全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (10): 1047~1052 1047
收稿 2013-06-17 修定 2013-08-07
资助 浙江省科技厅项目(2011R50030)。
* 通讯作者(E-mail: wyd11111@126.com; Tel: 0571-63105072)。
山鸡椒的愈伤组织诱导及植株再生
林丽媛, 韩小娇, 陈益存, 吴庆珂, 汪阳东*
中国林业科学研究院亚热带林业研究所, 浙江富阳311400
摘要: 以山鸡椒无菌苗叶片、茎段为外植体诱导愈伤组织, 通过愈伤组织分化诱导不定芽途径, 建立山鸡椒植株再生体
系。结果表明, 山鸡椒茎段是诱导愈伤组织最佳外植体, 愈伤组织诱导和不定芽分化的最适培养基为MS+2.0 mg·L-1 BA+
0.1 mg·L-1 IBA, 分化培养基中添加适当浓度的维生素C可减轻愈伤组织褐化程度; 诱导不定芽生根较理想的培养基为
1/2MS+0.2 mg·L-1 IBA+0.4 mg·L-1 NAA。同时, 通过组织学观察了愈伤组织的结构和不定芽的发生。
关键词: 山鸡椒; 组织培养; 愈伤组织; 植株再生
Callus Induction and Plantlet Regeneration of Litsea cubeba (Lour.) Pers.
LIN Li-Yuan, HAN Xiao-Jiao, CHEN Yi-Cun, WU Qing-Ke, WANG Yang-Dong*
Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang, Zhejiang 311400, China
Abstract: A system for plantlet regeneration of Litsea cubeba (Lour.) Pers. was established via adventitious
buds induction from callus using leaves and stems as explants. The results showed that the stems were the
optimal explants for callus induction. The best medium for calli induction and adventitious buds induction was
MS+2.0 mg·L-1 BA+0.1 mg·L-1 IBA. In the meantime, the darkening degree of callus would be mitigated by
adding appropriate concentration of vitamin C to the medium of adventitious buds induction. Moreover, the
most favorable medium of root regeneration was 1/2MS+0.2 mg·L-1 IBA+0.4 mg·L-1 NAA. The structure of calli
and the formation of adventitious buds were discovered by histological analysis.
Key words: Litsea cubeba (Lour.) Pers.; tissue culture; callus; plantlet regeneration
山鸡椒[Litsea cubeba (Lour.) Pers.]又称山苍
子, 为樟科(Lauraceae)木姜子属灌木或小乔木, 原
产自亚洲, 在我国广泛分布于长江以南各省(区)的
低丘和山地阳坡, 是珍贵的芳香油料和药材树种
(王旭和杨关锋2010)。山鸡椒的根、叶、花及果
实中均含有芳香油, 其中果皮含油量可达4% (黄光
文和卢向阳2005)。柠檬醛作为其芳香油的主要成
分可用于合成紫罗兰酮系列香料, 这些香料广泛
用于高档化妆品、香皂等日用化工和食品生产
中。此外, 山苍子油还具有广谱抑菌性、抗氧化
作用以及一定的药用价值(方学军2007)。
目前生产应用的山鸡椒以野生资源为主, 人
工栽培的种源及插条采集也主要利用野生资源(王
玉昆等2005), 且人工繁殖速度慢, 育种周期长, 不
利于大规模生产和品种改良。利用组织培养技术
对山鸡椒进行离体培养和快速繁殖已有不少报
道。Mao等(2000)的研究发现山鸡椒茎尖适合用
于诱导不定芽, 通过6-BA诱导获得大量丛生芽, 随
后在WPM培养基上诱导不定芽生根。孙雁霞等
(2002)以带芽茎段为外植体, 获得大量再生植株。
尹红(2000)在进行山苍子愈伤组织诱导的研究中
发现, 在一个较宽的激素浓度范围内均可诱导出
愈伤组织, 筛选出理想的组合是2.0 mg·L-1 6-BA+
2.0 mg·L-1 2,4-D。但是目前对山鸡椒诱导愈伤组
织分化, 进而建立再生体系未见报道。本实验在
这些研究的基础上以山鸡椒无菌苗为材料, 进行
愈伤组织的诱导和分化, 建立再生体系, 以期为山
鸡椒遗传转化体系的建立及进一步的品种改良奠
定基础。
材料与方法
1 材料
试材为山鸡椒[Litsea cubeba (Lour.) Pers.]无
菌组培苗, 取自中国林科院亚热带林业研究所组
培室(2012年3月中旬取山鸡椒当年生茎段进行带
芽茎段启动和增殖培养, 获得无菌组培苗, 继代培
植物生理学报1048
养基为MS+1.0 mg·L-1 BA+0.1 mg·L-1 IBA+30 g·L-1
蔗糖+7 g·L-1琼脂, 继代周期为30 d)。
2 方法
2.1 外植体的处理
以山鸡椒增殖组培苗叶片及茎段为外植体:
(1)无菌条件下, 剪取无菌苗顶部完全展开的幼嫩
叶片, 用解剖刀于叶片背面垂直中脉处划3刀, 近
轴面朝下接种于诱导培养基中; (2)从继代培养30 d
左右, 生长良好的无菌苗上切取不带芽茎段(0.5~
1.0 cm)以竖直方式接种于愈伤组织诱导培养基中。
2.2 基本培养基及培养条件
愈伤组织的诱导及不定芽分化培养基以MS
为基本培养基, 附加30 g·L-1蔗糖, 7 g·L-1琼脂, pH 5.8;
生根培养以1/2MS为基本培养基, 附加20 g·L-1蔗糖,
7 g·L-1琼脂, 1 g·L-1活性炭, pH 5.8, 121 ℃高压灭菌20
min。愈伤组织诱导、分化及不定芽生根培养均
在以下环境条件中进行: 培养温度(25±2) ℃, 光照
时间16 h·d-1, 光照强度15~20 µmol·m-2·s-1。
2.3 愈伤组织的诱导和芽分化诱导
将不同外植体接种在附加2.0 mg·L-1 BA+0.1
mg·L-1 IBA [根据尹红(2000)文献报道及预实验确
定]的愈伤组织诱导培养基上, 光照培养, 每隔3 d
观察一次, 30 d后, 统计愈伤组织诱导结果。切取
外植体形成的愈伤组织, 用于不定芽分化诱导。
愈伤组织芽分化诱导培养基首先采用三因素二水
平的L4(2
3)的正交试验设计(表2): BA (2.0、1.0
mg·L-1), IBA (0.1、1.0 mg·L-1), 活性炭(1、0 g·L-1),
以找到影响分化的主导因素。随后根据正交试验
结果, 设置4个浓度梯度的BA (2.0、3.0、4.0、5.0
mg·L-1)以进一步筛选出适宜浓度的BA。另外, 在
分化培养基(附加2.0 mg·L-1 BA+0.1 mg·L-1 IBA)中
分别添加4种不同的防褐变剂: 1 g·L-1活性炭、50
mg·L-1 维生素C、1 g·L-1 PVPP (交联聚乙烯基吡咯
烷酮)、4 mg·L-1 AgNO3, 同时以不添加防褐剂的处
理作为对照。观察并记录不定芽诱导情况, 30 d后
统计愈伤组织分化数。
2.4 生根培养
以1/2MS培养基为基本培养基, 附加不同浓度
的IBA (0.1、0.2、0.5 mg·L-1)和NAA (0、0.02、
0.40 mg·L-1), 共设9个处理, 切取不定芽转入生根培
养基中, 光照培养50 d后统计生根结果。
2.5 石蜡切片与显微观察
将未经培养的不带芽茎段、正在启动的愈伤
组织和分化出不定芽的愈伤组织用FAA固定液固
定, 常规石蜡切片法制片, 切片厚度8 µm, 番红染
色, 显微镜下观察并拍照。
实验结果
1 不同外植体愈伤组织的诱导
表1结果显示以叶片为外植体愈伤组织诱导
率很低, 仅为11%。试验观察发现, 接种10 d后大
部分叶片边缘卷曲增厚, 一部分叶片切口处发黑,
叶片枯萎; 15 d左右开始膨大产生愈伤组织, 切口
处愈伤组织呈现淡绿色, 生长慢, 且容易产生褐变
现象(图1-A)。以茎段为外植体的愈伤组织诱导率
达到100%, 接种后5 d即可观察到茎段切口处膨大,
有嫩绿色的愈伤组织形成, 随后愈伤组织继续生
长, 愈伤组织块体积大, 且不易发生褐变(图1-B)。
综合比较这2种外植体在愈伤组织诱导培养基上
的生长状况及所产生愈伤组织的数量和质量, 认为
茎段是山鸡椒愈伤组织诱导的最佳外植体材料。
2 愈伤组织分化诱导培养
2.1 不同浓度IBA、BA、活性炭对愈伤组织不定
芽诱导的影响
对愈伤组织分化诱导的正交试验结果进行直
观分析, 比较不同因素各水平平均值之间的极差
(R), R越大表示该因素对结果的影响越大。从表2
可以看出, IBA、BA、活性炭对不定芽数量的作
用依次增加, 而在愈伤组织分化率方面, BA和活性
炭的极差最大, 表明这两个因素对于分化率的提
表1 不同外植体类型对愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effects of different explants on callus induction
外植体类型 接种数/块 诱导率/% 愈伤组织特点
叶片 100 11 淡绿色, 表面无突起, 体积小, 短时间内易褐化
茎段 100 100 淡绿色, 表面突起, 体积大, 短时间内不易褐化
林丽媛等: 山鸡椒的愈伤组织诱导及植株再生 1049
高都有较大影响。因此需要对BA的浓度和防褐化
添加剂的种类进行进一步的筛选。另外, 从平均
值来看, 提高平均芽数各因素的最好搭配是BA 2.0
图1 山鸡椒愈伤组织诱导与植株再生
Fig.1 Callus induction and plantlet regeneration from L. cubeba
A: 叶片诱导产生的愈伤组织; B: 茎段诱导产生的愈伤组织; C: 愈伤组织分化出不定芽; D: 不定芽生根。
表2 诱导愈伤组织分化的L4(2
3)正交试验结果
Table 2 The callus differentiation results of L4(2
3) orthogonal experiment
处理 BA浓度/mg·L-1 IBA浓度/mg·L-1 活性炭浓度/g·L-1 愈伤组织数/块 平均芽数/个 分化率/%
1 2.0 0.1 1 49 1.17 12.24
2 2.0 1.0 0 49 2.86 14.29
3 1.0 0.1 0 49 2.17 12.24
4 1.0 1.0 1 49 1.00 8.16
平均芽数X1 2.015 (2.0水平) 1.670 (0.1水平) 1.085 (1水平)
平均芽数X2 1.585 (1.0水平) 1.930 (1.0水平) 2.515 (0水平)
分化率X1 13.265 (2.0水平) 12.240 (0.1水平) 10.200 (1水平)
分化率X2 10.200 (1.0水平) 11.225 (1.0水平) 13.265 (0水平)
平均芽数R 0.430 0.260 1.430
分化率R 3.065 1.015 3.065
表中X1、X2分别表示各因素在不同水平上的芽数、分化率的平均值; R代表极差值。
水平+IBA 1.0水平+活性炭0水平, 提高分化率各因
素的最好搭配是BA 2.0水平+IBA 0.1水平+活性炭
0水平。考虑到IBA对于平均芽数和分化率结果的
植物生理学报1050
影响较低, 两个水平之间极差很小, 为进一步提高
分化率, 后续愈伤组织分化诱导优化试验中添加
的IBA浓度均为0.1 mg·L-1。
2.2 愈伤组织不定芽诱导过程中BA浓度的优化
根据以上试验结果, 对分化培养基进行了BA
浓度的优化。从表3可以看出, 随着BA浓度的增
加, 再生的不定芽增长, 但愈伤组织的分化率降
低。此外, BA浓度越高, 愈伤组织发生褐变的起始
时间越早, 接种15 d时, 添加2.0 mg·L-1 BA的培养基
中愈伤组织仍为淡绿色, 而添加5.0 mg·L-1 BA的培
养基中愈伤组织已有大部分发生褐变。总体来看,
BA浓度为2.0 mg·L-1时对愈伤组织分化诱导的效
果最好(图1-C)。
2.3 不同防褐剂对愈伤组织不定芽诱导的影响
添加不同防褐剂的各个处理均出现一定程度
的褐变现象, 同时各处理诱导出不定芽的愈伤组
织块数有所不同。从表4可以看出, 添加维生素C
的处理发生褐变的愈伤组织块数比对照少, 而分
化数较多。添加活性炭处理的褐变数与对照相同,
PVPP和硝酸银的处理发生褐变的数量均比对照
多, 而这3种处理诱导的分化数均比对照的少。从
愈伤组织的生长状况来看, 添加维生素C和PVPP
的处理中愈伤组织有增大, 而添加活性炭和硝酸
银的愈伤组织基本维持转接时的体积。综合比较
不同处理下愈伤组织的生长状况、分化数及褐变
发生情况, 可以认为维生素C的效果最好, 可以适
表3 不同浓度BA对愈伤组织分化的影响
Table 3 Effects of different concentration of BA on differentiation rate of callus
BA浓度/mg·L-1 愈伤组织数/块 分化数/块 分化率/% 生长状况
2.0 35 10 28.57 愈伤组织呈淡绿色, 表面褐化, 芽短小
3.0 35 4 11.43 愈伤组织呈淡绿色, 表面褐化, 芽较长
4.0 35 4 11.43 愈伤组织颜色较深, 表面褐化, 芽较长
5.0 35 3 8.57 愈伤组织颜色深, 大部分褐化, 芽较长
表4 不同防褐剂对愈伤组织生长和分化的影响
Table 4 Effects of different browning antagonists on growth and differentiation of callus
处理 愈伤组织数/块 分化数/块 褐化数/块 愈伤组织生长状况
对照 35 10 8 淡绿色, 表面褐化, 愈伤组织体积变大
活性炭(1 g·L-1) 35 7 8 颜色深, 表面褐化, 愈伤组织未变大
维生素C (50 mg·L-1) 35 11 5 淡绿色, 少数褐化, 愈伤组织体积变大
PVPP (1 g·L-1） 35 9 12 淡绿色, 褐化较多, 愈伤组织体积变大
硝酸银(4 mg·L-1) 35 7 27 颜色深, 大部分褐化, 愈伤组织未变大
表5 不同BA和NAA浓度对不定芽生根的影响
Table 5 Effects of different BA and NAA concentrations on
the root regeneration of adventitious buds
处理 IBA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 生根率/%
1 0.1 0 8.33
2 0.1 0.02 36.00
3 0.1 0.40 8.33
4 0.2 0 12.50
5 0.2 0.02 29.17
6 0.2 0.40 45.33
7 0.5 0 0
8 0.5 0.02 0
9 0.5 0.40 5.56
当添加入培养基中以减少褐变的发生。
3 不同浓度IBA和NAA对不定芽诱导生根的影响
将分化出的不定芽接入添加有不同浓度IBA
和NAA的生根培养基中, 结果如表5所示, 培养20 d
左右观察到少数芽苗基部有白色不定根形成, 不
同处理中不定芽均为皮下生根(图1-D), 培养50 d时
根长可达12 cm, 但总体来看生根率不高。从表5
可以看出, 当IBA浓度从0.1 mg·L-1提高到0.2 mg·L-1
时, 生根率有所提高, 当IBA浓度进一步提高到0.5
mg·L-1时 , 山鸡椒不定芽的生根率则下降至0~
5.56%。培养基中同时添加NAA, 生根率比单独添
林丽媛等: 山鸡椒的愈伤组织诱导及植株再生 1051
加IBA提高了0~32.83%, 可见NAA有利于不定芽
的生根。当1/2MS培养基中添加0.2 mg·L-1 IBA+
0.4 mg·L-1 NAA (处理6), 不定芽的生根率达45.33%。
4 不定芽再生的组织学观察
从茎段纵切片上可以看出, 茎段上不带有腋
芽(图2-A), 将茎段切下来放入愈伤组织诱导培养
基中培养, 培养几天后茎段切口处开始膨大增粗,
形成层区域的细胞分裂加强, 数量增加, 形成脱分
化细胞团(图2-B), 从而进一步形成愈伤组织(张彦
妮等2006)。随后愈伤组织表面出现瘤状突起结
构, 即分生细胞团(宗桦等2010), 局部切面上还可
见呈鸟巢状结构的维管组织(许智宏和刘桂云1980;
刘克斌和李曙轩1991) (图2-C)。将诱导出来的愈
伤组织转移到分化培养基中, 培养14 d后观察到愈
伤组织表面产生肉眼可见的绿芽, 显微观察发现
不定芽是经愈伤组织表面细胞再分化而来(图2-D)。
图2 山鸡椒愈伤组织和不定芽形成的组织学观察
Fig.2 Histological observations on calli and adventitious buds formation of L. cubeba
A: 培养前的茎段纵切面; B: 带有愈伤组织的茎段横切面; C: 鸟巢状维管组织; D: 不定芽发生。
讨 论
进行愈伤组织诱导所采用的外植体多为叶片、
茎段、子叶等(李娟等2004; 洪森荣等2010; 吴瑞刚
等2012), 在不同植物愈伤组织的诱导中, 不同类型
的外植体表现不一。本实验采用了山鸡椒无菌组
培苗的叶片和茎段作为外植体, 这两种外植体均
可诱导出愈伤组织, 但叶片诱导率仅11%, 且愈伤
组织生长慢、易褐化, 诱导效果不理想, 与马崇坚
和胡嘉凯(2005)的研究结果一致。我们在山鸡椒
无菌苗继代过程中发现茎段切口处易形成绿色团
块, 因此尝试直接切取无菌苗茎段诱导愈伤组织,
诱导效果比叶片的好。Lombardi等(2007)在进行
西番莲不定芽再生诱导中采用带根幼苗作为外植
植物生理学报1052
体, 发现可通过愈伤组织分化出不定芽, 其愈伤组
织发生在根处, 我们也曾尝试过将山鸡椒生根苗的
根切段放入培养基进行愈伤组织诱导, 但切下来的
根段很容易褐化, 愈伤组织的诱导率也比较低。
通过正交试验初步筛选出适合愈伤组织分化
诱导的BA和IBA浓度, 并将两个对结果影响较大
的因素, 即BA和防褐化剂分别进行优化。发现高
浓度的BA不利于不定芽的诱导, 且该浓度下愈伤
组织的褐变起始时间变短。王贵章等(2006)在研
究富士苹果茎段不定芽再生中发现, BA浓度在
3.0~5.0 mg·L-1范围内时, 再生芽数随BA浓度升高
而增多; 当BA浓度升高至8.0 mg·L-1时, 不定芽再
生率明显下降。说明不同植物不同外植体再生不
定芽所需BA浓度不同, 在适当浓度范围内可提高
再生率, 浓度过高反而会抑制再生。
一般认为褐变是因植物体内的酚类物质被氧
化成醌类物质而导致的(姚洪军等1999)。马崇坚
和胡嘉凯(2005)认为山苍子发生褐化与富含芳香
油有关, 芳香油渗出后被氧化, 转化产生酚类与饱
和酯类, 从而使外植体严重褐化。本试验中对4种
常用的防褐剂——活性炭、维生素C、PVPP及硝
酸银进行了褐化控制能力的筛选, 发现浓度为50
mg·L-1的维生素C在山鸡椒愈伤组织分化诱导过程
中效果最好。维生素C作为一种抗氧化剂, 可防止
酚类物质氧化, 适当浓度的维生素C可有效减轻褐
变程度, 但浓度过高可能导致再生芽苗产生玻璃
化现象。培养基中添加1 g·L-1的活性炭时, 愈伤组
织生长缓慢, 可能是活性炭吸附培养基中的无机
盐、激素等物质而对愈伤组织的生长产生了影响
(盛长忠等2001)。PVPP和硝酸银在山鸡椒愈伤组
织培养中防褐化效果不理想。本实验以山鸡椒无
菌苗茎段为外植体, 建立了较为稳定的愈伤组织
诱导和植株再生体系, 为山鸡椒的遗传转化和品
种改良奠定了基础。同时, 如何进一步提高山鸡
椒愈伤组织的分化率和不定芽的生根率还需要更
深入的研究。
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