全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（４）： ５４４ － ５５１ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０４􀆰 ００３
基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（２０１４ＩＫ００５，２０１５ＩＫ２２５），国家质量监督检验检疫总局公益性课题（２０１３１００６８）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｇａｏｗｎ＠ ｂｊｃｉｑ． ｇｏｖ． ｃｎ， ｃｈｕｎｊｉｅ＠ ｌｚｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
收稿日期： ２０１５ － ０５ － １２
基于 ＤＮＡ条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定
雷娅红１ 　 况卫刚２ 　 郑春生３ 　 李秀璋１ 　 高文娜３∗　 李春杰１∗
（１．兰州大学草地农业科技学院， 草地农业生态系统国家重点实验室， 兰州 ７３００２０； ２．中国农业大学植物保护学院，
北京 １００１９３； ３．北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心， 北京 １０１３１２）
摘要： 为筛选合适的基因序列对镰刀菌属 Ｆｕｓａｒｉｕｍ真菌进行检测鉴定，以从不同寄主分离获得的
１１ 种 ５７ 株镰刀菌为材料，选择 ｎｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α、ｍｔＳＳＵ和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ作为候选基因，将序列获得的
难易程度和种内与种间遗传距离频率分布作为评价指标，对测序获得的有效序列进行研究，筛选出
该属的 ＤＮＡ条形码。 结果表明：ＥＦ⁃１α 基因具有较高的 ＰＣＲ 扩增与测序成功率，为 ９８􀆰 ２％ ，较
ｍｔＳＳＵ和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ基因更容易获得序列片段；且种内与种间遗传距离重叠部分较少，除木贼镰刀菌
Ｆ． ｅｑｕｉｓｅｔｉ种内遗传距离为 ０􀆰 ０２９，大于黄色镰刀菌 Ｆ． ｃｕｌｍｏｒｕｍ 和禾谷镰刀菌 Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ 种
间遗传距离 ０􀆰 ０２１ 外，种间差异明显大于种内差异，优于其它基因，能更好地区分镰刀菌；利用
ＥＦ⁃１α基因序列构建的系统发育树显示，相同种聚集在同一分支，不同种划分在不同分支，鉴别能
力较好；ＥＦ⁃１α基因不能扩增出其它 ６ 株非镰刀菌属的主要植物病原真菌，而对镰刀菌的 ＰＣＲ 扩
增效果很好，电泳检测结果条带单一、明亮。 表明 ＥＦ⁃１α基因可作为镰刀菌属鉴定的 ＤＮＡ条形码。
关键词： 镰刀菌； 序列分析； ＰＣＲ扩增与测序成功率； 遗传距离； ＤＮＡ条形码
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂｙ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ
Ｌｅｉ Ｙａｈｏｎｇ１ 　 Ｋｕａｎｇ Ｗｅｉｇａｎｇ２ 　 Ｚｈｅｎｇ Ｃｈｕｎｓｈｅｎｇ３ 　 Ｌｉ Ｘｉｕｚｈａｎｇ１ 　 Ｇａｏ Ｗｅｎｎａ３∗ 　 Ｌｉ Ｃｈｕｎｊｉｅ１∗
（１． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｒａｓｓｌａｎｄ Ａｇｒｏ⁃Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐａｓｔｏｒａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００２０， Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｅｎｔｒｙ⁃Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０１３１２， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ， ｔｈｅ ｎｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ， ＥＦ⁃１α，
ｍｔＳＳＵ， ａｎｄ β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ． Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ５７ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ １１ Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｓｔｓ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ｔｈｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｗｉｔｈｉｎ ａｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ａｓ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｔｏ
ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ
ＥＦ⁃１α ｗａｓ ９８􀆰 ２％ ， ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｍｔＳＳＵ ａｎｄ β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ． Ａｍｏｎｇ ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｓ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ａｂｏｖｅ，
ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＥＦ⁃１α ｇｅｎｅ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｉｎ ｏｖｅｒｌａｐ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ． Ａｎｄ
ｉｎｔｅｒ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｅｘｃｅｐｔ ｔｈｅ ｉｎｔｒａ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｄｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｆ． ｅｑｕｉｓｅｔｉ ｗａｓ ０􀆰 ０２９ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ａｎｄ
Ｆ． ｃｕｌｍｏｒｕｍ ｗａｓ ０􀆰 ０２１． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＥＦ⁃１α ｔｒｅｅ， ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ． ＥＦ⁃１α ｇｅｎｅ
ｃｏｕｌｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｅｓ． ＥＦ⁃１α ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄｎ’ｔ ａｍｐｌｉｆｙ ｓｉｘ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｅｒａ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｅｒｅ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ
ｂｒｉｇｈｔ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ＥＦ⁃１α ｇｅｎｅ ｗａｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ａｓ ｔｈｅ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｆｕｓａｒｉｕｍ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； ＰＣＲ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ；
ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ
　 　 镰刀菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ． 是一类世界性分布的重
要植物病原真菌，普遍存在于土壤、空气和植物残体
中，可侵染植物的任何部位 （ Ｓｕｍｍｅｒｅｌｌｅｔ ａｌ． ，
２００３）；寄主范围极广，能引起农作物、饲用植物、药
用植物、观赏植物等 １００ 多种寄主发生萎蔫、根腐、
穗腐、茎腐等病害，造成严重的经济损失（张向民，
２００５）。 如芹菜枯萎病菌 Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ａｐｉｉ是
我国进境检疫性有害生物，一旦传入扩散将对我国
农业生产造成严重的损失；引起香蕉枯萎病的尖孢
镰刀菌古巴专化型 Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ可对
寄主产生毁灭性危害（曾莉莎等，２０１４）。 此外，镰
刀菌在致病过程中能产生多种毒素加强其致病力、
加快寄主发病速度，在动植物体内积累的毒素还可
污染农产品，给动物和人类的食物安全带来严重隐
患（张卫娜等，２０１３），如由禾谷镰刀菌 Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａ⁃
ｒｕｍ等致病菌引起的赤霉病不仅造成麦类作物产量
损失，产生的毒素还严重威胁着人畜健康（武爱波，
２００５）。 因此，对镰刀菌进行快速、准确的鉴定是防
治其寄主植物病害发生以及预防其次生代谢产物对
人畜健康造成威胁的基础。
镰刀菌属种类繁多、形态各异，以形态学建立的
分类系统很难对其进行准确的分类鉴定。 近几年，
单核苷酸多态性 （ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，
ＳＮＰ）（Ｌｅｓｌｉｅ ｅｔ ａｌ． ，２００７）、扩增片段长度多态技术
（ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ， ＡＦＬＰ ）
（Ｖｉｓｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ． ，２００９）、限制性片段长度多态性（ｒｅ⁃
ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＲＦＬＰ）、随机
扩增多态 ＤＮＡ （ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ，
ＲＡＰＤ）（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ． ，２００９）和简单重复序列（ｓｉｍｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）（李新凤等，２０１５）等分子生物
学技术逐渐被应用于镰刀菌的分类鉴定中。 ＤＮＡ
条形码技术作为一种新兴的分子检测技术得到了快
速发展，该技术是利用一段相对较短的标准 ＤＮＡ序
列对物种进行准确高效的鉴定，不受物种发育阶段
的限制，易扩增且具有较强的通用性（Ｈｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． ，
２００４）。 多种基因位点包括内转录间隔区（ ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）、β⁃微管蛋白（ β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ）、翻
译延伸因子（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ⁃１α，
ＥＦ⁃１α）、线粒体小亚基核糖体（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｍａｌｌ
ｓｕｂｕｎｉｔ ｒＤＮＡ，ｍｔＳＳＵ）（Ｙｌｉ⁃Ｍａｔｔｉｌａｅｔ ａｌ． ，２００２；２００４；
Ｓｃｈｒｏｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ，２００９）等已被广泛用于镰刀菌属及种
间的鉴定，目前应用最多的是 ＩＴＳ和 ＥＦ⁃１α基因（曹
雪梅等，２０１４）。
本研究利用 ＤＮＡ 条形码技术，选取 ＩＴＳ、ＥＦ⁃
１α、ｍｔＳＳＵ和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ共 ４ 个候选基因片段对 １１ 种
镰刀菌进行鉴定，将获得序列的难易程度和种内与
种间遗传距离频率分布作为主要的评价标准，筛选
适合于准确鉴定镰刀菌属的 ＤＮＡ条形码，旨在为镰
刀菌属病原菌的快速分子检测、分类鉴定及其系统
发育研究提供有力的技术基础，为我国进境口岸检
疫性病原真菌的快速鉴定提供技术支撑。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株：选取于 ２０１４ 年分离自不同寄主植物
的镰刀菌属 １１ 个种 ５７ 株菌，包括甘肃省苹果枝条
上 １１ 株尖孢镰刀菌 Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、９ 株三线镰刀菌
Ｆ． ｔｒｉｃｉｎｃｔｕｍ、６ 株燕麦镰刀菌 Ｆ． ａｖｅｎａｃｅｕｍ、３ 株锐
顶镰刀菌 Ｆ． ａｃｕｍｉｎａｔｕｍ、１ 株拟轮枝镰刀菌 Ｆ． ｖｅｒ⁃
ｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ和 １ 株变红镰刀菌 Ｆ． ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ，木耳上
的 １ 株砖红镰刀菌 Ｆ． ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ，花生上的 ２ 株木贼
镰刀菌 Ｆ． ｅｑｕｉｓｅｔｉ；重庆辣椒上的 １ 株木贼镰刀菌；
澳大利亚白三叶种子上的 ４ 株燕麦镰刀菌和 ２ 株木
贼镰刀菌，多年生黑麦草种子上的 １ 株尖孢镰刀菌
和 １ 株锐顶镰刀菌；美国一年生黑麦草种子上的 ３
株燕麦镰刀菌和 ２ 株黄色镰刀菌 Ｆ． ｃｕｌｍｏｒｕｍ；丹麦
多年生黑麦草种子上的 ３ 株禾谷镰刀菌；加拿大苏
丹草种子上的 １ 株尖孢镰刀菌和 １ 株变红镰刀菌，
紫花苜蓿种子上的 ２ 株 Ｆ． ｖｅｎｅｎａｔｕｍ。 ２ 株标准菌
株芹菜枯萎病菌 ＣＢＳ１７６􀆰 ３５ 和香蕉枯萎病菌尖孢
镰刀菌古巴专化型 ＣＢＳ１３０３０４ 购自荷兰 ＣＢＳ 真菌
保藏中心。 从寄主分离到的镰刀菌菌株通过含抗生
素青霉素、链霉素各 １００ ｍｇ ／ Ｌ的 ＰＤＡ培养基、２５℃
黑暗条件下培养纯化。
马铃薯葡萄糖琼脂（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）
培养基：马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、琼脂 １６ ｇ，加蒸
馏水定容至 １ ０００ ｍＬ。
试剂及仪器：植物基因组提取试剂盒、Ｔａｑ ＰＣＲ
ＭａｓｔｅｒＭｉｘ和 １ × ＴＡＥ 电泳缓冲液，天根生化科技
（北京）有限公司；ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ，宝生物工程（大
连） 有 限 公 司； 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯。
ＷＥ５２Ｂ５⁃９５９ 型培养箱，日本三洋公司；Ｉｃｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒ⁃
ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ仪、ＰｏｗｅｒＰｏｃ Ｂａｓｉｃ型电泳仪、Ｕｎｉｖｅｒ⁃
ｓａｌ ＨｏｏｄＩＩ型紫外凝胶成像系统，美国伯乐公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 菌株 ＤＮＡ提取及 ＰＣＲ扩增
将分离获得的菌株置于含抗生素青霉素和链霉
素各 １００ ｍｇ ／ Ｌ的 ＰＤＡ培养基上培养约 １４ ｄ 后，采
５４５４ 期 雷娅红等： 基于 ＤＮＡ条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定
用植物基因组试剂盒提取各菌株 ＤＮＡ，于 － ２０℃保
存备用。 针对真菌 ＤＮＡ 条形码技术的研究进展及
镰刀菌属的分子系统分类学研究现状，本研究共选
取了 ４ 个候选基因序列对 １１ 种镰刀菌进行检测鉴
定，分别为 ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α、ｍｔＳＳＵ和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ（表 １）。
２５ μＬ ＰＣＲ 反应体系为：２ × Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ溶液、１０ μｍｏｌ ／ Ｌ 上下游引物各 １ μＬ、模板 ２
μＬ，补充 ｄｄＨ２Ｏ 至 ２５ μＬ。 扩增程序为：９４℃预变
性 ５ ｍｉｎ；９４℃变性 ３０ ｓ，根据不同引物设置相应的
退火温度退火 ３０ ｓ，７２℃延伸 １ ｍｉｎ，３４ 个循环；７２℃
总延伸 ７ ｍｉｎ，４℃保存。 采用 １􀆰 ５％琼脂糖进行电
泳检测，ＰＣＲ产物纯化后由上海英骏生物技术有限
公司进行双向测序，所有序列提交至中国检疫性有
害生物数据库（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｑｂｏｌ． ａｐｑｃｈｉｎａ． ｏｒｇ）。
表 １ 本研究所用序列及引物信息
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
基因
Ｇｅｎｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列碱基 （５′⁃３′）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
退火温度 （℃）
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐ．
ＩＴＳ ＩＴＳ５ ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ． ，１９９０ ５２
ＩＴＳ４ ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ
ＥＦ⁃１α ＥＦ⁃１ ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣ Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ． ，１９９８ ５６
ＥＦ⁃２ ＧＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴ
ｍｔＳＳＵ ＭＳ１ ＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＧＡＡＴＡＴＴＡＧＴＣＡＡＴＧ Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ． ，１９９０ ５２
ＭＳ２ ＧＣＧＧＡＴＴＡＴＣＧＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＣ
β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ ｂｔ２ａ ＧＧＴＡＡＣＣＡＡＡＴＣＧＧＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣ Ｇｌａｓｓ ＆ Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，１９９５ ５８
ｂｔ２ｂ ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＣ
１􀆰 ２􀆰 ２ 候选基因序列的 ＰＣＲ扩增与测序成功率
ＰＣＲ扩增与测序成功率即 ＰＣＲ 扩增成功率和
测序成功率的乘积，用来表示序列获得的难易程度。
采用 １􀆰 ５％琼脂糖进行电泳检测，点样 ７ μＬ，用 １ ×
ＴＡＥ电泳缓冲液在 １００ Ｖ 的电场下电泳 ３０ ｍｉｎ，利
用紫外凝胶成像仪观察照相并分析，电泳条带单一、
明亮，长度正确，即认为扩增成功，可用于测序，若无
条带或出现多条亮带，进行重复 ＰＣＲ扩增并切胶回
收。 高质量的测序图谱，低峰较小，无杂峰、乱峰等
现象，则认为测序成功，峰形混乱的低质量序列，重
新进行测序以获得高质量的 ＤＮＡ序列。
１􀆰 ２􀆰 ３ 系统发育树构建及遗传距离分析
利用 ＢｉｏＥｄｉｔ ７􀆰 ０􀆰 ９ 对每个碱基逐一进行人工
校对，保证序列信息的准确可靠性（Ｈａｌｌ，１９９９）。 经
校对的序列用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ 软件进行序列比对（Ｌａｒｋｉｎ
ｅｔ ａｌ． ，２００７），将比对后的序列输入 ＭＥＧＡ ５􀆰 ２ 软
件，用邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）及 Ｋｉｍｕｒａ双参数
模型 （ Ｋｉｍｕｒａ ２⁃ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌ， Ｋ２Ｐ ） （ Ｋｉｍｕｒａ，
１９８０）构建系统发育树，Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 自展重复 １ ０００ 次
计算系统树中节点的置信度。 为了检验物种种内个
体间与种间遗传变异的差异是否显著，使用 ＭＥＧＡ
５􀆰 ２ 软件以 Ｋ２Ｐ模型计算种内与种间遗传距离，在
Ｅｘｃｅｌ ２００７ 中分析种间遗传距离频率分布对种内与
种间距离的条形码间隙（ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｇａｐ）进行检测
（Ｍｅｙｅｒ ＆ Ｐａｕｌａｙ，２００５）。
１􀆰 ２􀆰 ４ ＥＦ⁃１α基因对镰刀菌属检测鉴定能力的验证
为了验证 ＥＦ⁃１α 基因对镰刀菌属检测鉴定的
能力，选取非镰刀菌属的 ６ 种其它主要植物病原真
菌，包括枝孢霉属 Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．的枝状枝孢菌 Ｃ．
ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ和黄瓜黑星病菌 Ｃ． ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ、茎
点霉属 Ｐｈｏｍａ ｓｐ．的山葵墨入病菌 Ｐ． ｗａｓａｂｉａｅ和短
小茎点霉 Ｐ． ｅｘｉｇｕａ 以及拟茎点霉属 Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｓｐ．
的大豆北方茎溃疡病菌 Ｄ． ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ 和大豆拟茎
点霉种腐病菌 Ｄ． ｌｏｎｇｉｃｏｌｌａ，这些病菌与某些镰刀菌
造成的植物萎蔫、根腐、穗腐、茎腐等病害症状相类
似，同时也是生产上重要的病原真菌，其中黄瓜黑星
病菌和大豆北方茎溃疡病菌是我国进境检疫性有害
生物。 对 ＥＦ⁃１α基因进行 ＰＣＲ 扩增和凝胶电泳检
测，方法同 １􀆰 ２􀆰 １ 和 １􀆰 ２􀆰 ２。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 候选基因序列获得的难易程度
利用 ４ 个候选 ＤＮＡ 条形码片段 ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α、
ｍｔＳＳＵ和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ对镰刀菌属 １１ 个种 ５７ 株菌进行
ＰＣＲ扩增和电泳检测，电泳条带单一、明亮，长度正
确，扩增效果较好，符合测序要求。 最终测序获得
２０３ 条有效序列，候选片段的长度为３１９ ～ ７３８ ｂｐ。 ４
个基因中 ＩＴＳ 和 ＥＦ⁃１α 基因 ＰＣＲ 扩增与测序成功
率分别为 １００􀆰 ０％和 ９８􀆰 ２％ ，序列片段更易获得，而
ｍｔＳＳＵ和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ 基因 ＰＣＲ 扩增与测序成功率分
６４５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
别为 ８０􀆰 ７％和 ７７􀆰 ２％ ，序列片段相对而言不易获得 （表 ２）。
表 ２ 候选基因 ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α、ｍｔＳＳＵ和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ的 ＰＣＲ扩增和测序成功率
Ｔａｂｌｅ ２ ＩＴＳ， ＥＦ⁃１α， ｍｔＳＳＵ ａｎｄ β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ＰＣＲ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ％
候选片段 Ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅ ＩＴＳ ＥＦ⁃１α ｍｔＳＳＵ β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ
ＰＣＲ扩增成功率 ＰＣＲ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ １００􀆰 ０（５７ ／ ５７） １００􀆰 ０（５７ ／ ５７） ８９􀆰 ５（５１ ／ ５７） ８７􀆰 ７（５０ ／ ５７）
测序成功率 Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ １００􀆰 ０（５７ ／ ５７） ９８􀆰 ２（５６ ／ ５７） ９０􀆰 ２（４６ ／ ５１） ８８􀆰 ０（４４ ／ ５０）
ＰＣＲ扩增与测序成功率 ＰＣＲ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ １００􀆰 ０ ９８􀆰 ２ ８０􀆰 ７ ７７􀆰 ２
　 　 表中括号内数据分别代表扩增和测序成功的菌株、总的供试菌株。 Ｄａｔａ ｉｎ ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ａｍｐｌｉｆｉ⁃
ｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ．
２􀆰 ２ 镰刀菌种内与种间遗传距离频率分布
镰刀菌 ４ 个基因均表现出种内与种间遗传距离
的重叠，没有出现明显的条形码间隙。 ＩＴＳ 基因种
内与种间遗传距离分别为 ０ ～ ０􀆰 ０５ 和 ０􀆰 ０１ ～ ０􀆰 １３，
ｍｔＳＳＵ基因种内与种间遗传距离分别为 ０ ～ ０􀆰 ０２ 和
０ ～ ０􀆰 ０５６，β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ 基因种内与种间遗传距离分别
为 ０ ～ ０􀆰 ０４ 和 ０􀆰 ０２ ～ ０􀆰 ２１，ＥＦ⁃１α 基因种内与种间
遗传距离分别为 ０ ～ ０􀆰 ０３ 和 ０􀆰 ０３ ～ ０􀆰 ３０ （图 １）。
ＥＦ⁃１α基因存在种内与种间遗传距离部分重叠，但
优于其它 ３ 个基因，除木贼镰刀菌种内遗传距离为
０􀆰 ０２９，大于禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌种间遗传距离
０􀆰 ０２１，同时与锐顶镰刀菌和燕麦镰刀菌种间遗传距
离 ０􀆰 ０３ 相近外，其它镰刀菌种间差异明显大于种内
差异，较其它基因能更好地区分镰刀菌。
２􀆰 ３ 基于 ＥＦ⁃１α基因构建系统发育树
测序所得结果在 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中进行
ＢＬＡＳＴ同源性比对表明，各样品与数据库中属、种
的相似度在 ９８％以上。 基于 ＥＦ⁃１α 基因构建的系
统发育树中，不同的种均位于不同的分支末端，同一
个种的菌株都不同程度地聚在一起，鉴定能力较好。
锐顶镰刀菌、燕麦镰刀菌与三线镰刀菌复合种聚在
一个较大分支上，尖孢镰刀菌与拟轮枝镰刀菌、禾谷
镰刀菌与黄色镰刀菌、变红镰刀菌与木贼镰刀菌同
样两两聚在一个较大分支，并且支持率均达到
９９％ ，说明其两两之间亲缘关系较近（图 ２）。
２􀆰 ４ ＥＦ⁃１α基因对镰刀菌属鉴定能力的验证
对 ＥＦ⁃１α基因鉴定能力的验证结果表明，芹菜
枯萎病菌、禾谷镰刀菌和木贼镰刀菌条带明亮单一，
片段大小在 ７５０ ｂｐ 左右，枝状枝孢菌、黄瓜黑星病
菌、山葵墨入病菌、短小茎点霉、大豆北方茎溃疡病
菌和大豆拟茎点霉种腐病菌均未能扩增出条带（图
３）。 表明 ＥＦ⁃１α 基因不能扩增出非镰刀菌属的病
原真菌，而对镰刀菌的扩增效果较好。
３ 讨论
为了实现物种快速、准确鉴定，ＤＮＡ 条形码必
须满足几个重要指标，即有较高的 ＰＣＲ扩增与测序
成功率，以及较好的种内与种间遗传距离频率分布
（ ＣＢＯＬ Ｐｌａｎｔ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ， ２００９； Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ，
２０１１）。 本研究结果中，ＥＦ⁃１α基因片段具备了较高
的 ＰＣＲ扩增与测序成功率 ９８􀆰 ２％ ，仅低于 ＩＴＳ 基因
片段的 １００􀆰 ０％ ，但是相较于其它 ３ 个基因，种内与
种间遗传距离重叠部分较少，除木贼镰刀菌种内遗
传距离大于黄色镰刀菌和禾谷镰刀菌种间遗传距离
外，其余镰刀菌种间差异明显大于种内差异，能将镰
刀菌更好地区分开；ｍｔＳＳＵ 基因 ＰＣＲ 扩增与测序成
功率在 ４ 个候选基因中较低，为 ８０􀆰 ７％ ，且不能鉴
定出黄色镰刀菌和砖红镰刀菌；β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ 基因 ＰＣＲ
扩增与测序成功率最低，为 ７７􀆰 ２％ ，对尖孢镰刀菌
的扩增和测序尤为不易，仅成功获得少数菌株的序
列。 因此选择ＥＦ⁃１α基因片段进行系统发育树构建
和系统发育关系分析。
本研究中，基于 ＥＦ⁃１α 片段构建的系统发育
树，相同种聚集在同一分支，不同种划分在不同分
支，鉴别能力较好，并且支持率多数达到 ９５％以上；
同时对 ＥＦ⁃１α基因检测鉴定能力的验证结果表明，
其对镰刀菌属的 ＰＣＲ扩增效果很好，而不能对枝状
枝孢菌、黄瓜黑星病菌、山葵墨入病菌、短小茎点霉、
大豆北方茎溃疡病菌和大豆拟茎点霉种腐病菌进行
扩增，在 ４ 个候选基因中，ＥＦ⁃１α基因较其它候选片
段更适宜作为镰刀菌属 ＤＮＡ 条形码。 但是，基于
ＥＦ⁃１α构建的系统发育树显示，包括锐顶镰刀菌、燕
麦镰刀菌与三线镰刀菌复合种在内， ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α、
ｍｔＳＳＵ和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ 基因对木贼镰刀菌和变红镰刀
菌、禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌之间的鉴定效果不佳，
可能会影响鉴定结果。 这与 Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ． （２０１１）
　 　 　
７４５４ 期 雷娅红等： 基于 ＤＮＡ条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定
图 １ 候选基因 ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α、ｍｔＳＳＵ和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ遗传距离的频率分布比较
Ｆｉｇ． １ Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ ＩＴＳ， ＥＦ⁃１α， ｍｔＳＳＵ ａｎｄ β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ
　
基于 ＥＦ⁃１α和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ构建的系统发育树中，木贼
镰刀菌和变红镰刀菌以及禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌
两两聚在一起，不能很好地区分开的结果一致。 可
能原因为木贼镰刀菌和变红镰刀菌、禾谷镰刀菌和
黄色镰刀菌两两之间亲缘关系较近，需进一步筛选
其它基因鉴定或尝试多基因联合鉴定。
ＥＦ⁃１α基因在镰刀菌系统发育学鉴定中具有很
好的应用前景，其在镰刀菌的系统发育和进化水平
上具有丰富的信息量，并且在该属的真菌内，未发现
该序列的非直系同源拷贝（柳凤等，２０１２），很多学
者已将此基因位点用于镰刀菌的鉴定（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ
ａｌ． ，２００５；Ｒａｈｊｏｏ ｅｔ ａｌ． ，２００８；卢维宏等，２０１１）。 ＩＴＳ
序列因其片段较短、物种间变异性强易扩增测序等
优点被广泛用于真菌的分类研究，并在 ２０１１ 年国际
真菌 ＤＮＡ条形码工作会议上确定 ＩＴＳ 为真菌的通
用条形码，但通过很多学者对镰刀菌属鉴定基因的
筛选，认为 ＩＴＳ并不是最优的选择，可能会导致不正
确的鉴定（柳凤等，２０１２）。 在已有的关于镰刀菌分
８４５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
图 ２ 基于 ＥＦ⁃１α基因序列构建的 ５６ 株镰刀菌属菌株的系统发育树
Ｆｉｇ． ２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ５６ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＥＦ⁃１α ｇｅｎｅ
括号中为中国检疫性有害生物数据库中真菌序列编号。 Ｎｏ． ｉｎ ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ ａｒｅ ｆｕｎｇｉ Ｎｏ． ｉｎ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅ ａｐｐｒａｉｓａｌ ｓｙｓ⁃
ｔｅｍ ｏｎ Ｃｈｉｎａ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅｓ ｐｅｓｔｓ．
　
类鉴定的报道中，ｍｔＳＳＵ 基因对于大多数镰刀菌的
鉴定能力有限，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１１）通过研究多条序
列对镰刀菌属的鉴定能力，得出 ＥＦ⁃１α 和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ
基因比 ｍｔＳＳＵ基因更有利于镰刀菌的分类鉴定，这
与本研究结果类似。 对于某些镰刀菌，ｍｔＳＳＵ 基因
也有其优势，如能成功鉴定引起香蕉枯萎病菌的尖
孢镰刀菌古巴专化型（郑荔等，２０１２），ＩＴＳ 和 β⁃ｔｕｂｕ⁃
ｌｉｎ基因则不能较好地区分香蕉枯萎病菌的不同生
理小种（曾莉莎等，２０１４），β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ基因在镰刀菌属
的鉴定中被广泛使用，如郭成等（２０１１）利用 β⁃ｔｕｂｕ⁃
９４５４ 期 雷娅红等： 基于 ＤＮＡ条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定
图 ３ ＥＦ⁃１α基因对 ６ 种非镰刀菌属病原菌
的凝胶电泳检测结果
Ｆｉｇ． ３ Ｔｈｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｍａｇｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｓｉｘ
ｎｏｎ⁃Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｏｆ ＥＦ⁃１α ｇｅｎｅ
Ｍ： ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ； １ ～ １０： 依次为空白对照、芹菜
枯萎病菌、禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌、枝状枝孢菌、黄瓜
黑星病菌、山葵墨入病菌、短小茎点霉、大豆北方茎溃疡
病菌和大豆拟茎点霉种腐病菌。 Ｍ： ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ； １ －
１０： ＣＫ， Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ａｐｉｉ， Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ， Ｆ．
ｅｑｕｉｓｅｔｉ， Ｃ． ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ， Ｃ． ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ， Ｐ． ｗａｓａｂｉ⁃
ａｅ， Ｐ． ｅｘｉｇｕａ， Ｄ． ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ， ａｎｄ Ｄ． ｌｏｎｇｉｃｏｌｌａ， ｒｅｓｐｅｃ⁃
ｔｉｖｅｌｙ．
　
ｌｉｎ基因成功鉴定了三线镰刀菌。
近年来，很多研究学者利用 ＤＮＡ条形码技术对
镰刀菌分类系统发育展开研究，探索适合镰刀菌的
基因片段，镰刀菌属种类繁多，寄主广泛，形态复杂，
包括很多复合种和亲缘关系较近的种，已有的单一
片段很难对其准确鉴定，在以后的工作中，还需补充
镰刀菌菌源进一步验证 ＥＦ⁃１α 基因的鉴定能力或
寻找新的基因片段以及多基因联合鉴定，如 Ｍｉｒｅｔｅ
ｅｔ ａｌ． （２００４）利用 ＩＧＳ 和 ＥＦ⁃１α 基因联合分析并成
功鉴定出分离自香蕉的拟轮枝镰刀菌；Ｙｌｉ⁃Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ
ａｌ． （２００２）利用 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ、ＩＴＳ 和 ＩＧＳ 基因联合分析
将分离自不同寄主的燕麦镰刀菌、锐顶镰刀菌和三
线镰刀菌复合种区分开。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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（责任编辑：李美娟）
１５５４ 期 雷娅红等： 基于 ＤＮＡ条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定