全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（３）： ４２７ － ４３３ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０３􀆰 ０１１
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１８１６，３１１７１８１５），国家公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３０２８）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｄｙｚｈａｎｇ７８＠ ｇｍａｉｌ． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１５ － ０９ － ０５
我国部分地区常见农作物上黄瓜花叶病毒
分离物核酸多样性分析
陈玉珍１，２ 　 谭新球２ 　 朱春晖２ 　 孙书娥２ 　 刘　 勇１，２ 　 张德咏１，２∗
（１．湖南农业大学植物保护学院， 长沙 ４１０１２８；
２．湖南省农业科学院植物保护研究所， 园艺作物害虫治理湖南省重点实验， 长沙 ４１０１２５）
摘要： 为明确我国黄瓜花叶病毒株系分化及系统进化基本情况，从湖南、新疆、青海和海南 ４ 省区
采集１ ３６７个样品对其进行酶联免疫和 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测，并对分离获得的 １５ 个黄瓜花叶病毒
（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）纯化分离物 ＣＰ、ＭＰ、２ｂ 核苷酸序列进行相似性和进化树分析及生物
学性状比较。 结果表明，辣椒、龙葵和黄瓜的 ＣＭＶ 阳性检出率较高，分别为 ５４􀆰 １３％ 、２９􀆰 １９％和
１８􀆰 ４６％ 。 进化树分析显示 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 与 ＣＭＶ亚组 ＩＩ的亲缘性较高；ＣＭＶ⁃Ｎ７ 为新发现的重组株系，
其 ＣＰ、２ｂ基因属于 ＣＭＶ亚组 ＩＢ，ＭＰ基因却属于 ＣＭＶ亚组 ＩＩ；其余 １３ 个分离物均属于 ＣＭＶ亚组
ＩＢ。 ＣＭＶ⁃Ｎ７ 和 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 在系统寄主心叶烟和枯斑寄主苋色藜上引发的症状相似，但比对照株系
ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３（ ＩＢ）的发病时间要晚 １ ～ ２ ｄ，系统花叶较温和，枯斑较小。 表明在以上 ４ 省区常见农作
物上广泛流行的 ＣＭＶ存在分子变异。
关键词： 黄瓜花叶病毒； 检测； 进化； 核酸多样性
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ
ｃｏｍｍｏｎ ｃｒｏｐｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ
Ｃｈｅｎ Ｙｕｚｈｅｎ１，２ 　 Ｔａｎ Ｘｉｎｑｉｕ２ 　 Ｚｈｕ Ｃｈｕｎｈｕｉ２ 　 Ｓｕｎ Ｓｈｕ’ｅ２ 　 Ｌｉｕ Ｙｏｎｇ１，２ 　 Ｚｈａｎｇ Ｄｅｙｏｎｇ１，２∗
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８， Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｓｔｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｎ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｒｏｐｓ ｉｎ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ；
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｈｕｎａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２５， Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ ＣＭＶ） ｉｎ Ｃｈｉｎａ， １ ３６７ ｓａｍｐｌｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｎａｎ， Ｘｉｎｊｉａｎｇ，
Ｑｉｎｇｈａｉ ａｎｄ Ｈａｉｎａｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ⁃ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ） ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ⁃ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＲＴ⁃ＰＣＲ） ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＣＭＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅｓ ｏｆ ｃｈｉｌｉ， Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ ａｎｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ５４􀆰 １３％ ， ２９􀆰 １９％ ａｎｄ １８􀆰 ４６％ ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｍｏｒｅｏｖｅｒ， １５ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ＣＭＶ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ２ｂ， ＣＰ ａｎｄ ＭＰ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＣＭＶ⁃Ｑ５ ｗａｓ
ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓ ＣＭＶ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ＩＩ； ＣＭＶ⁃Ｎ７ ｗａｓ ａ ｎｅｗ ｎａｔｕｒａｌ ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＭＶ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ， ｗｉｔｈ ｉｔｓ
ＣＰ ａｎｄ ２ｂ ｂｅｉｎｇ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＣＭＶ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ＩＢ， ｗｈｉｌｅ ＭＰ ｗａｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＣＭＶ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ＩＩ． Ｏｔｈｅｒ
１３ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓ ＣＭＶ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ＩＢ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３（ＩＢ） ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｒａｉｎ， ＣＭＶ⁃
Ｎ７ ａｎｄ ＣＭＶ⁃Ｑ５ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｓ ｔｈｅｉｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｗｅｒｅ
ｍｉｌｄｅｒ ａｎｄ ａｐｐｅａｒｅｄ ｔｗｏ ｄａｙｓ ｌａｔｅｒ ｏｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ ａｎｄ Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＣＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｃｏｍｍｏｎ ｃｒｏｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｒｅｇｉｏｎｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｓｏｍｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｖａｒｉａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ； ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
　 　 黄瓜花叶病毒（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）隶
属雀麦花叶病毒科 Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ 黄瓜花叶病毒属
Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ，是一种典型的三分体单链正义 ＲＮＡ 病
毒，３ 条基因组分别为 ＲＮＡ１、ＲＮＡ２ 和 ＲＮＡ３，具有
高度变异性和强适应性等特点（程朝玲等，２０１３）。
ＲＮＡ１ 编码 １ａ蛋白，ＲＮＡ２ 编码 ２ａ蛋白，１ａ和 ２ａ 蛋
白参与病毒的复制（Ｈａｙｅｓ ＆ Ｂｕｃｋ，１９９０）；２ｂ 蛋白
由亚基因组 ＲＮＡ４Ａ 编码（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ． ，１９９４），借助
ＲＮＡ２ 完成长距离移动（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ． ，１９９５ａ），是一个
多功能蛋白； ＲＮＡ３ 编码 ３ａ 移动蛋白 （ ｍｏｖｅｍｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＰ）和外壳蛋白（ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＰ） （Ｂｒｉｇｎｅｔｉ
ｅｔ ａｌ． ，１９９８），ＭＰ 决定病毒的移动 （ Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ． ，
１９９５ｂ；Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ，２００１），ＣＰ 决定病毒粒子的移动及
病毒的蚜传活性（Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． ，１９９４；Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ． ，
１９９７）。 根据 ＣＭＶ 的寄主范围、致病性、血清性分
析、ＣＰ核酸序列分析等将 ＣＭＶ 株系或分离物大致
分为 ＣＭＶ亚组 Ｉ和 ＣＭＶ亚组 ＩＩ，其中亚组 Ｉ进一步
分为 ＣＭＶ亚组 ＩＡ和 ＣＭＶ亚组 ＩＢ（Ｗａｈｙｕｎｉ ｅｔ ａｌ． ，
１９９２；Ｈｉｄｅａｋｉ ｅｔ ａｌ． ，２００１），表明 ＣＭＶ 存在丰富的
遗传多样性。 截至目前，全世界已有 １００ 多个 ＣＭＶ
的株系（如 Ｆｎｙ、ＳＤ、ＬＹ、Ｑ）或分离物被报道，Ｍａｏｋａ
ｅｔ ａｌ． （２０１０）发现重组发生在 ＣＭＶ 亚组 Ｉ 和 ＣＭＶ
亚组 ＩＩ之间。
ＣＭＶ引起的花叶病是危害我国农作物的重要
病害，近 １０ 年来 ＣＭＶ 在一些国家和地区的作物上
可造成严重危害，如植物生长缓慢，矮小、结果率低、
甚至引起绝收等。 ２００５—２００７ 年，广东省烟草上的
ＣＭＶ检出率达 ４４􀆰 ４％ ，严重影响了烟草的产量和质
量（宋婷婷等，２００７）。 大量的研究工作着力于对
ＣＭＶ的防控，但收效甚微，究其原因，有以下几点：
首先，ＣＭＶ可通过汁液摩擦和蚜虫介体等多种传播
途径进行传播，且传毒蚜虫种类极多 （ Ｇａｌｌｉｔｅｌｌ，
２０００）。 其次，我国地大物博、人口密集、气候条件
差异大、经济发展迅速、交通便利，促进多种农作物
大量种植和交叉运输，利于蚜虫的增长和迁移，为
ＣＭＶ的流行和传播提供了基础（程朝玲等，２０１３）。
最后，ＣＭＶ本身有极强的进化和适应能力（Ｇａｌｌｉｔｅｌ⁃
ｌｉ，２０００），不同株系的 ＣＭＶ 的核酸序列差异较大，
使得在抗 ＣＭＶ育种方面难度加大。
目前，我国湖南、新疆、青海、和海南 ４ 省区
ＣＭＶ的株系分化研究尚未有系统报道，本研究以
田间采集疑似病毒样品为研究对象，通过 Ｄｏｔ⁃
ＥＬＩＳＡ、ＲＴ⁃ＰＣＲ及生物学手段检测其 ＣＭＶ 的侵染
率，并结合 ＣＰ、ＭＰ 及 ２ｂ 基因核酸序列分析 ＣＭＶ
亚组，以期为研究 ＣＭＶ 的株系鉴定及进化机制提
供参考。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试样品：自湖南、新疆、青海和海南 ４ 省区共
采集了 ２７１ 个辣椒、２４３ 个南瓜、２３１ 个西葫芦、１４７
个黄瓜、９６ 个丝瓜、９２ 个番茄、８８ 个香瓜、７１ 个苦
瓜、６８ 个龙葵和 ６０ 个茄子共１ ３６７个样品。 心叶烟
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、苋色藜 Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ Ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌ⁃
ｏｒ均由湖南省植物保护研究所分子生物学实验室
保存。
培养基：ＬＢ（ Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ）培养基：氯化钠 １０
ｇ、酵母提取物 ５ ｇ、胰蛋白胨 １０ ｇ。
试剂：Ｔａｑ 酶、ＰＣＲ 纯化回收试剂盒、Ｔｒａｎｓ２Ｋ
ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、 Ｔｒａｎｓ５Ｋ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、 ｐＥＡＳＹ⁃Ｔ１ Ｃｌｏ⁃
ｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ、反转录试剂盒、氨苄、青霉素购自 Ｔｒａｎｓ⁃
Ｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（北京）公司；ＣＭＶ抗血清由浙江大学谢
燕老师提供；磷酸盐缓冲液（ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｒｒｅｒ ｓｏｌｕ⁃
ｔｉｏｎ，ＰＢＳ）：１􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、２􀆰 ７ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＣｌ、
８􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ、１３７ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ；磷
酸吐温缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｗｅｅｎ － ２０，
ＰＢＳＴ）：０􀆰 ０５％ Ｔｗｅｅｎ － ２０、０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＰＢＳ；５％脱
脂奶粉：脱脂奶粉 ５ ｇ、ＰＢＳＴ １００ ｍＬ；显色底物（底
物显色液要现配现用）：四唑硝基蓝（ ｔｅｔｒａｎｉｔｒｏｂｌｕｅ
ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＮＢＴ）、５⁃溴⁃４⁃氯⁃３⁃吲哚基⁃磷酸
盐（５⁃ｂｒｏｍｏ⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ＢＣＩＰ）；底
物缓冲液： ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ、 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ、
０􀆰 ０２５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ９􀆰 ５；其它化学试剂均为国产
分析试剂；ＰＣＲ引物由北京六合华大基因科技股份
有限公司合成。
仪器：台式离心机 ５４１５Ｃ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 艾本德中
国有限公司；ＤＹＣＰ⁃３８Ｃ 卧式水平电泳仪，北京六
一仪器厂；Ａｌｐｈａ 凝胶成像系统，美国 Ａｌｐｈａ 公司；
Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ⁃ｓ１０００ 双槽 ＰＣＲ仪，美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司；硝
酸纤维素膜（ＮＣ 膜），上海 Ａｍｅｒｓｈａｍ公司。
８２４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 酶联免疫检测
取新鲜 ＣＭＶ 样品按重量体积比 １ ∶ １０ ～ １ ∶ ５０
加入 ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＰＢＳ 研磨；室温下８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心
３ ｍｉｎ；取 ２ μＬ上清液点到 ＮＣ膜，ＮＣ膜上滴加检测
样品的一面为正面，整个试验过程中应朝上。 室温
干燥 １０ ｍｉｎ；将 ＮＣ膜浸入到含 ５％脱脂奶粉溶液室
温封闭 ３０ ｍｉｎ；转入经 ５％的脱脂奶粉 １ ∶ ８ ０００倍
稀释的单抗中 ３７℃孵育 １ ｈ（抗体在使用前 １０ ｍｉｎ
之内稀释）；ＰＢＳＴ洗膜 ３ ～ ４ 次，每次 ３ ｍｉｎ；接着放
入 １ ∶ ８ ０００倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗鼠 ＩｇＧ 二
抗 ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ 中室温孵育 １ ｈ；ＰＢＳＴ 洗膜 ４ ～ ５
次，每次 ５ ｍｉｎ；最后再用 ＰＢＳ 洗 ５ ｍｉｎ；显色底物
ＮＢＴ ６６ μＬ和 ＢＣＩＰ ３３ μＬ 加到 １０ ｍＬ 底物缓冲液
中混匀，洗好的 ＮＣ 膜用吸水纸吸干后放入底物显
色液中反应 １５ ｍｉｎ，等阳性对照显色明显，但阴性无
任何反应时，用自来水冲洗，直接观察并记录结果。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＲＴ⁃ＰＣＲ检测
参考硅粒吸附法（张德咏等，２００５）提取植物总
ＲＮＡ，用经 ＤＮａｓｅＡ处理的无菌水溶解， － ２０℃保存
备用。 按照反转录试剂盒操作说明进行。 依次加入
ＲＮＡ ８ μＬ、Ａｌｌ Ｍｉｘ ４ μＬ、Ｈ２Ｏ ８ μＬ。 轻轻混匀，２５℃
孵育 １０ ｍｉｎ，４２℃孵育 ３０ ｍｉｎ，然后 ８５℃加热 ５ ｍｉｎ失
活 ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ／ ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ。 ｃＤＮＡ 于 －２０℃
保存备用。 检测引物 ＣＭＶ⁃ＣＰ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５′⁃ＣＡＡＡ⁃
ＣＡＧＣＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧ⁃３′，ＣＭＶ⁃ＣＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５′⁃
ＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＧＴＴＣ⁃３′；ＣＭＶ⁃ＭＰ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５′⁃ＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣ⁃３′， ＣＭＶ⁃ＭＰ （ Ｒｅｖｅｒ⁃
ｓｅ）：５′⁃ＡＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＧ⁃３′；ＣＭＶ⁃２ｂ（Ｆｏｒｗａ⁃
ｒｄ）： ５′⁃ＣＡＡＡＣＡＧＣＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧ⁃３′， ＣＭＶ⁃２ｂ
（ Ｒｅｖｅｒｓｅ ）： ５′⁃ＧＧＣＧＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＡＡ⁃３′；
ＡＣＴ（ＢＴ０１３７０７）Ｆ：５′⁃ＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴ⁃
ＧＡＴＧＣＴ⁃３′，ＡＣＴ（ＢＴ０１３７０７）Ｒ：５′⁃ＡＴＡＣＧＣＡＴＣＣＴ⁃
ＴＣＴＧＴＣＣＣＡＴＴＣＣＧＡ⁃３′。 引物均由北京六合华大
基因科技股份有限公司合成。 取 ０􀆰 ２ ｍＬ ＰＣＲ 薄壁
管，依次加入以下试剂： １０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、
１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰ混合物 １􀆰 ６ μＬ、２０ μｍｏｌ ／ Ｌ 上游引
物 １ μＬ、２０ μｍｏｌ ／ Ｌ 下游引物 １ μＬ、ｃＤＮＡ 模板 １
μＬ、５ μ ／ Ｌ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０􀆰 ３ μＬ，加灭菌水至终
体积为 ２０ μＬ。 ＰＣＲ 反应条件：９４℃预变性 ５ ｍｉｎ，
９４℃变性 ４５ ｓ，退火温度 ＣＰ、ＭＰ 及 ２ｂ 分别是 ５７℃
４５ ｓ、５６℃ ５０ ｓ、５５℃ ４５ ｓ，７２℃延伸 １ ｍｉｎ，共 ３４ 个
循环，最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎ，ＰＣＲ产物用 １％琼脂糖
电泳检测。
１􀆰 ２􀆰 ３ ＰＣＲ产物回收与克隆
ＰＣＲ产物参照 ＰＣＲ割胶回收试剂盒说明进行。
ＰＣＲ产物克隆具体参照 ｐＥＡＳＹ⁃Ｔ１ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ试
剂盒说明进行。 转化后进行菌落 ＰＣＲ筛选，阳性菌
落在含 ５０ μｇ ／ ｍＬ 氨苄青霉素的 ＬＢ 液体培养基中
３７℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下进行培养，提取质粒并酶切
鉴定，阳性重组质粒送生工生物工程（上海）股份有
限公司进行测序。
１􀆰 ２􀆰 ４ 序列分析
利用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ 软件分析本研究获得的 １５ 个
ＣＭＶ分离物 ＣＰ、ＭＰ、２ｂ 三对基因序列与 ＧｅｎＢａｎｋ
中已登录 ＣＭＶ分离物序列相似性，用 ＭＥＧＡ ５􀆰 ０ 软
件中最小进化的邻接法构建系统发育树，Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ
选择１ ０００次重复，一般 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 值 ＜ ７０ 的分支常
被认为是不可靠的。 所用 ＧｅｎＢａｎｋ 中已报道分离
物编号：ＣＭＶ 亚组 ＩＡ 分离物 Ｆｎｙ、Ｌｅｇ、Ｍｆ、Ｙ、Ｏ；
ＣＭＶ 亚组 ＩＢ 分离物 ＩＡ、 ＬＸ、 Ｎｔ９、 ＳＤ、 Ｔｆｎ、 ＡＮ、
Ｐ３６１３；ＣＭＶ亚组 ＩＩ 分离物 ＬＳ、Ｌｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔｒｋ７；选用
花生矮化病毒（Ｐｅａｎｕｔ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ，ＰＳＶ）作为本研究
构建系统发育树的外群。
１􀆰 ２􀆰 ５ ＣＭＶ生物学检测
将采集的辣椒、黄瓜、南瓜及西葫芦等样品分别
放入研钵后，加入研磨缓冲液研磨的样品汁液和对
照株系 ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３（ ＩＢ）分别接种到温室（２８℃）苋
色藜上，用针头挑选苋色藜上的单个枯斑，放入研钵
中研磨，然后接种到撒有石英砂的心叶烟叶片上
（刘勇等，１９９９），３ ～ ５ ｄ 心叶烟表现出系统花叶症
状，再取心叶烟发病叶片，加入研钵中研磨，取汁液
摩擦接种到苋色藜上，３ ～ ５ ｄ 苋色藜表现出枯斑症
状，然后取单个枯斑再次接种至心叶烟上，重复 ３
次。 最后繁殖并保存于心叶烟上。
２ 结果与分析
２􀆰 １ ＣＭＶ的检测与分离
采自湖南、新疆、青海和海南 ４ 省区共计１ ３６７
份样品中，西葫芦、黄瓜、丝瓜、南瓜、苦瓜、香瓜、辣
椒、茄子、番茄、龙葵上的 ＣＭＶ血清学和 ＲＴ⁃ＰＣＲ阳
性检出率分别为 ５０􀆰 １２％ 和 ５４􀆰 １３％ 、 ９􀆰 ０７％ 和
１４􀆰 ２５％ 、 ５􀆰 １１％ 和 ７􀆰 ０１％ 、 １５􀆰 ４２％ 和 １８􀆰 ４６％ 、
１３􀆰 １６％ 和 １４􀆰 ２５％ 、 ５􀆰 １９％ 和 ７􀆰 ５４％ 、 ６􀆰 ５０％ 和
６􀆰 ７９％ 、 ５􀆰 ５６％ 和 ８􀆰 １１％ 、 １５􀆰 １１％ 和 １８􀆰 ４６％ 、
５􀆰 ３６％和 ２９􀆰 １９％ 。 分离得到的 １５ 个 ＣＭＶ 分离物
中， ＣＭＶ⁃Ｓ１、 ＣＭＶ⁃Ｓ１７、 ＣＭＶ⁃Ｓ２０、 ＣＭＶ⁃Ｓ２２、 ＣＭＶ⁃
Ｓ２８、ＣＭＶ⁃Ｙ１、ＣＭＶ⁃Ｗ４、ＣＭＶ⁃Ｎ５、ＣＭＶ⁃Ｎ７ 为湖南
９２４３ 期 陈玉珍等： 我国部分地区常见农作物上黄瓜花叶病毒分离物核酸多样性分析
分离物， ＣＭＶ⁃Ｈ１、 ＣＭＶ⁃Ｈ５、 ＣＭＶ⁃Ｈ６ 为海南分离
物；ＣＭＶ⁃Ｘ４、ＣＭＶ⁃Ｘ８ 为新疆分离物以及 ＣＭＶ⁃Ｑ５
为青海分离物。 这 １５ 个分离物的 ＣＰ、ＭＰ 及 ２ｂ 基
因的扩增产物分别为 ７７３、８３４ 及 ３３４ ｂｐ。
２􀆰 ２ ＣＭＶ的 ＣＰ、ＭＰ及 ２ｂ基因核酸多样性分析
２􀆰 ２􀆰 １ ＣＰ基因核酸序列多样性分析
１５ 个 ＣＭＶ 分离物中有 １４ 个属于 ＣＭＶ 亚组
ＩＢ，与 ＣＭＶ亚组 ＩＢ标准株系的相似性达９３􀆰 ９０％ ～
９５􀆰 ５６％ ，而 １４ 个分离物间的相似性也高达
９３􀆰 ７９％ ～９９􀆰 ５６％ ；与 ＣＭＶ 亚组 ＩＡ 标准株系的相
似度为 ９２􀆰 ０３％ ～ ９４􀆰 ３９％ ，与 ＣＭＶ 亚组 ＩＩ 标准株
系的相似度只有 ７７􀆰 ４６％ ～ ７９􀆰 ９０％ ；仅有 １ 个来自
青海的分离物 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 归属于亚组 ＩＩ，与亚组 ＩＩ 标
准株系的相似度为 ９７􀆰 ６３％ ～ ９９􀆰 ５６％ 。 湖南、新疆
及海南 ３ 省区分离物内部的相似性分别为
９９􀆰 ７１％ 、９９􀆰 ５６％及 ９７􀆰 ６３％ 。 分离物省份之间的
相似性为９２􀆰 ８１％ ～ ９６􀆰 ６２％ 。 ＣＭＶ⁃Ｙ１ 与美国番茄
上的分离物 ＩＸ（２０２１９）的亲缘关系最近，处于 １ 个
分支； ＣＭＶ⁃Ｈ１、 ＣＭＶ⁃Ｎ５ 与 Ｎｔ９ （ Ｄ２８７７９ ） 和 Ｔｆｎ
（Ｙ１６９２６）亲缘关系较近（图 １）。
图 １ ＣＭＶ分离物 ＣＰ基因核苷酸序列系统进化树
Ｆｉｇ． １ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＣＰ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
　
２􀆰 ２􀆰 ２ ＭＰ基因核酸序列多样性分析
１５ 个 ＣＭＶ分离物中有 １３ 个属于ＭＰ基因亚组
ＩＢ，与亚组 ＩＢ 标准株系的相似性达到 ９０􀆰 ４４％ ～
９５􀆰 ８１％ ，而湖南、新疆及海南 ３ 省区 ＣＭＶ 亚组 ＩＢ
分离物的相似性为 ９７􀆰 ４２％ ；湖南分离物 ＣＭＶ⁃Ｎ７
和青海分离物 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 属于 ＣＭＶ亚组 ＩＩ，且相似性
为 ９９􀆰 １９％ ，但是与其余 １３ 个分离物的相似性为
７２􀆰 ９２％ ～７８􀆰 ６１％ （图 ２）。
２􀆰 ２􀆰 ３ ２ｂ基因核酸序列多样性分析
１５ 个 ＣＭＶ分离物中 １４ 个属于 ＣＭＶ 亚组 ＩＢ，
与 ＣＭＶ亚组 ＩＢ 标准株系的相似性达到 ９０􀆰 ７１％ ～
９４􀆰 ５４％ ，与 ＣＭＶ亚组 ＩＩ 标准株系的相似度较低为
６０􀆰 ３３％ ～ ６３􀆰 ０４％ ；ＣＭＶ⁃Ｎ７ 属于 ＣＭＶ 亚组 ＩＩ，与
ＣＭＶ 亚组 ＩＢ 标准株系的相似性为 ６０􀆰 １１％ ～
６５􀆰 ７９％ ，与 ＣＭＶ 亚组 ＩＩ 标准株系的相似度高达
９９􀆰 １１％ ～９９􀆰 ６１％ 。 湖南、新疆和海南分离物内部
的相似性分别为 ９９􀆰 ４５％ 、９９􀆰 ９１％和 ９７􀆰 ５４％ ，而分
离物省份间的相似性为 ９３􀆰 １７％ ～９５􀆰 ９０％ （图 ３）。
２􀆰 ３ 分离物的生物学检测分析
ＣＭＶ⁃Ｎ７ 和 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 在系统寄主心叶烟和枯斑
寄主苋色藜上的症状与 ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３（ ＩＢ）的症状存
在明显差异，ＣＭＶ⁃Ｎ７ 和 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 在系统寄主心叶
烟上较 ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３（ＩＢ）发病的时间延迟 １ ～ ２ ｄ，花
叶症状温和，发病时间和发病严重度顺序为 ＣＭＶ⁃
０３４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
图 ２ ＣＭＶ分离物 ＭＰ基因核苷酸序列系统进化树
Ｆｉｇ． ２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＭＰ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
　
图 ３ ＣＭＶ分离物 ２ｂ基因核苷酸序列系统进化树
Ｆｉｇ． ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ２ｂ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
　
Ｎ７ ＜ ＣＭＶ⁃Ｑ５ ＜ ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３（ ＩＢ）；而且在枯斑寄主
苋色藜上 ＣＭＶ⁃Ｎ７ 和 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 产生的枯斑明显小于
　 　 　
ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３（ＩＢ）产生的枯斑，枯斑大小分别约为 １、
１ 和 ３ ｍｍ，表明它们的致病力存在明显差别。
１３４３ 期 陈玉珍等： 我国部分地区常见农作物上黄瓜花叶病毒分离物核酸多样性分析
３ 讨论
本研究采集的１ ３６７个样品用浙江大学提供的
ＣＭＶ抗血清检测病毒时，检测率较低，如 ＣＭＶ⁃Ｑ５、
ＣＭＶ⁃Ｘ４、ＣＭＶ⁃Ｘ８ 等血清学检测为阴性的样品，用
ＲＴ⁃ＰＣＲ方法却检测到 ７７３ ｂｐ 目的条带，并且通过
生物学方法也获得纯化的 ＣＭＶ⁃Ｑ５、ＣＭＶ⁃Ｘ４、ＣＭＶ⁃
Ｘ８ 病毒。 程朝玲等（２０１３）发现对血清学检测结果
为阴性的样品进行 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测，可以检测到目的
片段；而 ＤＡＳ⁃ＥＬＩＳＡ 检测结果为阳性的样品，也有
部分检测不到目的片段。 因此选取血清学检测为阳
性的 ＣＭＶ⁃Ｓ１、ＣＭＶ⁃Ｓ１７、ＣＭＶ⁃Ｈ１、ＣＭＶ⁃Ｈ６ 这 ４ 个
样品，通过 ＰＣＲ 扩增 ＣＰ 基因序列发现 ＣＭＶ⁃Ｘ４、
ＣＭＶ⁃Ｘ８ 与 ＣＭＶ⁃Ｓ１、 ＣＭＶ⁃Ｓ１７、 ＣＭＶ⁃Ｈ１、 ＣＭＶ⁃Ｈ６
的序列相似度为 ９９􀆰 ２４％ ，氨基酸比对特意位点变
异；而 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 属于 ＣＭＶ亚组 ＩＩ；说明样品中 ＣＭＶ
病毒含量低和抗血清型都会使检测结果存在差异。
病毒株系重组或者重排是导致病毒株系致病力
变异的重要原因，也是抗性育种面临的挑战（陈玲
娜等，２０１１）。 本研究中来自湖南永州辣椒的分离
物 ＣＭＶ⁃Ｎ７ ＣＰ及 ２ｂ基因的核酸序列进化分析中属
于 ＣＭＶ亚组 ＩＢ，ＣＰ及 ２ｂ基因与其它分离物 ＣＰ 及
２ｂ基因的序列同源性分别达 ９７􀆰 ７４％和 ９８􀆰 ０９％ 。
但是 ＭＰ基因的核酸序列进化分析中属于 ＣＭＶ 亚
组 ＩＩ，与其它分离物 ＭＰ 基因的序列同源性仅仅为
８０􀆰 ０４％ ，而且通过生物学特性比较表明：ＣＭＶ⁃Ｎ７、
ＣＭＶ⁃Ｑ５ 与 ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３ （ ＩＢ）三者之间的症状存在
明显差异。 青海分离株系 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 来源于黄瓜侵染
样品，其发病时间延迟 １ ～ ２ ｄ，花叶症状温和，而枯
斑寄主苋色藜上的枯斑明显小于 ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３（ ＩＢ）
的枯斑，初步表明 ＣＭＶ⁃Ｑ５ 可能是自然纯合亚组 ＩＩ
株系。 ２ｂ是一个多功能蛋白，而且在低温条件下存
在核酸多态性（Ｒｏｏｓｓｉｎｃｋ，２００２），本研究中 ＣＭＶ⁃Ｑ５
的 ２ｂ基因与 ＣＭＶ 亚组 ＩＡ 和 ＩＢ 的同源性分别为
６０􀆰 ３３％ ～ ６３􀆰 ０４％ 和 ６０􀆰 ８７％ ～ ６２􀆰 ５０％ 。 据研究
报道 ２ｂ是 ＣＭＶ编码的基因沉默抑制子，在 ＣＭＶ侵
染植物时对植物防卫反应进行抑制 （张兴桃等，
２０１１；Ｄａｖｉｎｏ ｅｔ ａｌ． ，２０１２），可推测 ＣＭＶ⁃Ｑ５ ２ｂ 基因
的沉默抑制活性比 ＣＭＶ⁃Ｐ３６１３ （ ＩＢ）的弱。 并且
ＣＭＶ亚组 ＩＩ 病毒在高温状态下容易出现隐症及温
度敏感性的现象（田兆丰等，２００９）。 由此可猜测
ＣＭＶ⁃Ｑ５ 属于纯合的亚组 ＩＩ 株系，由上述研究结果
可以推测 ＣＭＶ⁃Ｎ７ 可能存在亚组 ＩＢ与亚组 ＩＩ ＲＮＡ３
ＭＰ的重排或者重组（Ｎｏｕｒｉｌ ｅｔ ａｌ． ，２０１４）。 Ｕｒｑｕｉｄｉ
＆ Ｂｉｓｈｏｐ（１９９２）通过人工重组证实 ＣＭＶ亚组 ＩＡ和
ＩＢ之间可以进行重组，重组株系与母本株系在生物
学、致病力等方面均出现变异；而且 Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．
（１９９５）和 Ｒｏｏｓｓｉｎｃｋ（２００２）很早就证实了不同布尼
亚病毒株系在自然条件下同时侵染同一宿主或细胞
时，可以发生重组或者重排，番茄黄化曲叶病毒（Ｔｏ⁃
ｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ，ＴＹＬＣＶ）在植物体内自然
重组非常普遍。 表明 ＲＮＡ 病毒与寄主存在协同进
化，而且进化过程依赖于自身基因重组或者重排以
克服寄主植物的抗性防卫反应或者突破寄主植物的
抗性（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． ，２００７）。 ＣＭＶ病毒是三分体 ＲＮＡ
病毒，其重组或者重排十分复杂。 有关 ＣＭＶ⁃Ｎ７ 自
然重组、致病性、重组片段方向遗传学定位等有待进
一步研究。
本研究获得的 １５ 个分离物的 ＣＰ、ＭＰ 及 ２ｂ 的
序列的系统进化分析和生物学性状分析显示，这些
样品均属于 ＣＭＶ亚组 ＩＢ和 ＣＭＶ亚组 ＩＩ，但至少可
分为 ２ 个组群，且序列与寄主和省份无明显相关性，
说明在湖南、新疆、青海、和海南 ４ 省区 ＣＭＶ存在分
子变异和株系分化趋势。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
Ｂｒｉｇｎｅｔｉ Ｇ， Ｖｏｉｎｎｅｔ Ｏ， Ｌｉ ＷＸ， Ｊｉ ＬＨ， Ｄｉｎｇ ＳＷ， Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ ＤＣ．
１９９８． Ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ａｒｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓ⁃
ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ． Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，
１７（２２）： ６７３９ － ６７４６
Ｃｈｅｎ ＬＮ， Ｍａ ＹＸ， Ｇａｏ ＢＤ， Ｚｈｕ ＳＦ． ２０１１． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｋｅｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ
ｆａｃｔｏｒｓ ｂｙ ｐｓｅｕｄｏ⁃ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ
Ｍ ａｎｄ Ｆｎｙ ｓｔｒａｉｎｓ． Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ４１（１）： ４９ －
５６ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［陈玲娜， 马云霞， 高必达， 朱水芳． ２０１１．
用黄瓜花叶病毒 Ｍ和 Ｆｎｙ株系的假重组体分析致病关键因
子． 植物病理学报， ４１（１）： ４９ － ５６］
Ｃｈｅｎ ＹＦ， Ｃｈｅｎ ＪＳ， Ｚｈａｎｇ ＨＲ， Ｔａｎｇ ＸＳ， Ｄｕ ＺＹ． ２００７． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｅｖｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ＩＡ ａｎｄ ＩＩ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，
３５（２）： ４０５ － ４１３
Ｃｈｅｎｇ ＣＬ， Ｘｉａｎｇ ＢＣ， Ｃｕｉ ＢＭ， Ｚｈｅｎｇ ＹＹ． ２０１３． Ｔｈｅ ＣＭＶ ｓｔｒａｉｎｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ， ｐｕｍｐｋｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｐｅｒｓ ｉｎ
Ｓｈｉｈｅｚｉ ａｎｄ Ｙｉｎｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ４０（２）： １１５ －
１２０ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［程朝玲， 向本春， 崔百明， 郑银英．
２０１３． 新疆石河子、伊宁地区黄瓜花叶病毒株系分化． 植物
保护学报， ４０（２）： １１５ － １２０］
Ｄａｖｉｎｏ Ｓ， Ｐａｎｎｏ Ｓ， Ｒａｎｇｅｌ ＥＡ， Ｄａｖｉｎｏ Ｍ， Ｂｅｌｌａｒｄｉ ＭＧ， Ｒｕｂｉｏ Ｌ．
２０１２． Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ
ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｎｄ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉｔａｌｙ．
Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １５７（４）： ７３９ － ７４５
Ｄｉｎｇ Ｂ， Ｌｉ ＱＢ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｌ， Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ Ｐ， Ｌｕｃａｓ ＷＪ． １９９５ａ． Ｃｕ⁃
２３４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
ｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ３ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｃｅｌｌ⁃ｔｏ⁃ｃｅｌｌ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ
ｏｆ ＣＭＶＲＮＡ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０７（２）： ３４５ － ３５３
Ｄｉｎｇ ＳＷ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＢＪ， Ｈａａｓｅ ＨＲ， Ｓｙｍｏｎｓ ＲＨ． １９９４． Ｎｅｗ ｏｖｅｒ⁃
ｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ．
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９８（２）： ５９３ － ６０１
Ｄｉｎｇ ＳＷ， Ｌｉ ＷＸ， Ｓｙｍｏｎｓ ＲＨ． １９９５ｂ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ
ｈｙｂｒｉｄ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ａ ｐｌａｎｔ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｌｏｎｇ ｄｉｓ⁃
ｔａｎｃｅ ｖｉｒｕｓ ｍｏｖｅｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １４ （ ２３ ）：
５７６２ － ５７７２
Ｇａｌｌｉｔｅｌｌｉ Ｄ． ２０００． Ｔｈｅ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｓｕｓ⁃
ｔａｉｎａｂｌｅ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ７１（１ ／ ２）： ９ － ２１
Ｈａｙｅｓ ＲＪ， Ｂｕｃｋ ＫＷ． １９９０． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｖｉ⁃
ｒｕｓ ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＲＮＡ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ⁃
ａｓｅ． Ｃｅｌｌ， ６３（２）： ３６３ － ３６８
Ｈｉｄｅａｋｉ Ｎ， Ｋａｚｕｙｕｋｉ Ｍ， Ｉｗａｏ ＦＳ． ２００１． Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅ⁃
ｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃｅｌｌ⁃ｔｏ⁃ｃｅｌｌ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，
７５（１７）： ８０４５ － ８０５３
Ｌｉ ＱＢ， Ｒｙｕ ＫＨ， Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ Ｐ． ２００１． Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ⁃ｐｌａｎｔ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ３ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｉｎ⁃
ｆｅｃｔｉｖｉｔｙ， ｃｅｌｌ⁃ｔｏ⁃ｃｅｌｌ ｍｏｖｅｍｅｎｔ， ａｎｄ ｌｏｎｇ⁃ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ．
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ， １４（３）： ３７８ － ３８５
Ｌｉｕ Ｙ， Ｚｈａｎｇ ＤＹ， Ｗａｎｇ ＸＰ， Ｚｈｏｕ ＸＰ， Ｌｉ ＤＢ． １９９９． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ａ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＭＶ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）， ２５（５）： ３６１ － ３６５ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［刘勇，
张德咏， 王小平， 周雪平， 李德葆． １９９９． 黄瓜花叶病毒外
壳蛋白基因克隆及在病毒检测中的应用． 湖南农业大学学
报（自然科学版）， ２５（５）： ３６１ － ３６５］
Ｋａｐｌａｎ ＩＢ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ Ｐ． １９９７． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕ⁃
ｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２４６（２）： ２２１ － ２３１
Ｍａｏｋａ Ｔ， Ｈａｙａｎｏ ＹＳ， Ｉｗａｓａｋｉ Ｍ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ， Ｍａｓｕｔａ Ｃ． ２０１０．
Ｍｉｘｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎａｔ⁃
ｕｒａｌ ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉ⁃
ｒｕｓ． Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ， ４０： １４８ － １５０
Ｎｏｕｒｉｌ Ｓ， Ａｒｅｖａｌｏ Ｒ， Ｆａｌｋ ＢＷ， Ｇｒｏｖｅｓ ＲＬ． ２０１４． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ
ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ９（５）： ｅ９６５８２
Ｐｅｒｒｙ ＫＬ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， Ｓｈｉｎｔａｋｕ ＭＨ， Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ Ｐ． １９９４． Ｍａｐｐｉｎｇ ｄｅ⁃
ｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｂｙ Ａｐｈｉｓ
ｇｏｓｓｙｐｉｉ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０５（２）： ５９１ － ５９５
Ｒｏｏｓｓｉｎｃｋ ＭＪ． ２００２． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ
ｄｅｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７６（７）：
３３８２ － ３３８７
Ｓｏｎｇ ＴＴ， Ｃｈｅｎ ＲＹ， Ｙａｎｇ ＬＬ． ２００７． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＰＣＲ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｏｎ ＴＭＶ ａｎｄ ＣＭＶ． Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， （１）： ５３ － ５４ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［宋婷婷， 陈荣溢， 杨
雷亮． ２００７． 应用多重 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测烟草上的 ＴＭＶ和 ＣＭＶ．
辽宁农业科学， （１）： ５３ － ５４］
Ｔｉａｎ ＺＦ， Ｙｕ ＪＬ， Ｌｉｕ ＷＣ， Ｑｉｕ ＪＹ， Ｌｉｕ ＤＷ． ２００９． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｂｉｏ⁃ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ ＣＭＶ）
ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ． Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｂｏｒｅａｌｉ⁃Ｓｉｎｉｃａ， ２４（５）：
２０１ － ２０５ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［田兆丰， 于嘉林， 刘伟成， 裘季燕，
刘德文． ２００９． 黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组Ⅰ、Ⅱ分离物生物
学特性比较研究． 华北农学报， ２４（５）： ２０１ － ２０５］
Ｕｒｑｕｉｄｉ Ｖ， Ｂｉｓｈｏｐ ＤＨ． １９９２． Ｎｏｎ⁃ｒａｎｄｏｍ ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ
ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ＲＮＡ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅ ａｎｄ ｓｎｏｗ ｓｈｏｅ ｈａｒｅ ｖｉｒｕ⁃
ｓｅｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７３（９）： ２２５５ － ２２６５
Ｗａｈｙｕｎｉ ＷＳ， Ｄｉｅｔｚｇｅｎ ＲＧ， Ｈａｎａｄａ Ｋ， Ｆｒａｎｃｋｉ ＲＩＢ． １９９２． Ｓｅｒｏ⁃
ｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｄ ｗｉｔｈｉｎ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｎ
ａｎｄ Ｑ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ４１
（３）： ２８２ － ２９７
Ｗｈｉｔｅ ＰＳ， Ｍｏｒａｌｅｓ Ｆ， Ｒｏｏｓｓｉｎｃｋ ＭＪ． １９９５． Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｓｓｏｒｔ⁃
ｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｖｉｒｕｓｅｓ．
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０７（１）： ３３４ － ３３７
Ｚｈａｎｇ ＤＹ， Ｔａｎ ＸＱ， Ｌｕｏ ＹＨ， Ｈｅ ＭＹ， Ｄａｉ ＪＰ， Ｚｈａｎｇ ＺＨ， Ｌｉｕ Ｙ．
２００５． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｅｐｐｅｒ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ
ｔｕｂｅ ＲＴ⁃ＰＣＲ． ／ ／ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ２００５ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ
ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ． Ｂｅｉｊｉｎｇ： Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉ⁃
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． ２８２ － ２８７ （ｉｎ Ｃｈｉ⁃
ｎｅｓｅ） ［张德咏， 谭新球， 罗源华， 何明远， 戴建平， 张战
泓， 刘勇． ２００５． 用单管逆转录 －聚合酶链式反应检测辣椒
黄瓜花叶病毒． ／ ／中国植物保护学会 ２００５ 年学术年会会议
论文集． 北京： 中国农业科技出版社， ｐｐ． ２８２ － ２８７］
Ｚｈａｎｇ ＸＴ， Ｌｉ ＹＨ， Ｇａｏ ＧＺ， Ｃａｏ ＷＧ， Ｌｉｕ ＸＹ， Ｗａｎｇ ＨＣ， Ｙｕａｎ
ＷＦ． ２０１１． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ
ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ３８（２）： ２９２ － ２９５ （ ｉｎ Ｃｈｉ⁃
ｎｅｓｅ） ［张兴桃， 李艳红， 高贵珍， 曹稳根， 刘小阳， 王海
潮， 袁维风． ２０１１． 低温胁迫对黄瓜花叶病毒 ＣＭＶ⁃ＢＧ株系
ＣＰ基因多态性的影响． 安徽农业大学学报， ３８（２）： ２９２ －
２９５］
（责任编辑：高　 峰）
３３４３ 期 陈玉珍等： 我国部分地区常见农作物上黄瓜花叶病毒分离物核酸多样性分析