全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 2031~2038　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0498 2031
收稿 2015-09-15　　修定 2015-11-09
资助 国家自然科学基金(31300217)和中国科学院西部之光项目
(XBBS201209)。
致谢 中国科学院新疆生态与地理研究所研究生徐喆、张杰以
及新疆大学干旱生态环境研究所的李岩博士在样品采集
中给予帮助。
* 通讯作者(E-mail: zhangml@ibcas.ac.cn; Tel: 0991-7823151)。
松叶猪毛菜干旱胁迫下实时定量PCR内参基因的筛选
闻志彬1, 张明理1,2,*
1中国科学院新疆生态与地理研究所, 中国科学院干旱区生物地理与生物资源重点实验室, 乌鲁木齐830011; 2中国科学院植
物研究所, 北京100093
摘要: 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)是研究植物基因定量表达的常用手段之一, 选择合适的内参基因是获得可信定量结果
的前提。本文以不同干旱胁迫处理下松叶猪毛菜的叶片为材料, 应用qRT-PCR技术分析5个常用候选管家基因(18S rRNA、
α-tubulin、β-actin、EF1-α和GAPDH)的表达变化, 利用geNorm和NormFinder软件筛选出在干旱胁迫下表达最稳定的内参
基因。结果表明, 以不同干旱胁迫处理的所有样品作为总样品池进行内参基因筛选时, 候选内参基因表达稳定性顺序依次
是β-actin>α-tubulin>GAPDH>EF1-α>18S rRNA。对同一干旱处理的样品进行内参基因筛选时, 5个候选内参基因表达稳定
性存在明显差异, 其中β-actin表达稳定度最高。因此, β-actin是研究松叶猪毛菜干旱胁迫下基因表达最合适的内参基因。
关键词: 松叶猪毛菜; 实时荧光定量PCR; 内参基因; 干旱胁迫; 藜科
Reference Gene Selection for Real-Time Quantitative PCR in Salsola laricifolia
under Soil Drought Stress
WEN Zhi-Bin1, ZHANG Ming-Li1,2,*
1Xinjiang Institute of Ecology and Geography, Chinese Academy of Sciences, Key Laboratory of Biogeography and Bioresource in
Arid Land, Urumqi 830011, China; 2Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
Abstract: Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) is one of the common technologies used for gene expression
analysis. Selection of a suitable reference gene is a prerequisite to obtain the reliable results. In this study, five
housekeeping genes including ribosomal RNA 18S (18S rRNA), α-tubulin, β-actin, elongation factor 1 alpha
(EF1-α) and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of the desert plant, Salsola laricifolia, were
selected as candidate reference genes in the qRT-PCR, and two softwares, geNorm and NormFinder, were used
to evaluate their expression stabilities in the leaves of S. laricifolia under soil drought stress in order to obtain a
reliable reference gene. The results showed that there were significant differences among the five candidate ref-
erence genes under different soil drought stress treatments. And the order of expression stability was β-act-
in>α-tubulin>GAPDH>EF1-α>18S rRNA. While this order of expression stability was different under the same
soil drought stress treatment, but the expression stability of β-actin was highest. In a word, β-actin was the most
stable gene for analysis gene expression in S. laricifolia under soil drought stress.
Key words: Salsola laricifolia; real-time quantitative PCR; reference gene; soil drought stress; Chenopodiaceae
松叶猪毛菜隶属于藜科(Chenopodiaceae)猪毛
菜属(Salsola), 小灌木, 主要分布于中国(新疆、内
蒙古、宁夏和甘肃)、蒙古、哈萨克斯坦和吉尔吉
斯斯坦的砾质山坡和荒漠(Wen等2014)。我们的
前期研究发现松叶猪毛菜是藜科中又一C3-C4中间
型植物(Wen和Zhang 2015)。C3-C4中间型植物一
直受到研究学者的关注, 与C3植物相比, C3-C4中间
型植物在叶片解剖结构和光合生理上具有很多中
间型的性状, 研究它们有助于了解C4植物的进化以
及光呼吸减少的机制(Edwards和Ku 1987)。然而
有关该荒漠特殊植物基因功能的研究方兴未艾。
实时荧光定量PCR (real-time quantitative
PCR, qRT-PCR)是在传统聚合酶链式反应基础上
发展起来的一种新的核酸定量技术(Mackay 2004),
具有定量快速准确、重复性好、高灵敏度和特异
植物生理学报2032
性强等优点, 已经成为当今分子生物学研究中检
测基因表达水平的重要方法(Heid等1996; Bustin等
2009)。qRT-PCR包含两种定量方式, 即绝对定量
和相对定量。相对变量是指在一定样本中, 相对
于另一个参照样本, 靶序列的表达趋势和相对变
化量, 是科学研究中最常用到的定量方式(魏毅东
等2013)。与传统的检测基因表达水平的研究方法
(如Northern印记、原位杂交)相比, 利用qRT-PCR
方法计算基因相对表达量时, 为了消除不同样品
之间因RNA质量、酶促反应效率的不同以及其他
因素引起的偏差, 通常需要引入一个表达较为稳
定的管家基因作为内参基因对其进行校正(张艳君
等2007; Cruz等2009)。在目前植物学研究中, 常用
的稳定表达的管家基因有18S核糖体RNA (18S
rRNA)、28S核糖体RNA (28S rRNA)、微管蛋白基
因(tubulin)、肌动蛋白基因(actin)、甘油醛-3-磷
酸-脱氢酶基因(GAPDH)、延伸因子基因(EF1-α)
以及泛素基因(ubiquitin)等(Shin和Schachtman
2004; Li等2005; Jeong等2006)。虽然管家基因被
认为组成型表达(Czechowski等2005), 但是许多研
究表明这些管家基因在不同的植物、同一植物的
不同组织器官、不同生长发育阶段都会有不同程
度的表达差异(Suzuki等2000; Warrington等2000;
孙美莲等2010; 苏晓娟等2013; 魏毅东等2013; 王
金星等2014; Xiao等2015), 管家基因只是在一定条
件下表达相对稳定, 并非在任何条件下qRT-PCR中
都通用的内参基因(Thellin等1999; Warrington等
2000)。因此根据不同的材料, 不同的实验设计选
择合适的内参基因在qRT-PCR中就很有必要(Bus-
tin等2009; 王彦杰等2012)。目前, 已有不少关于植
物内参基因评估的研究报道, 如水稻(Kim等2003;
魏毅东等2013)、玉米(姜婷等2015)、盐角草(Xiao
等2015)、毛果杨(苏晓娟等2013)、茶树(孙美莲等
2010)、刺槐(王金星等2014)、牡丹(王彦杰等
2012)、苹果(樊连梅等2014)、小麦(Paolacci等
2009)、大豆(Jian等2008)、拟南芥(Remans等
2008)等。
干旱缺水是我国西北干旱地区的典型生态特
征(冯燕等2011), 也是影响植物生长发育和限制植
物分布的最关键因素之一(Biehler等1996; 肖春旺
和周广胜2001), 这主要是因为干旱胁迫引起植物
生理功能如光合作用和生长调控的改变 (Car-
mo-Silva等2008; 闻志彬和张明理2015), 相应地,
植物基因的转录和翻译也会发生改变(Babayev等
2014; Doubnerová Hýsková等2014)。近年来研究
表明, 不仅不同逆境处理下内参基因的表达量存
在较大差异, 甚至是不同的处理条件也需要不同
的内参基因(Jian等2008; 魏毅东等2013)。因此, 利
用qRT-PCR进行干旱胁迫下松叶猪毛菜基因表达
分析时, 内参基因选择的问题就不容忽视了。为
了更好地研究松叶猪毛菜在干旱胁迫下基因表达
水平与调控, 本研究选取qRT-PCR技术开展5个常
用的候选内参基因(18S rRNA、α-tubulin、β-actin、
EF1-α和GAPDH)的表达量分析, 并利用geNorm和
NormFinder软件比较分析了5个内参基因的表达变
化, 以期筛选出在干旱胁迫下表达最稳定的内参
基因, 为进一步开展松叶猪毛菜的分子生物学研
究奠定基础。
材料与方法
1 植物材料和处理
松叶猪毛菜(Salsola laricifolia Turcz. ex Litv.)
种子于2013年9月采自新疆托里县铁厂沟镇, 置于
4 ℃条件下保存。试验于2014年在中国科学院新
疆生态与地理研究所进行, 盆栽所用塑料盆30 cm
(高)×26 cm (内径), 土壤采用3:1 (V/V)混合的基质
土与沙土, 田间持水量为24.5%。4月份在室外播
种松叶猪毛菜的种子, 采取自然光照, 盆栽苗上方
设防雨棚, 并对植物进行正常水分管理, 确保植株
生长良好。干旱胁迫处理前1周进行定苗, 每盆保
留3株。待松叶猪毛菜长至为10~12周, 开始进行
干旱胁迫试验。试验共设4个处理, 分别为田间持
水量的80% (对照)、60% (轻度干旱胁迫)、45%
(中度干旱胁迫)和35% (重度干旱胁迫) (闻志彬和
张明理2015), 每处理重复3次。处理期间, 每天用
称重法补充损失的水分, 使其维持在各预定胁迫
条件, 处理5 d后于2014年8月2日上午12: 00收集植
株健康叶片, 液氮速冻后, −80 ℃贮藏备用。
2 总RNA的提取和cDNA合成
利用RNA植物提取试剂盒(QIANGEN)提取
叶片总RNA, 并用DNase I (RNase free)消化去除
DNA污染。总RNA质量用1.5%琼脂糖凝胶电泳检
闻志彬等: 松叶猪毛菜干旱胁迫下实时定量PCR内参基因的筛选 2033
测, 紫外透射光下观察并拍照。随后, 按照AMV
First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Sangon)操
作方法, 将各样品总RNA反转录合成cDNA第一条
链。获得的cDNA产物直接用于PCR或−20 ℃贮藏
备用。
3 内参基因的选择及特异性引物的设计
选取松叶猪毛菜5种管家基因(18S rRNA、
α-tubulin、β-actin、EF1-α和GAPDH)作为候选的
内参基因, 这5种基因均为本实验室自行克隆得到,
尚未登录信息。所得序列与GenBank已注册的基
因序列经比对同源性都很高。根据实时荧光定量
PCR的引物设计原则, 利用Primer Premier v5.0软
件设计各内参基因的qPCR引物(表1)。
4 内参基因目的片段的普通PCR扩增
反应体系为25 µL, 包括12.5 µL 2×GC缓冲
液、0.2 µL 10 mmol·L-1 dNTP、0.5 µL 10 µmol·L-1
上游引物、0.5 µL 10 µmol·L-1下游引物、0.2 µL
Taq DNA聚合酶、1 µL cDNA模板和10.1 µL
ddH2O。反应条件为95
℃预变性3 min; 94 ℃变性
30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 33个循环; 72 ℃
延伸10 min。最后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测
扩增产物。
5 内参基因的qRT-PCR分析
采用CFX96 Real-Time PCR Detection System
(Bio-Rad, USA)进行各内参基因的qPCR分析。反
应体系20 µL, 包括SYBR Green Fast qPCR Master
Mix (BBI) 10 µL、10 µmol·L-1上游引物0.4 µL、10
µmol·L-1下游引物0.4 µL、cDNA 2 µL和ddH2O 7.2
µL。每个样品重复3次, 并设置不加模板的阴性对
照。反应条件为95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s,
55 ℃退火10 s, 72 ℃延伸15 s, 40个循环。采集溶
解曲线荧光信号。实验数据采用相对定量法分析。
6 数据分析
用geNorm v3.5和NormFinder v20软件, 根据5
个常用内参基因在不同干旱胁迫下的相对表达量
(Q)对各个内参基因的表达稳定性进行统计学分
析, 从而筛选出表达相对稳定的内参基因。根据
公式Q=EΔCt计算各基因的相对表达量, 其中E为基
因扩增效率, 一般默认为2, 即扩增效率为100%;
ΔCt=Ct (min)−Ct (样品), Ct (min)为所有样品中最低的Ct值,
Ct (样品)为每个样品的Ct值(孙美莲等2010; 苏晓娟等
2013)。
表1 qRT-PCR中5种候选内参基因的引物序列
Table 1 The primers of candidate reference genes used in qRT-PCR
基因名称 引物序列(5′→3′) 扩增产物大小/bp
18S rRNA 正向: GGGCATTCGTATTTCATAGTCA; 反向: CGGCATCGTTTATGGTTGA 159
α-tubulin 正向: CCATACCCCAGGATTCACTTC; 反向: CACACTTTGCCATCATAGACGA 136
β-actin 正向: TCCACGAAACAACCTACAACTC; 反向: CAGCAATACCGGGGAACAT 111
EF1-α 正向: TCAGTTTGGTGGTTATTGGACA; 反向: ACCTCTTGTTCATCTCAGCAGC 135
GAPDH 正向: AACGAGCACGAATACAAGTCAG; 反向: AGCCCCTCAAGAATACCGA 116
图1 松叶猪毛菜各试验样品总RNA电泳分析
Fig.1 Agarose gel analysis of total RNA extracted from
different samples of S. laricifolia
1~3: 对照; 4~6: 轻度干旱胁迫; 7~9: 中度干旱胁迫; 10~12: 重
度干旱胁迫。
实验结果
1 RNA样品的质量检测
1.5%琼脂糖凝胶电泳显示, 各样品总RNA电
泳图谱带型清晰, 没有弥散现象, 且28S rRNA带比
18S rRNA带更亮(图1), 说明RNA完整良好, 没有
降解。再用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度, 结
果表明A260/A280以及A260/A230均在2.0左右, 说明RNA
的纯度较高, 符合后续实验的要求。
2 内参基因片段的PCR扩增
以叶片总RNA为模板扩增各内参基因片段,
植物生理学报2034
经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示, 在100~250 bp之间存
在较亮的特异条带, 与预期的片段大小一致(图2),
并且没有引物二聚体及非特异性条带, 表明扩增
反应具有较高的专一性, 可用于qRT-PCR分析。
3 内参基因Ct值分析
基因的Ct值大小是与其表达量成反比, 即Ct值
越小, 表达量越大, 反之亦然。qRT-PCR的结果表
明, 5个内参基因的C t值在10~33之间, 其中18S
rRNA的Ct值最小, 在10~13之间, GAPDH的Ct值在
15~20之间, α-tubulin和β-actin的Ct值相差不大, 在
20~25之间, 而EF1-α的Ct值最大, 在25~33之间(图
3)。表明这5个内参基因的表达量不同, 存在一定
的差异。
4 内参基因的qRT-PCR分析
将反转录的cDNA混合样品以5倍的浓度梯度
进行稀释, 并以此为模板进行qRT-PCR扩增, 制作5
种内参基因的标准曲线, 结果表明, 5个内参基因的
引物的扩增效率在95.3%~104.1%之间, 线性相关
系数(R2)≥0.980 (表2), 符合qRT-PCR对扩增效率
的要求。5个内参基因的熔解曲线都只有明显的
单一信号峰, 且重复样品间扩增曲线的重复性好
(图4), 说明qRT-PCR反应具有较高的特异性, 结果
准确可信。
5 内参基因的稳定性分析
将所有处理的样品一起进行内参基因表达分
析, 利用geNorm和NormFinder软件对各内参基因
的相对表达量进行统计分析的结果一致, 即在干
旱胁迫下5个候选内参基因表达稳定性由高到底
排序为β-actin>α-tubulin>GAPDH>EF1-α>18S
rRNA (表3)。表明β-actin和α-tubulin稳定性较好,
18S rRNA稳定性最差。
另外, 对同一干旱处理下5个内参基因的稳定
性进行分析, 结果显示, 同一处理下的两个软件分
析结果基本一致, β-actin表达均最稳定, 但是不同
处理之间内参基因表达稳定性存在差异。在对
照、轻度干旱胁迫(T1)、中度干旱胁迫(T2)、重
度干旱胁迫(T3)中, 5个候选内参基因表达稳定性
由高到底排序分别为β-act in>EF1-α>α-tubu-
lin>GAPDH>18S rRNA、β-actin>α-tubulin=GAP-
DH>EF1-α>18S rRNA、β-actin>GAPDH>α-tubu-
l in>EF1-α>18S rRNA、β-act in=α- tubul in>
GAPDH>EF1-α>18S rRNA (表4)。这表明在同一
处理条件以及不同处理之间, 候选的内参基因的
稳定性均存在差异。
讨　　论
实时荧光定量PCR技术已经成为分子生物学
中研究基因表达的重要工具(Heid等1996; Bustin等
2009)。应用qRT-PCR技术分析基因表达时, 使用
图2 五种候选内参基因的PCR扩增产物
Fig.2 PCR products of five candidate reference genes
1: β-actin; 2: GAPDH; 3: EF1-α; 4: α-tubulin; 5: 18S rRNA。
图3 五种候选内参基因的Ct值分布
Fig.3 Distribution of Ct values of five candidate reference
genes across all samples
表2 qRT-PCR分析中5种候选内参基因的相关系数
Table 2 The parameters derived from qRT-PCR analysis of
five candidate reference genes
基因名称 扩增效率/% 斜率 R2
18S rRNA 104.1 −3.228 0.9972
α-tubulin 99.5 −3.334 0.9862
β-actin 95.3 −3.441 0.9991
EF1-α 97.7 −3.378 0.9991
GAPDH 99.5 −3.334 0.9986
闻志彬等: 松叶猪毛菜干旱胁迫下实时定量PCR内参基因的筛选 2035
稳定的内参基因是获得可信定量结果的前提(Bus-
tin等2009; 王彦杰等2012)。近来的研究表明, 没有
任何一个管家基因是通用的内参基因, 若不经筛
选而以一种管家基因作为任何条件下的内参, 得
到的结果精确度大大降低, 甚至是错误的(Suzuki
等2000; Vandesompele等2002; Bustin等2009)。因
此, 在分析目标基因表达之前, 很有必要对特定材
料的管家基因进行筛选。
目前, 可用于评价内参基因稳定的软件较多,
其中geNorm和NormFinder是经常被用到的, 它们
的运行原理类似, 将运算后产生的表达稳定值排
序, 最后将表达稳定值最小的基因视为最稳定的
图4 松叶猪毛菜5个候选内参基因的qRT-PCR溶解曲线
Fig.4 qRT-PCR melting curves of five candidate reference genes of S. laricifolia
植物生理学报2036
内参基因(魏毅东等2013; 王金星等2014)。本研究
采用geNorm和NormFinder软件分析比较了干旱胁
迫下松叶猪毛菜5个常用候选管家基因的表达稳
定性。以不同干旱处理的所有样品作为总样品池
进行内参基因筛选时, 经2种软件计算得出一致的
结果, 即β-actin和α-tubulin稳定性较好, 18S rRNA
稳定性最差(表3)。而对同一干旱处理的样品进行
内参基因筛选时, 结果略有不同(表4)。对照、轻
度干旱胁迫、中度干旱胁迫以及重度干旱胁迫的
各个样品中表现较稳定的内参基因分别是β-actin
和EF1-α, β-actin、α-tubulin和GAPDH, β-actin和
GAPDH, β-actin、α-tubulin和GAPDH, 稳定性最差
的内参基因都是18S rRNA。
actin基因编码的肌动蛋白是真核生物普遍存
在的一种重要蛋白质, 参与细胞分裂、形态维持
以及生长等多种重要的生理活动, 几乎在所有真
核细胞中均有表达(苏晓娟等2013)。除了基因序
列高度保守外, 还具有mRNA表达数量高、数量稳
定等特点(颜凤霞等2013), 被认为是qRT-PCR中内
参基因的最佳选择(Santella和Chun 2011)。如β-ac-
tin在茶树的不同器官组织(孙美莲等2010)和荔枝
果实发育不同阶段以及外源生长调节剂处理后(魏
永赞等2012)表达最稳定; actin是黄花蒿叶片在不
同浓度镉处理下表达稳定性最好的 (周良云等
2014); 在刺槐不同植株、不同器官间act in、
GAPDH和18S rRNA表达相对稳定(王金星等2014);
在杨树叶片及根组织中actin表达最稳定(Xu等
2011); 在毛果杨的不同组织以及锌胁迫下, actin、
ubiqutin、EF1-α和18S rRNA的稳定性较好(苏晓娟
等2013); 盐角草在氮处理干旱胁迫或不同发育阶
段, actin都是最佳的内参基因选择(Xiao等2015)。
本研究结果也表明, 在各处理中β-actin是最合适的
内参基因(表3和4)。
本研究各试验中最不合适作为内参基因的是
18S rRNA (表3和4)。而关于该基因作为内参基因
的使用, 目前还是存在较大的争议。这是因为18S
rRNA与目的mRNA相比表达丰富过高, 在qRT-
PCR进行数据分析时基线值对其影响过大且很难
扣除(Vandesompele等2002), 更重要的是, 18S rRNA
的末端没有poly (A)加尾, 当使用oligo-dT进行反转
录或以mRNA为模板时, 18S rRNA就不能作为内参
(Stürzenbaum和Kille 2001)。但是也有不少研究表
明18S rRNA表达也是相对稳定的, 可作为内参基
因(Xu等2011; 苏晓娟等2013; 王金星等2014; 周良
云等2014)。
另外, 本研究中α-tubulin、GAPDH和EF1-α在
不同处理下表达的稳定性不一致(表4)。王彦杰等
(2012)在研究牡丹不同组织和切花开放不同时期
花瓣中、Migock和Papierniak (2011)在研究黄瓜不
同组织及遭受不同生物胁迫时均发现tubulin表达
不稳定。虽然在本试验中EF1-α和GAPDH表达相
对不稳定, 但它们在毛果杨(苏晓娟等2013)、小麦
表3 所有样品中5种候选内参基因的表达稳定性值(SV)
Table 3 The expression stability value (SV) of candidate
reference genes in all samples
分析软件 β-actin α-tubulin GAPDH EF1-α 18S rRNA
NormFinder 0.004 0.009 0.013 0.047 0.049
geNorm 0.041 0.044 0.045 0.073 0.076
表4 干旱胁迫下5种候选内参基因的稳定值
Table 4 The expression stability value (SV) of candidate reference genes under drought stress
处理 分析软件 各内参基因的稳定值
β-actin α-tubulin GAPDH EF1-α 18S rRNA
对照 NormFinder 0.003 0.013 0.019 0.004 0.049
geNorm 0.028 0.030 0.035 0.030 0.058
轻度干旱 NormFinder 0.005 0.010 0.010 0.042 0.058
geNorm 0.045 0.046 0.046 0.088 0.094
中度干旱 NormFinder 0.003 0.005 0.004 0.012 0.017
geNorm 0.012 0.016 0.013 0.018 0.069
重度干旱 NormFinder 0.001 0.001 0.011 0.078 0.093
geNorm 0.060 0.060 0.068 0.087 0.098
闻志彬等: 松叶猪毛菜干旱胁迫下实时定量PCR内参基因的筛选 2037
不同器官以及不同试验条件下(袁伟等2012)、茶
树不同成熟度叶片和愈伤组织(孙美莲等2010)中
却表现出较高的表达稳定性。这表明tubulin、
GAPDH和EF1-α在不同处理下缺乏稳定性, 在某
些条件下不适合选作内参基因。
综上所述, 对松叶猪毛菜进行干旱胁迫下实
时荧光定量PCR时可以选用β-actin作为内参对目
的基因的表达进行校正。由于geNorm和Norm-
Finder软件分析所得到的结果一致, 这在一定程度
上也说明本研究筛选出的内参基因可靠。在同一
干旱处理下松叶猪毛菜叶片中的候选内参基因表
达稳定性存在差异, 表明即使在同一处理条件下
也有必要对内参基因进行评估。本研究为开展干
旱胁迫下松叶猪毛菜功能基因的表达分析奠定了
基础, 同时也可为其他植物内参基因的筛选提供
参考。
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