全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (6): 551~556 551
收稿 2010-12-04　　修定 2011-02-07
资助 国家重点基础研究发展计划(973)项目(2007CB108805)。
* 通讯作者(E-mail: kxtang1@yahoo.com; Tel: 021-65643552)。
过量表达GLOase导致转基因拟南芥中维生素C含量和抗逆能力提高
李坤岚1, 郭新波1, 康以萌1, 孙小芬1, 唐克轩1,2,*
1复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室, 复旦-交大-诺丁汉植物生物技术研发中心, 上海200433; 2上海交通大学
农业与生物学院植物生物研究中心, 上海200240
摘要: L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(L-gulono-1,4-lactone oxidase, GLOase)是维生素C合成途径中最后一步关键酶, 小鼠(Mus
musculus)编码GLOase的gulo基因转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)的转基因株系中维生素C含量最高为5.74 µmol·g-1 (FW),
是野生型的3.46倍、转p2301空载体对照的3.19倍。30%聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫的不同时间梯度中, 幼苗期转基
因拟南芥丙二醛含量低于同样处理下野生型和对照组拟南芥。不同NaCl浓度的盐胁迫下, 转基因拟南芥在子叶期比野生
型、对照组平均根长更长、侧根发育更好; 幼苗期莲座叶长势更好、丙二醛含量更低。结果显示过量表达GLOase的转基
因拟南芥在维生素C含量提高的同时, 抗胁迫能力有所增强。
关键词: 维生素C; 拟南芥; L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶; 干旱胁迫; 盐胁迫
Increase of Vitamin C Level and Stress Tolerance of Transgenic Arabidopsis
thaliana Overexpressing GLOase
LI Kun-Lan1, GUO Xin-Bo1, KANG Yi-Meng1, SUN Xiao-Fen1, TANG Ke-Xuan1,2,*
1State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Cen-
ter, Fudan University, Shanghai 200433, China; 2Plant Biotechnology Research Center, School of Agriculture and Biology, Shang-
hai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Abstract: L-gulono-1,4-lactone oxidase (GLOase) was the last key enzyme in native vitamin C synthesis. Gulo
which encoded GLOase in mice (Mus musculus) was transformed into Arabidopsis thaliana. Transgenic A.
thaliana overexpressing GLOase accumulated vitamin C which was 3.46-fold of WT and 3.19-fold of p2301
blank transformed control. During 30% PEG-6000 mocked drought stress, lower malondialdehyde (MDA) con-
tent was witnessed in young transgenic A. thaliana plants, which was a demonstration of better anti-drought
ability. NaCl salt stress assay showed the enhanced salt tolerance of transgenic A. thaliana plants concerning
root development and MDA level. The results indicated that overexpressing GLOase increased vitamin C level
and stress tolerance of transgenic A. thaliana plants.
Key words: vitamin C; Arabidopsis thaliana; L-gulono-1,4-lactone oxidase; drought stress; salt stress
维生素C (L-ascorbic acid, AsA)是植物抗氧化
系统中非酶抗氧化物质的重要成员之一。它协同
相关作用酶清除植物在正常生理状态、干旱、盐
渍等逆境胁迫中产生的活性氧(reactive oxygen
species, ROS), 保护机体免受氧化损伤(Conklin和
Barth 2004; Pavet等2005)。人类及部分动物由于
自身缺乏有活性的L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(L-
gulono-1,4-lactone oxidase, GLOase, EC 1.1.3.8), 无
法正常合成维生素C, 必须通过日常饮食补充
(Chatterjee 1973; Roig等1993; Nishikimi和Yagi
1994; Inai等2003)。研究高等植物维生素C的合成
与代谢对提高植物的特殊营养品质和抵御胁迫能
力, 均具有重要意义。
前人研究表明过量表达维生素C代谢途径的
关键酶, 能提高拟南芥、生菜、烟草等植物的维
生素C含量。1963年, Loewus提出植物中存在维生
素C合成的古洛糖途径。GLOase是古洛糖途径中
最后一步关键酶, 催化L-古洛糖酸-1,4-内酯(L-gu-
lono-1,4-lactone, GulL)转变为维生素C。Jain和
Nessler (2000)用大鼠(Rattus norvegicus) gulo基因
研究报告 Original Papers
植物生理学报552
转化烟草(Nicotiana tabacum)和生菜(Lactuca sati-
va), 获得比未转化组高达4倍和7倍的转基因植
株。大鼠(R. norvegicus)的GLOase在拟南芥中异源
表达能恢复拟南芥v t c突变体中维生素C含量
(Radzio等2003); 在马铃薯(Solanum tuberosum)中
异源表达不仅能将维生素C含量提高到转化前的
1.41倍, 还能提高抵抗如NaCl、甘露醇等非生物胁
迫的能力(Hemavathi等2010)。但用小鼠(Mus mus-
culus) GLOase转化拟南芥及获得转基因植株的抗
逆能力至今未见报道。
本研究以小鼠gulo基因转化拟南芥 , 结合
HPLC、Real-Time PCR分析转基因拟南芥的维生
素C含量及gulo基因表达水平, 并通过聚乙二醇
(PEG-6000)模拟干旱胁迫和NaCl盐胁迫处理, 从
拟南芥子叶期、幼苗期的根长、膜脂过氧化损伤
指标丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的变化入
手, 探讨转基因拟南芥的抗逆能力。
材料与方法
1 实验材料
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana) 为Co-
lombia生态型, 转空质粒对照拟南芥为本实验室提
供。大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌EHA105为本实
验室提供。带MYC标签的p2301-myc为本实验室
保存, 用于gulo基因的植物表达载体构建。限制性
内切酶和T4 DNA 连接酶购自NEB公司, PCR DNA
聚合酶、RT-PCR试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购
自宝生物公司(TaKaRa), RNA抽提采用华舜柱离
心式小量总RNA抽提试剂盒。
动物材料为小鼠(Mus musculus)品系C57BL/6,
由本实验室提供。采用华舜柱离心式小量总RNA
抽提试剂盒抽提小鼠肝脏总RNA。参考已经Gen-
bank公布的小鼠L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶(Gene
登录号为20380022)编码区序列, 设计引物Gulo_F
(5 ATACTAGTATGGTCCATGGGTACAAAGGGG
3, 下划线部分为SpeI酶切位点)和Gulo_R (5 TTG-
GATCCGTAGAAAACCTTTTCCA 3, 下划线部分
为BamHI酶切位点)。
2 实验方法
2.1 转基因拟南芥的获得及分子检测
gulo基因编码区序列的RT-PCR克隆采用Ta-
KaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)试剂盒, 体系
按照说明书配制。反应条件: 50 ℃ 30 min, 94 ℃ 2
min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 32个循环;
72 ℃ 7 min。克隆产物连入pMD18-T simple载体
测序。测序正确的质粒经SpeI/BamHI双酶切, 回收
1 323 bp gulo基因片段, 插入经同样双酶切的载体
p2301-myc。
采用EHA105农杆菌介导的浸花法(Zhang等
2006)转化拟南芥, 子代种子经过75%和95%酒精
分别表面消毒5 min后无菌水洗3次, 均匀铺在含
100 mg·L-1卡那霉素的1/2MS固体培养基上。4 ℃
春化3 d, 置于光周期为16 h /8 h、光照强度为75
μmol·m-2·s-1、温度为(24±1) ℃的状态下萌发, 约1
周后移栽至蛭石:草炭:珍珠岩体积比为9:3:1的营
养土中。植物基因组DNA的提取和转基因植株的
PCR鉴定时, 取0.1 g拟南芥叶片, 置于液氮中速冻,
采用CTAB法提取叶片核基因组DNA。取1 μL提
取的基因组DNA做为模板, 用前述gulo基因特异引
物Gulo_F和Gulo_R进行PCR检测。PCR条件为:
94 ℃ 5 min; 94 ℃ 40 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 90 s, 30个
循环; 72 ℃ 10 min。逐代筛选直至获得纯系。
植物叶片蛋白提取采用液氮速冻后加入5%
(W/V) SDS研磨, 沸水浴5 min, 11 000×g离心10 min
后取上清。SDS-PAGE、Western Blot步骤参照
《分子克隆试验指南》(第3版)。碱性磷酸酶标记
的羊抗鼠免疫球蛋白、鼠抗MYC蛋白单克隆抗体
购自Santa Cruz公司。PVDF膜购自Millipore公司,
检测底物的Western Blue Stabilized Substrate for
Alkaline Phosphatase购自Promega公司。
用华舜公司植物总RNA小型抽提试剂盒提取
拟南芥RNA。TaKaRa公司 Prime Script RT Re-
agent Kit试剂盒反转为cDNA。体系参照说明书,
反应程序为37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。采用TaKaRa
公司SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time, Lot:
BKA504) 试剂盒, Bio-Rad公司i-Cycler定量PCR仪
分析不同株系中gulo基因表达水平, 用2-ΔΔCt分析相
对表达量的差别。定量PCR引物分别为Gulo-F (5′
TGGGACTATGCCATTGGGTTCTA 3′)和Gulo-R
(5′ GCAGTTGAACAGCCAGAAG 3′)。以泛素基
因作为内参, 引物分别为Ubiquitin_F (5′ TGCGC-
TGCCAGATAATACACTATT 3′)和Ubiquitin_R (5′
TGCTGCCCAACATCAGGTT 3′)。 以10倍为梯度
稀释模板cDNA, 摸索实时定量 PCR适合的模板浓
李坤岚等: 过量表达GLOase导致转基因拟南芥中维生素C含量和抗逆能力提高 553
度, 并最终以1/10原液浓度的cDNA作为模板, 做3
次平行。体系参照说明书, 反应程序为95 ℃ 30 s,
95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 循环40次。
2.2 胁迫处理
子叶期盐胁迫处理方法如下。将拟南芥种子
播种于含0、50、100、150和200 mmol·L-1 NaCl的
1/2MS培养基中。萌发8 d后每株系每浓度随机挑
选6株拟南芥拍照并用精确到0.5 mm钢尺测量根
部长度, 再过6 d后每株系每浓度随机挑选6株拍照
纪录其侧根发育情况。
幼苗期盐胁迫处理方法如下。将拟南芥移栽
到土壤中并正常灌溉2周后, 用0、50、100、150
和200 mmol·L-1 NaCl 水溶液每4 d浇灌1次, 处理2
周后拍照, 并测定MDA含量。
聚乙二醇(PEG-6000, 北京鼎国)模拟干旱胁
迫方法如下。拟南芥移栽到土壤中4周后, 用30%
的PEG-6000水溶液分别处理0、90和120 min, 测
定MDA含量。
2.3 指标测定
用日立公司Hitachi L-2000高效液相色谱仪测
定维生素C含量, 色谱柱symmetry shield RP18柱(5
μm, 150×4.6 mm)。流动相为甲醇:0.1%草酸=5:95,
检测波长为245 nm, 柱温为30 ℃ , 流速为1.0
mL·min-1, 外标法定量, 保留时间为2.44 min。生长
4周, 取0.01 g新鲜叶片用液氮充分研磨后, 用1 mL
0.1% (W/V)草酸悬浮, 4 ℃保存1 h以上。超声处理
30 min, 破碎细胞。11 000×g离心10 min, 取上清,
过0.2 μm水性滤膜, 3次重复。
MDA含量测定按照硫代巴比妥酸法(李合生
2000; Verma和Dubey 2003), 略有改动。取单位
重量拟南芥叶片, 加入4倍体积0.25%硫代巴比妥
酸(溶于10%三氯乙酸)溶液后充分研磨, 于95 ℃
水浴加热30 min, 冰浴快速冷却, 11 000×g离心10
min, 取上清液测定OD532、OD600和OD450。按照
下列公式计算MDA浓度, 并换算成单位鲜重叶片
的MDA含量: MDA (μmol·L-1)=6.45(OD532–OD600) –
0.56OD450。
结果与讨论
1 gulo基因的克隆
抽提经饥饿处理的小鼠C57肝脏总RNA (图
1-A), 采用Gulo_F和Gulo_R引物对总RNA进行RT-
PCR, 获得1 323 bp gulo基因片段(图1-B)。将gulo
插入p2301-myc构建植物表达载体(图2)。
图2 gulo表达框
Fig.2 Expression box of gulo
图1 gulo基因的分子克隆
Fig.1 Molecular clone of gulo
A: 小鼠肝脏总RNA提取; B: RT-PCR克隆gulo基因; M: DNA
分子量标准, 条带由大到小分别是2 000、1 000、750、500、250
和100 bp。
2 转基因拟南芥PCR和Western Blot鉴定
用农杆菌EHA105介导的浸花法转化拟南芥,
共获得21个独立转化株系。PCR检测21个转基因
株系植株总DNA, 均扩增出与目标片段大小一致
的条带(图3), 表明外源基因gulo成功整合到拟南芥
基因组中。对21个株系拟南芥Western Blot分析表
明, 带MYC标记的GLOase蛋白在11个株系中有不
同丰度的表达(图4)。其中gulo-12和gulo-21获得纯
系, 用于后续分析。
3 gulo基因表达量与维生素C含量分析
过量表达gulo基因拟南芥株系中, 最高为gu-
lo-21, 其维生素C含量达到5.74 µmol·g-1 (FW), 是野
生型(WT)的3.46倍, 空质粒转化对照组(CK)的3.19
倍(图5)。株系gulo-21与gulo-12相比, 维生素C含
量前者为后者的2.27倍, gulo转录水平前者为后者
的18.4倍。
植物生理学报554
4 转基因拟南芥抗逆性分析
4.1 抗盐能力
拟南芥种子分别在含0、50、100、150和200
mmol·L-1 NaCl的1/2MS培养基中萌发8 d后, 转gulo
基因的拟南芥株系平均根长长于WT和对照; 同一
处理浓度下WT与对照根长的差异未达到显著水
平。在50 mmol·L-1 NaCl浓度下, 转gulo基因的拟
南芥株系的平均根长显著高于WT (P<0.05); 维生
素C含量更高的株系gulo-21根长长于gulo-12, 暗示
维生素C含量的提高有助于拟南芥子叶期抗盐能
力的增强。100 mmol·L-1 NaCl浓度下, 维生素C含
量最高的gulo-21相比WT表现出极显著的根长优
势(P<0.01); 而维生素C含量仅为WT 1.52倍的gulo-
12无法有效耐受盐胁迫, 根长与WT差异未达显著
水平。150 mmol·L-1 NaCl浓度下, 4种基因型拟南
芥根长趋于一致, 表明该浓度超出了转基因拟南
芥可调节的范围(图6)。在200 mmol·L-1 NaCl的
1/2MS培养基上, 4种基因型拟南芥均发黄死亡, 表
明200 mmol·L-1 NaCl为拟南芥萌发的致死盐浓度
(图未显示)。在萌发14 d时, 侧根生长形态出现明
显差异。WT、对照拟南芥侧根数量、长度明显
低于gulo-12和gulo-21 (图7)。总之, 提高维生素C
含量能够增强拟南芥子叶期对盐胁迫的耐性。
幼苗期拟南芥在各浓度NaCl浇灌下, 维生素C
含量更高的gulo-21组叶片生长状态优于gulo-12
组, 后者优于WT、对照, 具体表现在相同盐浓度
处理下高维生素C含量组叶片更绿、莲座叶叶面
图3 转基因拟南芥PCR鉴定
Fig.3 PCR identification of transgenic Arabidopsis plant
PCR 检测转基因拟南芥T1代植株gulo基因转入情况。M:
DNA分子量标准, 为Takara公司DL2000。WT: 野生型; C+: 质粒
p2301-gulo ; 1~21: 1~21株系。
图4 Western Blot检测GLOase表达情况
Fig.4 Western Blot of GLOase
转基因拟南芥T1代1~21号植株Western Blot检测GLOase蛋白
表达情况。M: 蛋白分子量标准, 为NEB Prestain Marker, 条带由大
到小分别为175、80、58、46 kDa。2、3、9~13、15、16、20、
21为阳性; WT为野生型, CK为转p2301空载体对照。
图5 拟南芥维生素C含量及gulo相对转录水平
Fig.5 Vitamin C level and relative gulo
transcript level of Arabidopsis
图6 盐胁迫下拟南芥根长
Fig.6 Root length of Arabidopsis under salt stress
*和**分别代表同浓度NaCl处理后各株系根长在P<0.05和
P<0.01水平有显著差异。
李坤岚等: 过量表达GLOase导致转基因拟南芥中维生素C含量和抗逆能力提高 555
图7 盐胁迫下拟南芥侧根形态
Fig.7 Lateral roots of Arabidopsis under salt stress
图8 盐胁迫下拟南芥叶片形态
Fig.8 Leaves of Arabidopsis under salt stress
积更大、枯黄坏死现象更少(图8), MDA含量更低
(图9), 表明提高维生素C含量有助于增强拟南芥子
叶期对盐胁迫的耐性。
4.2 抗干旱能力
30% PEG-6000模拟的干旱条件下, 随着时间
的推移, WT、对照拟南芥叶片中MDA含量增加量
大于转基因组拟南芥gulo-12和gulo-21。其中, 高
维生素C含量组gulo-21在各取样时间的MDA含量
均为最低(图10)。由此可见, 维生素C水平的提高
有助于增强拟南芥的耐旱性。
本实验初步探讨了过量表达GLOase对拟南
芥维生素C含量的影响及其对增强拟南芥抗逆能
图9 拟南芥幼苗期盐胁迫下MDA含量
Fig.9 MDA level of Arabidopsis under salt stress
力的作用。我们的研究结果表明, 过量表达GLOa-
se的拟南芥维生素C含量最高为野生型的3.46倍、
转化空载体对照的3.19倍。NaCl模拟盐胁迫实验
图10 30% PEG-6000处理下拟南芥MDA含量
Fig.10 MDA level of Arabidopsis under 30% PEG-6000
植物生理学报556
中, 子叶期的转基因拟南芥相比于对照平均根长
更长, 侧根发育更充分; 幼苗期的转基因拟南芥莲
座叶显著优于对照, 并且叶片所含MDA含量更低,
暗示了转基因拟南芥的耐盐性有所提高。用30%
PEG-6000模拟干旱胁迫, 不同时间梯度下转基因
拟南芥MDA含量低于同样处理下野生型拟南芥。
这表明着转基因拟南芥随着维生素C含量提高抗
干旱能力得到增强。在上述两组环境胁迫实验中,
通过比较过量表达GLOase的不同转基因株系gulo-
12和gulo-21可以发现, 随着维生素C含量的提高拟
南芥抗胁迫的能力进一步得到了改善。因此, 过
量表达GLOase对提高拟南芥的维生素C含量和抗
胁迫能力有一定的参考价值。
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