全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 11 期，2009 年 11 月 1075
收稿 2009-08-11 修定 　2009-10-20
资助 国家自然科学基金(30771463, 30871709)和重庆大学研
究生创新团队建设项目(20 0909 B100 7)。
* 通讯作者(E-mail: chenguoping@cqu.edu.cn; Tel: 023-
6 5 1 1 2 6 7 4 )。
辣椒果实中CaRIN转录因子的克隆及其表达分析
胡宗利, 王燕, 王翊, 陈国平 *
重庆大学生物工程学院, 重庆 400044
提要: 根据BLAST获得的表达序列标签设计引物, 从辣椒中分离并鉴定了一个新型转录因子, 命名为CaRIN。与已知MADS-
box蛋白对比表明, CaRIN分别与番茄 LeMADS-RIN和矮牵牛 FBP4有 85%和 77%的同源性, 并且具有典型的MADS-box
类转录因子的特征区域。采用半定量RT-PCR进行特异性表达分析, 结果表明CaRIN在破色期和红熟期辣椒果实中大量表
达, 而在绿熟期辣椒果实和其他辣椒器官中几乎不表达; 同时进行了DNA结合位点和系统发生等生物信息学分析, 这些结
果都表明CaRIN可能参与辣椒果实成熟的调控。
关键词: 辣椒; CaRIN; MADS-box; 克隆; 半定量 RT-PCR
Cloning and Analysis of Expression of CaRIN Transcription Factor from Pep-
per (Capsicum annuum L. cv. Bukang) Fruit
HU Zong-Li, WANG Yan, WANG Yi, CHEN Guo-Ping*
College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China
Abstract: Specific primers were designed based on the EST sequences which were obtained according to
BLAST. A novel transcription factor CaRIN was isolated and characterized from the chili pepper (Capsicum
annuum L. cv. Bukang). Compared with known MADS-box proteins, CaRIN had 85% and 77% sequence
homology with LeMADS-RIN from tomato and FBP4 from petunia, respectively, and contained typical struc-
tural characteristics of MADS-box transcription factors. Analysis of tissue-specific expression of CaRIN was
performed by semi-quantitative RT-PCR. The result showed that CaRIN mRNA was existing mainly in breaker
and red ripening fruits, but hardly detectable in mature green fruit and other organs of pepper. Bioinformatic
analysises, such as DNA-binding residues and phylogenetic analysis, suggested that CaRIN were involved in
regulating pepper fruit ripening.
Key words: pepper; CaRIN; MADS-box; cloning; semi-quantitative RT-PCR
采后的果蔬仍是一个活的有机体, 有活跃的生
理代谢过程, 存在着果蔬成熟衰老所导致的自身耐
贮性、抗病性下降等问题, 是果蔬采后损失的因素
之一。果蔬成熟衰老是一个高度程序化调控的复
杂的生物学过程, 涉及到一系列的生理和生化变
化。根据果蔬的成熟衰老特性, 果蔬常分为呼吸跃
变型和非跃变型两类。在呼吸跃变型果实的成熟
过程中, 由于乙烯对成熟有调控作用, 所以对其研
究较为深入, 已经分离了许多与乙烯生物合成和信
号转导相关的基因, 对其成熟调控机制也有了一定
的认识(Giovannoni 2001), 并建立了以拟南芥和番
茄为代表的模式系统。然而, 除了乙烯以外, 发育
过程也同样影响果实的成熟, 但迄今对植物中普遍
存在的发育调控途径还知之甚少, 所以, 探讨跃变
型和非跃变型果实共有的成熟调控机制就成了这一
领域的研究热点之一。番茄rin (ripening-inhibitor)
突变体的研究表明, 乙烯并非果实成熟调控的惟一
关键因子, 果实成熟过程中还存在着许多调节因子,
但其调控机制仍不清楚(Vrebalov 等 2002)。
番茄 rin 突变体的乙烯生成受到抑制, 所以果
实不能正常成熟, 同时还表现出萼片增大和花序决
定功能丧失。Vrebalov等(2002)报道, rin突变体之
所以不能正常成熟, 是因为它的一个MADS-box转
录因子的基因发生了突变, 通过定位克隆发现这是
由于 rin突变体基因组DNA缺失了约3 kb, 从而导
致相邻两个同属于 MADS-box 基因家族的转录因
子, 即LeMADS-MC和LeMADS-RIN的融合和功能
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的失活, LeMADS-MC 突变导致萼片和花序决定功
能丧失, 而LeMADS-RIN突变则导致果实不能正常
成熟。现有的研究表明, LeMADS-RIN基因具有调
控果实成熟这一专一性, 而且是已知影响果实成熟
的最早起作用的因子。
到目前为止, 仅从番茄和草莓等少数植物中分
离和克隆了全长MADS-RIN基因, 而且只是在番茄
中, 对MADS-RIN的功能进行了较深入的研究(Zhu
等 2008; Yasuhiro等 2008)。辣椒和番茄同属茄科
类植物, 我们在研究辣椒果实成熟分子调控过程中,
分离和克隆到一个与番茄 LeMADS-RIN 基因高度
同源的 MADS-box 蛋白基因, 命名为 CaRIN 基因
(GenBank登录号为DQ999998), 并进一步通过表达
模式分析和生物信息学分析, 推测CaRIN可能参与
辣椒果实成熟的调控。
材料与方法
辣椒品种为‘红辣椒’(Capsicum annuum L. cv.
Bukang), 种植于本校A校区生物工程学院实验田。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株JM109由本实验室
保存。克隆载体 pMD18-T为大连宝生物工程公司
产品 。
RNA提取试剂盒购于北京百泰克生物技术有
限公司; M-MLV 反转录酶为 Fermentas 公司产品;
琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒为大连宝生物公司产
品; T4 DNA 连接酶为 Promaga 公司产品; 其他试
剂均为国产分析纯。
所用引物见表 1, 由上海 Invitrogen公司合成。
表 1 实验中用到的引物
Table 1 Primers used in this experiment
引物编号 引物序列 引物描述
R1 5-CAAATAAGGTCAACTAAGACACAAC-3 3 RACE 外侧引物
R2 5-AAAGTTGGAAGAACTTGGTGTTGCC-3 3 RACE 内侧引物
R3 5-CTATAGCCTATACACAATGGGTAGA-3 CaRIN 全长 cDNA 上游引物
R4 5-CTGCATAATTCCAAGTGTTTGCTAG-3 CaRIN 全长 cDNA 下游引物
WT 1 5-GACTCTAGACGACATCGA(T)18-3 反转录引物
WT 2 5-GACTCTAGACGACATCGA-3 通用引物
A1 5-TTGGACTCTGGTGATGGTGTG-3 辣椒肌动蛋白上游引物
A2 5-AACATGGTTGAGCCACCACTG-3 辣椒肌动蛋白下游引物
A3 5-TATGGTGCACTTGAAGGAAC-3 表达特异性分析上游引物
A4 5-GGCACATTATCGTATCCGTA-3 表达特异性分析下游引物
取开花期辣椒的根、茎、叶和花为材料。花
期挂牌, 开花后不同天数采摘不同成熟度的辣椒果
实: 绿熟期(mature green, 辣椒果实呈青色, 体积不
再长大, 但还没有变黄), 破色期(breaker, 辣椒果实
刚由青色变成黄色, 是辣椒成熟开始的标志), 红熟
期(red ripening, 辣椒果实完全变红, 果实完全成
熟)。然后将上述试验材料加液氮研磨成细粉末
状, 按照 RNA 提取试剂盒的步骤提取总 RNA, 并
贮存于-80 ℃冰箱中备用。
利用LeMADS-RIN的DNA序列对辣椒EST数
据库(www.tigr.org)进行同源性搜索, 发现 TC4434
与 LeMADS-RIN 的序列同源性最高。而后根据
TC4434序列设计3 RACE外侧引物R1和3 RACE
内侧引物 R2。先以破色期的辣椒果实总 RNA (约
5 μg)为模板, 以 WT1 为引物进行反转录以获得
cDNA 第一链。然后用引物对 R1/WT2 进行第一
轮 PCR。以第 1 轮 PCR 产物稀释 50 倍为模板, 用
引物 R2 和通用引物 WT2 进行第 2 次 PCR。PCR
扩增程序为: 94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 30 s、
56 ℃复性 30 s、72 ℃延伸 30 s, 35 个循环; 最后
72 ℃延伸 5 min。PCR 产物经电泳分离, 采用琼
脂糖凝胶 DNA 纯化试剂盒纯化, 连接到 pMD18-T
载体, 转化 JM109大肠杆菌, 送样到上海 Invitrogen
公司测序。
为了得到辣椒CaRIN基因的全长片段, 分析以
上 3 RACE克隆片段和TC4434序列, 设计引物R3
和R4, 以上述所得cDNA第一条链为模板进行PCR
扩增, 反应条件为: 94 ℃预变性1 min; 94 ℃变性10
s、53 ℃复性 30 s、72 ℃延伸 1 min, 35 个循环;
最后 72 ℃延伸 10 min。扩增产物经 1.5% 琼脂糖
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凝胶电泳检测后, 回收目的片段。连接到 pMD18-
T 载体中, 转化 J M 10 9 大肠杆菌, 送样到上海
Invitrogen 公司测序。
以辣椒肌动蛋白基因的组成型表达为参照, 采
用半定量 RT-PCR, 研究目的基因在辣椒不同器官
以及不同发育时期果实中的表达模式。以引物对
A1/A2进行辣椒肌动蛋白基因的PCR扩增, 以引物
对 A3/A4 进行目的基因的 PCR 扩增, PCR 产物经
1.5%琼脂糖凝胶电泳, BioRad凝胶成像系统拍照并
分析。
结果与讨论
1 CaRIN全长cDNA的克隆和鉴定
根据 BLAST分析可以看到, 辣椒 EST数据库
中的TC4434序列与LeMADS-RIN基因(AF448522)
高度同源。再根据 TC 44 3 4 序列设计特异引物
R1、R2, 用反转录引物 WT1 和通用 WT2, 并用
3 RACE 技术, 获得长度约为 300 bp 的 3 末端序
列。通过比较以上克隆片段和TC4434序列的重叠
区域, 推导出 CaRIN 的全长 cDNA 序列。而后设
计特异引物 R3 和 R4, 经 RT-PCR 获得 CaRIN (约
1 042 bp)的完整序列, 此序列与我们推导的 cDNA
序列一致。序列分析表明, CaRIN完整的 cDNA序
列(GenBank登录号为DQ999998)具有1 042 bp, 其
5 末端具有 74 bp 非翻译区, 3 末端具有 236 bp 非
翻译区。该 cDNA 包含 732 bp 开放阅读框, 编码
了一个具有 243 个氨基酸的蛋白。该蛋白的预测
分子量约 28 kDa, 等电点为 8.09。CaRIN 的预测
氨基酸序列与不同植物的已知 MADS-box 蛋白进
行同源性比较表明, CaRIN分别与番茄的LeMADS-
RIN 和矮牵牛的 FBP4 具有 85% 和 77% 的同源性
(图 1)。序列分析表明, CaRIN 也存在一些在所有
MADS-box蛋白间高度保守的区域, 如MADS结构
域和 K 结构域。
图 1 CaRIN 推导的氨基酸序列的同源性和保守结构域的分析
Fig.1 Alignment and conserved domains analysis of the deduced amino acid sequence of CaRIN gene
2 DNA结合位点预测与分析
MADS-box是植物中常见的转录因子家族, 已
有的报道认为所有的 M A D S - b o x 蛋白都具有
MADS-box结构域, 并且该结构域是结合DNA所必
需的(Santelli 和 Richmond 2000), 但是这一区域的
DNA 结合位点尚不清楚。采用 BindN、DP-Bind
和DISIS运算法则, 对CaRIN中最有可能结合DNA
的序列进行预测的结果表明, MADS-box结构域中
存在很多可能与 DNA 结合的氨基酸残基。另外,
一些存在于 MADS-box 结构域之外的氨基酸残基
仍然可能起着结合 D N A 的作用, 而这些残基
(Arg136-Lys142)属于K结构域(图2), 由此可见K结
构域的一些氨基酸残基也可能参与CaRIN与DNA
的结合。
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图 2 CaRIN 与 DNA结合的预测氨基酸位点
Fig.2 Predicted DNA-binding residues in CaRIN
图 3 不同物种间 MADS-box 蛋白的种系发生关系
Fig.3 Phylogenetic analysis of MADS-box proteins from different species
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3 CaRIN的系统发生分析
MADS-box 蛋白是一大类植物中推定转录因
子的高度保守的基因家族, 在植物发育和信号转导
过程中起作用(Messenguy 和 Dubois 2003; Ng 和
Yanofsky 2001)。而且从不同植物种类中分离得到
的 MADS-box 基因的数目不断提高(Theissen 等
2000)。为了确定各种植物种类中不同 MADS-box
蛋白间的进化关系, 采用 http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/blast/Blast.cgi 所提供的资料, 编制出系统发生
树, 并且所采用的氨基酸序列均存于GenBank数据
库中(图 3)。
该系统发生树将CaRIN蛋白置于与LeMADS-
RIN、LeMADS-rin 和 FBP4 相同的进化枝中。该
进化枝中的LeMADS-RIN是在果实成熟调控中起
作用的MADS-box蛋白。如番茄中成熟抑制(RIN)
位点发生突变, 则番茄果实就不能成熟, 而且萼片
变大。CaRIN和LeMADS-RIN 的序列高度同源表
明 CaRIN 可能也参与果实成熟的调控。与番茄和
辣椒相比, 矮牵牛果实为蒴果, 不是肉质型果实, 可
以推测该类转录因子可能会对不同果实类型的成熟
产生影响。
4 CaRIN特异性表达分析
提取开花期辣椒的根、茎、叶、花以及不
同成熟度的辣椒果实总RNA, 以辣椒肌动蛋白基因
的组成型表达为内参, 进行 CaRIN 基因的半定量
RT-PCR 分析的结果表明, CaRIN 在破色期的辣椒
果实和红熟期辣椒果实中大量表达, 而在绿熟期辣
椒果实和其他辣椒器官中几乎不表达(图 4)。该基
因的表达模式与Hileman等(2006)报道的LeMADS-
RIN的表达模式一致, 由此可以推测CaRIN可能具
有与 LeMADS-RIN 相似的功能。
我们用CaRIN基因序列对番茄功能基因组数
据库(Tomato Functional Genomics Database)进行
BLASTn 搜索的结果表明, 探针 1-1-8.2.16.2 对
CaRIN 显示出最大的序列同源性。从数据库得到
的该基因的表达结果(图5)可以看出, CaRIN在破色
期后高度表达, 这一结果与我们的半定量 RT-PCR
的结果一致。因此可以推断, CaRIN可能控制着能
够调控辣椒果实发育的成熟特异基因的表达。
图 4 CaRIN 的半定量 RT-PCR 分析
Fig.4 Semi-quantitative RT-PCR analysis of CaRIN
gene in different organs of peppers
1: 根; 2: 茎; 3: 叶; 4: 花; 5: 绿熟期果实; 6: 破色期果实; 7: 红
熟期果实。
图 5 果实成熟过程中 CaRIN 的表达
Fig.5 Expression of CaRIN gene during fruit ripening
授粉后 39 d 进入绿熟期, 42 d 进入破色期, 50 d 进入红熟期。
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