全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 513
一种提取橡胶树叶中总DNA 的方法
安泽伟 黄华孙＊
中国热带农业科学院橡胶研究所，国家橡胶树育种中心，农业部热带作物生理学重点实验室，海南儋州 571737
A Method for Genomic DNA Extraction from Leaves of Rubber Tree (Hevea
brasiliensis Muell. Arg.)
AN Ze-Wei, HUANG Hua-Sun*
State Center for Rubber Breeding, Key Laboratory of Tropical Crops Physiology of Ministry of Agriculture, Rubber Research
Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China
提要 橡胶树叶中富含多糖和多酚类物质，严重影响高质量基因组 DNA 的提取，文章针对这一特点提出了改良的 CTAB
法。这一方法可用于 DNA 的大量或小量提取，小量提取的产量为 50 mg·g-1(FW)，大量提取可达到 400 mg·g-1(FW) ；可从
橡胶树古铜期、变色期、稳定期等 3 个生长时期的叶中提取出高质量 DNA，所得 DNA 可用于 PCR 分析和酶切分析等分
子生物学研究。
关键词 基因组 DNA；CTAB；橡胶树
收稿 2004-12-07 修定 　 2005-03-20
资助　 科技基础性工作研究专项( 2 0 0 3 D E B 6 J 0 7 5 、
2 0 0 3 D I B 7 J 0 6 6 ) 。
*通讯作者(E-mail: huanghs@scuta.edu.cn, Tel: 0898-23300573)。
橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)原产于
亚马逊河流域，是目前唯一有商业利用价值的天
然橡胶来源。橡胶树体内不仅富含胶乳，而且有
大量的多酚及多糖类次生物质。在提取 DNA 时，
多糖很难与 DNA 分离[1]，而酚类物质在研磨时易
氧化，并与蛋白质和核酸发生不可逆的结合，形
成胶状物[2]，这种含有 D N A 的胶状物对其进行
PCR 或酶切分析不利。虽然提取橡胶树中 DNA 有
多种方法[3~7]，但这些方法均需用氯化铯超速离
心，而且产物经常呈褐色的胶状物。要提取高质
量的 DNA，就得克服多酚及多糖类物质的干扰。
根据Vrohbi等[8]和Chaudhry等[9]的方法，本文探
索出一种适合于提取橡胶树中高质量 D N A 的方
法。此法费用低，效率高。
材料与方法
1 植物材料
分别取1 g橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.
Arg.)古铜期、变色期和稳定期3个不同生长时期
的幼叶，置于 15 mL 离心管中提取。如要小量提
取时则可用0.2 g幼叶于1.5 mL离心管中进行。
2 溶液
提取液配制根据Chaudhry等[9]的方法进行改
良，包括0.45 mol·L-1 葡萄糖、0.1 mol·L-1 Tris-
HCl (pH 8.0)、5 mmol·L-1 EDTA (pH 8.0)、2%
(W/V) 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-36、2%(V/V)巯基乙
醇。裂解液的配制根据Vrohbi等[8]的方法改良而
来，包括 2%(W/V) CTAB、2%(W/V) PVP-36、
1.4 mol·L-1 NaCl、20 mmol·L-1 EDTA (pH 8.0)、
0.1 mol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)、2%(V/V) 巯基乙
醇。TE 缓冲液为: 10 mmol·L-1 Tris-HCl、1
mmol·L-1 EDTA (pH 8.0)。酚∶氯仿∶异戊醇
为 2 5 ∶2 4 ∶1 ，氯仿∶异戊醇为 2 4 ∶1 ，乙
醇为 70%、100%，醋酸钠(pH 5.2)为 3 mol·L-1，
异丙醇为 10 0 %。
3 操作流程
(1)取1 g叶片，放在液氮中快速研成粉末后
转入15 mL 的离心管中。(2)在盛有样品的离心管
中加入 5 mL 冰冷的提取缓冲液，混匀，冰上放
置 20 min。样品与缓冲液的比例以 1∶5~1∶7
为宜，缓冲液太少，DNA 产量会下降。(3)以4 020×
g，于 4℃下离心 20 min。(4)弃去上清液，沉淀
中加入 65℃预热的 5 mL 裂解液，混匀后于 65℃
水浴中保温40 min。弃去的上清液中含有大量来
自细胞质的多糖、多酚及色素类物质，低速离心
可将这些杂质与未释放出的 DNA 分离。沉淀中加
植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月514
入预热的裂解液使核内的 DNA 释放出来，同时可
钝化内源核酸酶的活性，以使释放出的 DNA 受到
保护。(5)加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶
1)，翻转混匀约 80 次，直至有机相溶液浑浊为
止。这样，可有效去除蛋白质。(6)以11 180×g，于
室温下离心 20 min。CTAB 溶液在低于 15℃时会
产生沉淀，所以不能在低温下离心。(7)上清液转
至另一新管中，加入 0.6 体积的冰冷的异丙醇，
翻转混匀 40 次后于室温下静置 10 min。(8)以
11 180×g，于室温下离心 10 min，以 70% 乙醇
洗沉淀 2 次，以除去沉淀中的小分子物质。(9)沉
淀风干后，加入500 mL TE， 溶于Eppendorf 管
中。(10)加入 2 mL RNase A，于 37℃下保温 30
min。(11)加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，翻转
混匀约80次，于4℃以11 180×g离心10 min。(12)
转移上清液，加入 0.1 体积的 3 mol·L-1 醋酸钠，
混匀后加入 2 倍体积的无水乙醇，翻转混匀 4 0
次，于 -20℃中静置 30 min，以使 DNA 得到充
分沉淀。(13)以 11 180×g于 4℃下离心5 min，用
70% 乙醇洗沉淀 2 次，以除去沉淀中的小分子物
质。(14)风干后，将沉淀溶于100 mL TE 中，于
-20℃下保存。
4 DNA 质量检测
用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测
D N A 质量。
5 限制性酶切和简单序列重复间区(inter-simple
sequence repeats，ISSR)分析
酶切反应参照 Ausubel 等[10]的方法。ISSR-
PCR 反应在 Biometra T1 PCR 仪上进行。引物为
836(GAGAGAGAGAGAGAGYA)。反应体积为 10
mL，其中包括 1 mL 10× 缓冲液、2 mmol ·L-1
MgCl2、0.1 mmol·L-1 dNTPs、0.4 mmol·L-1 引物、
0.5 U Taq 酶、DNA 30 ng、ddH2O 6.64 mL。反
应程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性 30 s,
50℃退火 30 s, 72℃延伸70 s，共循环45次; 72℃
下延伸 7 min。将扩增产物在 2% 琼脂糖凝胶(含
0.5 mg·mL-1的溴化乙锭)， 80 V稳压条件下进行电
泳，紫外灯下观察结果并照相。
结果与讨论
针对橡胶树富含次生物质这一特点，我们对
提取方法的改进主要是从抑制次生物质影响 DNA
提取进行的。以往提取橡胶树总 DNA 的方法[3~7]
是用裂解液直接处理样品，或是用氯化铯来进行
超速离心，改良的 CTAB 法与这些方法的不同之
处在于：(1)在细胞核裂解前用提取缓冲液对样品
进行预处理，使细胞质中的大部分多糖和多酚类
物质溶解在提取缓冲液中，通过低速离心使之与
含有总DNA的样品分离；(2)提取缓冲液中用葡萄
糖作稳定剂，以保持渗透性[11] ；(3)用高浓度PVP-
36结合多酚类物质；(4)用高浓度巯基乙醇作抗氧
化剂；(5)裂解液中提供高浓度的氯化钠环境，使
CTA B 与 DN A 的复合物能充分溶解。
我们用这一方法已提取了近 500 个橡胶树样
品的 DNA，均获得满意的结果，OD 260/ OD 280 在
1.8~2.0，OD260/OD230 在 2.0~2.7，大量提取 DNA
的产量最高可达400 mg·g-1(FW)，小量提取的DNA
产量在 50 mg·g-1(FW)左右。橡胶树不同生长时期
的 D N A 产量差异较大：稳定期的产量最低，为
50 mg·g-1(FW) ；变色期的最高，为400 mg·g-1(FW) ；
古铜期的居中。DNA 得率随生长时期不同而有所
差异，这可能与不同时期的橡胶树叶片的解剖结
构和化学成分有关。稳定期的叶片已完全成熟，
角质层较厚，叶脉明显，纤维增多增粗，很难
研磨，多糖和多酚类物质也较多；古铜期的叶片
尚未成熟，易于研磨，但叶片水分含量较大；变
色期的叶片虽接近成熟，但其叶片质地柔软，易
于研磨，多糖和多酚类物质并没有明显增多。本
统计结果来自大量提取和小量提取，40 0 和 5 0
mg·g-1(FW)分别是大量提取和小量提取的统计数
据。由于样品在直径为 6 cm 的陶瓷研钵中研磨，
样品容易粘在研钵壁上，很难转移干净，使有效
样品的量降低，而小量提取中样品量远小于大量
提取，同样的样品损失量对小量提取的影响就要
大过大量提取，故此统计结果会相差 8 倍。
为了保证每次实验都有高质、高产的 DNA，
操作中应注意以下问题：(1)研磨要充分，尽可能
选取变色期的材料；(2)研磨后的样品转移要快且
干净，以减少样品人为损失及避免 D N A 降解；
(3)样品与缓冲液的比例以 1∶5~1∶7 为好，缓
冲液太少 DNA 产量会下降，太多则不易操作，造
成试剂浪费；(4)65℃水浴中保温时以 40 min 为
植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 515
宜，其间要翻转混匀 8~10 次；(5)抽提时要尽可
能多地转移上清液，但要避免吸取中间相；(6)加
入裂解液后的所有操作都要温和，以防止 DNA 降
解。
采用本方法从不同生长时期橡胶树叶中提取
的 DNA 均为白色沉淀。图 1-a 为从橡胶树品种
RRIM600 不同生长时期叶片中所提的总 DNA，3
个泳道 DNA均无降解，质量较高(表 1)。以此DNA
为模本进行的酶切和ISSR 反应表明，所提的DNA
很容易酶解，且能产生清晰的 PCR 扩增带(图 1-
b 、c ) 。实验证明，采用这一方法提取橡胶树
DN A 是切实可行的，所得 DN A 没有蛋白质、酚
类及小分子的污染，适合于分子生物学研究。
参考文献
1 Murray MG, Thompson WF. Rapid isolation of high mo-
lecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res, 1980, 8:
4321~4325
2 Porebski SL, Baily G, Baum RB. Modification of CTAB DNA
extraction protocol for plants containing high polysaccha-
ride and polyphenol components. Plant Mol Biol Rep, 1997,
12: 8~15
3 Bease P, Lebrun P, Seguim M et al. DNA fingerprint in
Hevea brasiliensis (rubber tree) using human minisatellite
probes. Heredity, 1993, 70: 237~244
4 Bease P, Seguim M, Lebrun P et al. Genetic diversity among
wild and cultivated population of Hevea brasiliensis assessed
by nuclear RFLP analysis. Theor Appl Genet, 1994, 88:
199~207
5 Lespinasse D, Rodier-Goud M, Grivet L et al. A saturated
genetic linkage map of rubber tree (Hevea spp.) based on
RFLP, AFLP, microsatellite and isozyme markers. Theor
Appl Genet, 2000,100: 127~138
表 1 RRIM 600总 DNA的质量分析
取样时期 OD260/OD280 OD260/OD230 产量/mg·g-1(FW) 沉淀颜色
古铜期 2.0 2.0 217 白色
变色期 1.9 2.1 390 白色
稳定期 2.0 2.6 196 白色
6 Lekawipat N, Teerawatanasuk K, Rodier-Goud M et al. Ge-
netic diversity analysis of wild germplasm and cultivated
clones of Hevea brasiliensis Muell. Arg. by using microsatellite
markers. J Rubb Res, 2003, 6(1): 36~47
7 Low FC, Gale MD. Development of molecular markers for
Hevea. J Nat Rubb Res, 1991, 6(3): 152~157
8 Vrohbi I, Harvengt L, Chandelier A et al. Improved RAPD
amplification of recalcitrant plant DNA by the use of acti-
vated charcoal during DNA extraction. Plant Breed, 1996,
115: 205~206
9 Chaudhry B, Yasmeen A, Husnain T et al. Mini-scale ge-
nomic DNA extraction from cotton. Plant Mol Biol Rep,
1999, 17: 1~7
10 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE et al (eds). Short Proto-
cols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons
Inc, 1995. 73~76
11 Katterman FR, Shattuck VI. An effective method of DNA
isolation from the mature leaves of Gossypium species that
contain large amounts of phenolic terpenoids and tannins.
Prep Biochem, 1983, 13(4): 347~359
图 1 RRIM 600 的总 DNA 分析
　　a: 从不同时期 RRIM 600 叶片提取的总 DNA；b: Taq1 消
化后的 RRIM 600 总 DNA；c: ISSR 引物 836 的扩增图谱。M:
DNA 分子量标准(Lambda DNA/HindIII+EcoRI) ；1: 古铜期叶
片；2: 变色期叶片；3: 稳定期叶片。