
中, 用氯仿/异戊醇抽提后, 上清液往往呈现黄色,
即使增加氯仿/异戊醇抽提的次数, 也无法消除这
种物质的影响, 用异丙醇沉淀后, 可见黄褐色沉淀
物。RNA试剂盒改良法提取的过程中黄色物质较
少, 黄色物质的成分及改良法所用的ConcertTM
Plant RNA Reagent裂解液如何有效地抑制这种黄
色物质有待进一步研究。在6种方法中, 改良的
CTAB法提取的总RNA纯度最低, 而本实验提出的
RNA试剂盒改良法提取的总RNA条带最为清晰,
纯度最高, 完整性也较好; 从总RNA的浓度来看, 6
种方法差别较大, 虽然RNA试剂盒(离心柱型)提取
的总RNA浓度最高, 但降解严重; 除RNA试剂盒
外, 在此基础上进行改良的RNA试剂盒改良法提
取的总RNA浓度最高, 且所获得的总RNA无DNA
污染, 在后续RT-PCR实验前不需要用DnaseI对总
RNA 进行消化, 避免了在此操作过程中RNA的降
解和损失。综上所述, 无论从质量、纯度、浓度,
还是提取时间, RNA试剂盒改良法都更适合‘中林
46’杨病斑树皮总RNA的提取, 所提取的总RNA质
量较高, 已成功用于转录组测序分析。为了检验
RNA试剂盒改良法对健康杨树树皮及其他植物组
织总RNA的提取效果, 利用该法提取了‘中林46’
杨、‘107’杨、‘北京’杨健康树皮, 低氮、低磷处理
后的毛白杨组培苗以及白玉兰花的总RNA, 效果
均较好, 所提取的总RNA可用于后期的RT-PCR、
荧光定量PCR等分子实验。
本研究对杨树病斑树皮总RNA高效提取方法
的摸索, 既为下一步杨树抗病基因表达调控的相关
研究奠定了良好的技术基础, 也为其他富含多糖多
酚、蛋白质及次生代谢物的木本植物材料总RNA
的高效提取提供了参考。为了验证RNA试剂盒改
良法对木本植物材料总RNA提取的适用性, 本文以
几种杨树树皮、胁迫处理的毛白杨组培苗以及白
玉兰花为材料提取总RNA, 所得总RNA质量、浓
度均较高, 但对其他木本植物材料总RNA的提取是
否具有普遍的适用性还有待进一步测定和验证。
参考文献
丁勇, 黎燕红, 王汉斌, 龚秀会, 刘小烛(2011). 杜仲树皮总RNA提
取方法的比较. 安徽农业科学, 39 (6): 3255~3257
董宁光, 高英, 裴东(2011). 核桃子叶RNA提取方法的研究. 北京林
业大学学报, 33 (6): 98~101
郭利民, 常聚普, 贺伟, 杨玉巧, 张丽敏, 杨旭琦, 谢守江(2012). 欧美
杨溃疡病田间发生规律研究初报. 林业实用技术, (10): 38~39
郭丽霞, 宁德娟, 马群, 丁明全, 侯佩臣, 沈昕(2007). 一种适合杨树
RNA提取的方法. 吉林林业科技, 36 (2): 5~7
李继东, 武应霞, 冯建灿, 毕会涛, 梁启伟, 寇首道(2010). 枣RNA提
取方法的比较. 经济林研究, 28 (4): 15~19
李晓颖, 曹雪, 房经贵, 章镇(2010). 杏叶片与果实总RNA提取方法
研究. 中国农学通报, 26 (2): 152~156
刘晓菊, 洪海波, 李敏, 刘媛, 杨克强(2008). 改良CTAB法提取核桃
总RNA试验. 山东农业科学, (1): 97~99
孟晓庆, 侯智霞, 张兰, 朴蕾(2013). 榛子总RNA提取方法的比较研
究. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 11 (2): 1~7
任增凯, 禹山林, 杨庆利, 潘丽娟, 陈明娜, 郑强(2008). 花生种子总
RNA提取的一种有效方法. 花生学报, 37 (3): 20~23
王玉成, 薄海侠, 杨传平(2003). 胡杨、柽柳总RNA提取方法的建
立. 东北林业大学学报, 31 (5): 99~100
严晓丹, 王天祥, 刘挨枝, 王华芳(2008). 胡杨根、茎、叶、愈伤组
织总RNA提取的研究. 河北林果研究, 23 (2): 118~122
张勇, 张守攻, 齐力旺, 陈小强, 陈瑞阳, 宋文芹(2006). 杨树-林木基
因组学研究的模式物种. 植物学通报, 23 (3): 286~293
Azevedo H, Lino-Neto T, Tavares RM (2003). An improved method
for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime
pine trees. Plant Mol Biol Rep, 21: 333~338
Chen L, Ren Y, Zhang Y, Xu J, Zhang Z, Wang Y (2012). genome-
wide profiling of novel and conserved Populus microRNAs
involved in pathogen stress response by deep sequencing. Planta,
235 (5): 873~883
Sangha JS, Gu K, Kaur J, Yin Z (2010). An improved method for
RNA isolation and cDNA library construction from immature
seeds of Jatropha curcas L. BMC Res Notes, 3: 126