全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月 265
银杏叶中叶绿素衍生物的反相高效液相色谱分析
唐蕾* 陈蕴 王武
江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214036
Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography Analysis of Chlo-
rophyll Derivatives in Ginkgo (Ginkgo biloba L.) Leaves
TANG Lei*, CHEN Yun, WANG Wu
Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Southern Yangtze University, Wuxi, Jiangsu 214036, China
提要 以检测植物色素降解过程中叶绿素衍生物的变化为主要目的，采用反相高效液相色谱，结合光电二极管阵列和荧
光检测技术，分析了银杏叶中叶绿素衍生物的组成和含量变化，发现在衰老的银杏叶中主要存在叶绿素a、叶绿素b和脱
镁叶绿素 a，而其他降解产物并未大量累积。
关键词 反相高效液相色谱；银杏；叶绿素
收稿 2005-05-08 修定　 2005-12-16
*E-mail: ltang@sytu.edu.cn, Tel: 0510-5867519
植物叶绿素降解现象普遍存在。既表现在植
物细胞的正常生理过程，如果实成熟、植物衰老
和树木落叶时的绿色消失；还表现为植物为抵抗
外界胁迫因素，如低温、虫害袭击可能造成的卟
啉光毒性而降解叶绿素(Brown 等 1991)。根据降
解过程中叶绿素结构的变化，Takamiya等(2000)
认为降解过程分两个阶段：(1)卟啉环的修饰，包
括植醇基团的水解和其他侧链的修饰，Mg2+ 的去
鳌合，在这一过程中叶绿素的卟啉环仍然保持完
整，产物以绿色为主；(2)卟啉环的氧化开环，产
生无色的荧光和非荧光产物。对叶绿素降解产
物，特别是第一阶段产物的定性、定量分析，将
有助于了解叶绿素降解过程，从而为控制植物的
色泽变化提供可能的依据。但这些产物往往有相
似的吸收波谱，用常规的比色分析方法难以加以
准确的定性、定量区分。目前，高效液相色谱
(HPLC)已在色素分析中得到广泛使用(赵世杰等
1995)，但在叶绿素衍生物的分析中尚存在2个难
点：(1)叶绿素降解产物的极性差异较大，从而造
成洗脱程序复杂、操作不便；(2)作为卟啉类化合
物一种的叶绿素通常在 410~450 nm Soret 带和
650~670 nm Q 带处有最大吸收，因而常选为
HPLC的检测波长。但是使用Soret 带作为检测波
长难以区分与叶绿素共存的类胡萝卜素，Q 带虽
为卟啉类化合物的特征吸收，但灵敏度较低，对
于微量的叶绿素衍生物难以定量分析。本文采用
反相高效液相色谱仪以及光电二极管阵列和荧光检
测手段，定性和定量的精度可以提高。分析秋季
银杏(Ginkgo biloba L.)叶中叶绿素衍生物组成和含
量的结果表明，在衰老的银杏叶中主要存在叶绿
素a、叶绿素b和脱镁叶绿素a，而其他降解产物
并未大量累积。
材料与方法
1 标准色素
叶绿素a和叶绿素b的制备：参照Iriyama等
(1974)的二氧六环蒸馏水沉淀法从菠菜(Spinacia
oleracea L.)叶中获得叶绿素a和叶绿素b的混合
物，再以 DEAE-Sepharose CL-6B 柱层析分离
(Omata和Murata 1983)得到叶绿素a和叶绿素b。
经吸收光谱和质谱分析确证为叶绿素a和叶绿素 b。
脱镁叶绿素a：叶绿素a经酸化处理得到脱镁叶绿
素a。脱镁叶绿酸a：通过叶绿素酶水解叶绿素a
得到脱植醇叶绿酸 a，酸化脱植醇叶绿酸 a 得到
脱镁叶绿酸 a。
2 高效液相色谱仪和色谱条件
高效液相色谱仪选用了 2 种 HPLC 系统：(1)
日立 HPLC 系统，岛津 RF-550 荧光检测器；(2)
岛津 HPLC 系统，SPD-M10Avp 检测器。色谱柱：
Intersil ODS 柱(250 mm×4.6 mm，5 mm GL
S c i e n c e，日本东京)。流动相：100 % 甲醇，
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0~15 min；甲醇∶乙酸乙酯(50∶50，V/V) 15~25
min。荧光检测波长：激发波长(lex)为 430 nm；
发射波长(lem)为 667 nm。柱温：40℃；流速：
0.8 mL·min-1。
3 材料处理
将采集的新鲜银杏(Ginkgo biloba L.)叶于冷
丙酮(4℃)中均浆后过滤，滤物用冷丙酮漂洗抽滤
至滤液无色，合并滤液，以 0.45 mm 滤膜过滤，
取 10 mL 进样。
结果与讨论
1 反相 HPLC 法分离叶绿素衍生物
叶绿素降解过程以叶绿素 a 的结构变化为
主，叶绿素 b 则通过水解和还原反应转化为脱植
醇叶绿酸a进入降解途径(Scheumann 1996)。由
于结构的改变，所以叶绿素衍生物的极性差异较
大。脱植醇叶绿酸由于脱去植醇基成为酸性色
素，因而极性最强，而脱镁叶绿素以氢离子代替
了卟啉环中鳌合的镁离子，极性减弱。本文采用
反相 HPLC 法，以甲醇和甲醇 / 乙酸乙酯阶段洗
脱，因而极性差异较大的叶绿素衍生物标准品在
30 min之内得以分离(图1)。
2 银杏叶绿素降解物的光电二极管阵列检测和荧
光检测比较
光电二极管阵列检测可以通过监测色谱峰的
吸收光谱对相关物质进行定性，是一种强有效的
色谱分析工具(胡晗华2003)。卟啉类化合物通常
在410~450 nm (Soret带) 和650~670 nm (Q带)处
有最大吸收，常用为 HPLC 的检测波长。本文同
时采用4种检测波长：432 和 660 nm 对应于叶绿
素a类衍生物；445 和 654 nm 对应于叶绿素b类
衍生物(图2-a)。结合在线可见-紫外光谱和极性
出峰顺序判断峰 1 为叶绿素 b，峰 2 为叶绿素 a。
此法可以有效排除卟啉以外其它物质的干扰，并
图2 银杏叶提取物色素的HPLC
a：光电二极管阵列检测；b：衰老叶片的荧光检测; c：成熟叶片的荧光检测。1：叶绿素 b；2：叶绿素 a；3：脱镁叶绿素a。
图1 叶绿素衍生物标准品的HPLC
　　1 ：脱镁叶绿酸 a ；2 ：叶绿素 b ；3 ：叶绿素 a ；4 ：
脱镁叶绿素 a。荧光检测波长为: lex=430 nm，lem=667 nm。
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有可能发现标准品以外的其他叶绿素降解产物，
在色素成分定性分析中有优势。但对于痕量物质
来说，由于可见 - 紫外光谱检测灵敏度偏低，常
常无法检出。荧光检测作为UV-VIS检测方法的补
充，在很多情况下可以获得较高的灵敏度和专一
性，因而已成为分析叶绿素及其衍生色素的有效
检测方法。银杏叶提取物的荧光检测结果(图 2-
b、c)，与标准品的保留时间(图 1)比较，可以
得出结论：秋季银杏叶中主要存在叶绿素 a、叶
绿素 b 以及脱镁叶绿素 a。一般认为，叶绿素的
降解主要经过以下的反应：叶绿素在叶绿素酶的
作用下脱植醇生成脱植醇叶绿酸，脱植醇叶绿酸
在去镁螯合酶的作用下生成脱镁叶绿酸，脱镁叶
绿酸在单加氧酶和还原酶的作用下生成无色的荧光
产物(Kräutler和Matile 1999)。本文结果表明：无
论采用可见-紫外光谱检测以及荧光检测均未发现
在秋季衰老叶片中存在极性强于叶绿素b 的产物累
积，这是否由于脱植醇叶绿酸之后的反应较为迅
速，以致后续降解物未能得到积累，还是存在其
它降解途径，尚待进一步研究。
3 叶绿素衍生物的荧光定量分析
由于叶绿素降解过程中，其衍生物的含量一
般较低，所以选择低浓度标准物进样，荧光检测
的结果表明，叶绿素 a、叶绿素 b、脱镁叶绿酸
a、脱镁叶绿素 a 在0.05~1.0 nmol范围内线性关
系良好，相关系数分别为0.999、0.999、0.996、
0.986。以此方法测定10~11月银杏叶的叶绿素含
量变化时发现，叶绿素 a 下降 84.8%，叶绿素 b
含量下降60.8% (图 3)。
综上所述，光电二极管阵列检测和荧光检测
在分析叶绿素降解中各具优势，前者有利于叶绿
素降解产物的定性分析，而后者灵敏度高，适用
于微量成分的检测和定量分析。应用这一方法分
析秋季银杏叶的结果表明降解产物主要为叶绿素
a、叶绿素b 和脱镁叶绿素a，其具体的降解途径
尚待进一步分析。
参考文献
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图3 银杏叶中叶绿素含量