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Characteristics of antibacterial substance produced by the yeast strain 0732-1

酵母菌0732-1产生的抑细菌物质特性研究



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  45(1): 106 ̄109(2015)
收稿日期: 2014 ̄02 ̄25ꎻ 修回日期: 2014 ̄10 ̄05
基金项目: 国家青年科学基金项目 (31000874)ꎻ国家公益性行业 (农业)专项( 201003066)ꎻ石河子大学高层次人才科研启动项目
(RCZX200906)
通讯作者: 李国庆ꎬ教授ꎬ主要研究方向为植物病害生物防治ꎻ Email:guoqingli@mail.hzau.edu.cnꎮ
doi:10.13926 / j.cnki.apps.2015.01.017
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研究简报
酵母菌 0732 ̄1产生的抑细菌物质特性研究
王晓东1ꎬ 王春娟1ꎬ 毛晓英1ꎬ 张 建1ꎬ 李国庆2∗
(1 石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室ꎬ石河子大学农学院ꎬ石河子 832000ꎻ 2农业微生物国家重点实验室ꎬ华中农业大学ꎬ武汉 430070)
Characteristics of antibacterial substance produced by the yeast strain 0732 ̄1
WANG Xiao ̄dong1ꎬ WANG Chun ̄juan1ꎬ MAO Xiao ̄ying1ꎬ ZHANG Jian1ꎬ LI Guo ̄qing2   ( 1 Key Laboratory
of Oasis Agricultural Disease and Pest Management in Xinjiangꎬ College of Agronomyꎬ Shihezi Universityꎬ Shihezi 832000ꎬ
Chinaꎻ 2 The State Key Laboratory of Agricultural Microbiologyꎬ Huazhong Agricultural Universityꎬ Wuhan 430070ꎬ China)
Abstract: Bioactive metabolites produced by Pichia anomala 0732 ̄1 displayed significant antibacterial activity
to Acidovorax avenae subsp. citrulli (Aac) which caused bacterial fruit blotch. The antibiotic capacityꎬ antibac ̄
terial activity and stability of crude antagonistic extract of P. anomala 0732 ̄1 were tested and the active sub ̄
stances were isolated. The results showed that the antibacterial material was not sensitive to ultraviolet radiation
and temperatureꎬ and it was stable at pH < 9. The antibacterial material was purified by precipitation with
(NH4)2SO4 (10% ̄100%ꎬ w/ v)ꎬ extraction with benzeneꎬ acetoneꎬ chloroformꎬ phenixinꎬ ethanol and ethyl
acetateꎬ and distillation method. Howeverꎬ it could not be purified by precipitation with (NH4 )2 SO4 or by
extraction with organic solvent. It could be partially distilled out by distillation. In additionꎬ antibacterial substances
produced by P. anomala 0732 ̄1 had significant inhibitory effect against Hami melon seed infested by Aac (bacterial
suspension 1×108 CFU/ mL). When infected seeds were treated with crude antagonistic extract of P. anomala 0732 ̄1
for 120 minꎬ the seeding disease index was 1. 67 during the cotyledon. This study suggested that P. anomala
0732 ̄1 had the potential to be developed as an antagonistic agent for control Hami bacterial fruit blotch.
Key words: yeastꎻ Pichia anomalaꎻ antibacterial substanceꎻ characteristics
文章编号: 0412 ̄0914(2015)01 ̄0106 ̄04
    哈密瓜细菌性果斑病是近年来暴发流行的一
种瓜类病害ꎬ也是我国对内对外检疫性重大植物病
害ꎮ 该病由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax ave ̄
nae subsp. citrulliꎬ Aac)引起ꎬ具有发病快、危害
广、损失重、防治难的特点ꎬ一旦发生往往给瓜产区
造成严重经济损失ꎮ 据报道[1]ꎬ2007 年新疆石河
子市温室栽培的西瓜叶片上曾获得一株对 Aac 有
生防潜质的 Pichia anomala 0732 ̄1ꎬ并发现该菌株
能产生对 Aac具有抗生作用的某类物质(Antibac ̄
terial substancesꎬ ABS)ꎮ 有关 P. anomala 产生的
抑真菌物质(Antifungal substanceꎬ AFS)特性研究
报道[2]较多ꎬ而 ABS 特性的研究尚未见报道ꎮ 本
文对 P. anomala 0732 ̄1 产生的 ABS 理化性质进
行了探究ꎬ以期对拮抗酵母菌生防机制研究及进一
 
  1期 王晓东ꎬ等:酵母菌 0732 ̄1产生的抑细菌物质特性研究
步开展该酵母菌的开发应用提供参考ꎮ
1  材料与方法
1.1  供试材料
    马铃薯蔗糖培养液 ( Potato sucrose brothꎬ
PSB)和金氏培养基 B(King’ s medium Bꎬ KBA)
参照文献[3]制备ꎮ 供试 Aac 菌株 XJ05 ̄1从新疆
第六师 103团 6 连哈密瓜病叶上分离获得ꎮ 哈密
瓜品种 86 ̄1购于石河子市种子市场ꎮ 瓜种经 2%
次氯酸钠消毒 15 min 后浸入 1×108 CFU / mL Aac
菌悬液中ꎬ20 min后滤出晾干备用ꎮ
1.2  ABS粗提液的制备
    将新鲜的 P. anomala 0732 ̄1按 0.1%(v / v)接
种量接入含 100 mL PSB 培养液的三角瓶 ( 250
mL)中ꎬ28℃ꎬ160 r / min 振荡培养 60 hꎬ发酵液离
心(4℃ꎬ12 000 r / min)15 min 后ꎬ取上清液经 0.45
μm微孔滤膜过滤后得到 ABS粗提液(pH 3.7)ꎮ
1.3  ABS粗提液对带菌哈密瓜种子处理的影响
    将 30粒带菌瓜种放入 ABS 粗提液中ꎬ分别浸
泡 10、30、60、90 和 120 minꎬ滤出种子晾干后ꎬ播种
于装有无菌土的花盆中ꎬ每盆 10 粒种子ꎬ每处理 3
盆ꎮ 灌水后置温室(室温[(31±1)℃ꎬ湿度>80%]培
育ꎮ 以清水浸泡 10 min的瓜种为阴性对照(CK1)ꎬ
以消毒种子为阳性对照(CK2)ꎮ 出苗 6 d 后观察子
叶发病情况ꎬ计算瓜苗的发病率和病情指数ꎮ 病情
分级标准:0级ꎬ子叶无病斑ꎬ健康植株ꎻ1级ꎬ子叶病
斑面积占整片叶面积 < 15%ꎻ2级ꎬ子叶病斑面积占
整片叶面积的 16% ~50%ꎻ3 级ꎬ子叶病斑面积占整
片叶面积的 51% ~80%ꎻ4 级ꎬ子叶病斑面积占整片
叶面积 > 80%ꎬ萎蔫或死亡植株ꎮ
1.4  P. anomala 0732 ̄1抑细菌物质的理化性质测定
1.4.1  热稳定性  取 5 mL ABS 粗提液注入试管
中ꎬ分别在 25℃、37℃、45℃、60℃、70℃、80℃、100℃
下水浴 30 minꎮ 另设一支试管于 121℃下灭菌 30
minꎬ再设一支-20℃放置 2 h 后融化备用ꎮ 生物活
性测定采用琼胶孔扩散抑菌圈法进行ꎮ 将 200 μL
1×108 CFU / mL Aac菌悬液均匀涂布于 KBA平板上
(约 25 mL /皿ꎬ直径 9 cm)ꎬ表面晾干后ꎬ用无菌打
孔器(孔径 7 mm)均匀打孔 6个 /皿ꎬ取 100 μL处理
后的 ABS粗提液注入孔中ꎬ其中 3个孔注入 PSB作
对照ꎮ 28℃培养 48 h 后观察ꎬ采用十字交叉法测量
并记录抑菌圈直径ꎮ 试验重复 3次ꎮ
1.4.2  紫外线照射稳定性  将 10 mL ABS粗提液
置于 30 W 紫外线灯(上海泽仕光电科技有限公
司ꎬHNS G13欧司朗)下方 20 cm处ꎬ分别照射 10、
20、40、60、90和 120 min后ꎬ测定 ABS粗提液的抑
细菌活性(方法同 1.4.1)ꎮ 以未处理的粗提液为对
照ꎮ 试验重复 3次ꎮ
1.4.3  环境 pH值对 ABS 抑细菌活性的影响  用
HCl溶液(5%ꎬ v / v)和NaOH溶液(5 mol / L)将KBA
的 pH值分别调节至 3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0 和
9.0ꎮ 抑细菌活性测定方法同 1.4.1ꎮ 试验重复 3次ꎮ
1.5  P. anomala 0732 ̄1产生 ABS的初步提取
1.5.1  硫酸铵沉淀法  取 20 mL ABS粗提液装入
三角瓶中ꎬ在冰浴条件下缓慢添加硫酸铵ꎬ使其饱
和度分别达到 10%、20%、30%、40%、50%、60%、
70%、80%、90%和 100%ꎮ 4℃下静置 16 h后ꎬ离心
15 min(4℃ꎬ12 000 r / min)ꎬ收集上清液 A 和沉淀
Bꎮ 用 l mL磷酸盐缓冲液(0.1 mol / mLꎬ pH 6.6)
溶解 Bꎬ经 0.45 μm微孔滤膜过滤后ꎬ透析过夜ꎬ收
集透析袋中物质 Cꎬ分别测定组分 A 和 C 的抑细
菌活性ꎮ 取不同浓度的硫酸铵溶液、磷酸缓冲液和
无菌水作空白对照ꎮ 试验重复 3次ꎮ
1.5.2  蒸馏法  取 100 mL ABS 粗提液装入蒸馏
瓶中ꎬ加热后收集蒸馏液ꎬ分别将瓶中的残液、蒸馏
液和粗提液进行抑细菌活性测定(方法同 1.4.1)ꎮ
试验重复 3次ꎮ
1.5.3  有机溶剂萃取法  取 50 mL ABS粗提液分
别与等体积的无水乙醇、丙酮、苯、乙酸乙酯、氯仿、
四氯化碳充分混匀ꎬ室温静置 16 h 后ꎬ将无水乙
醇、丙酮萃取液经 8 000 r / min 离心后ꎬ倾出上清
液ꎬ收集沉淀ꎮ 向沉淀物中加入 5 mL 无菌水混匀
备用ꎮ 苯、乙酸乙酯、氯仿和四氯化碳萃取液分层
后分别收集水相和有机相ꎮ 将有机相部分与上清
液在 100℃水浴下蒸干ꎬ然后加入无菌水溶解至
5 mL备用ꎮ 水相部分加热浓缩至 5 mLꎮ 检测各
萃取部分的抑菌活性(方法同 1.4.1)ꎮ 试验重复
3次ꎮ以 ABS粗提液为对照ꎮ
1.6  数据分析与统计
    采用 SAS.8.0软件中的方差分析程序(ANOVA)
701
 
植物病理学报 45卷
Table 1  Effect of seed treatments with antibacterial substances of Pichia anomala 0732 ̄1
on seedling blight of Hami melon caused by Acidovorax avenae subsp. citrulli
Treatment / min Disease incidence / % Disease index Biocontrol efficacy / %
CK1 100.0 ± 0.00 87.9 ± 11.27 a  ̄
10 91.7 ± 9.43 75.7 ± 2.89 a 13.88
30 66.7 ± 11.72 40.5 ± 7.78 b 53.92
60 42.9 ± 12.98 18.1 ± 5.99 bc 79.41
90 15.1 ± 29.34   8.9 ± 18.33 c 89.87
120 6.7 ± 7.59   1.7 ± 19.67 c 98.07
CK2 14.3 ± 11.66 3.6 ± 3.57 c 95.90
 
分析上述各试验处理间的差异显著性ꎮ 比较各处理
间的差异采用 Duncan’s新复极差法(P= 0.05)ꎮ
2  结果与分析
2.1  ABS粗提液对带菌哈密瓜种子处理的影响
    由表 1可得ꎬ带菌哈密瓜种子经 ABS 粗提液
处理 60、90和 120 minꎬ与阳性对照间瓜苗的病情
指数差异显著ꎮ 处理 120 minꎬ瓜苗的发病率和病
情指数分别为 6.7%和 1.7ꎬ防效为 98.07%ꎮ 由此
表明ꎬ利用 ABS处理带菌种子 60 min 以上具有显
著防病的作用ꎮ
2.2  P. anomala 0732 ̄1 ABS粗提液特性
    ABS粗提液经不同温度和不同紫外线照射时
间处理后ꎬ抑菌圈直径与对照无显著差异(图 1 ̄A、
图 1 ̄B)ꎮ 培养基 pH为 5.0~9.0时ꎬABS抑菌活性
随着培养基 pH 值的升高而显著下降ꎮ 当 pH 为
5.0时ꎬ抑菌圈最大ꎬ直径达 27.0 mm(图 1 ̄C)ꎮ 由
此表明 ABS 对温度和紫外线具有较广泛的适应
性ꎬ偏酸性环境利于 ABS抑细菌活性的稳定ꎮ
2.3  P. anomala 0732 ̄1 ABS的初提取
    ABS 粗提液经硫酸铵沉淀后ꎬ透析物无抑菌
活性ꎬ上清液抑菌活性稳定ꎬ抑菌圈直径差异不显
著ꎬ大小为(13.8 ~ 14.2)mmꎮ 蒸馏法提取时ꎬ蒸馏
残液的抑菌活性最强ꎬ抑菌圈直径达 33.0 mmꎬ蒸
馏物和 ABS粗提液抑菌圈直径差异不显著ꎮ 非极
性萃取剂苯、四氯化碳、氯仿和乙酸乙酯有机相中均
无抑菌活性ꎬ而水相中具有较高的抑菌活性ꎮ 极性
萃取剂无水乙醇和丙酮水相中具有抑菌活性ꎬ沉淀
无抑 Aac 作用ꎮ 结果表明 P. anomala 0732 ̄1产生
的 ABS是含有多种不同蒸馏沸点的混合物ꎬ且对有
机溶剂具有较好的稳定性ꎬ属于一类极性较强、易溶
于水的酸性非蛋白类物质(经乙酸铅处理有沉淀产
生)ꎮ 利用 3种提取方法均不能将其分离出来ꎮ
3  讨论
    关于 P. anomala拮抗有害真菌及其机制研究
国内外均有报道ꎬIzgü 等[4]研究表明 Pichia ano ̄
mala NCYC434 能产生分子量 49 kDa 的嗜杀蛋
白—外源 β ̄1ꎬ3 ̄葡聚糖酶ꎬ对苹果灰霉病和酿酒污
染酵母菌具有显著拮抗作用ꎬ且 pH 为 3.0 ~ 5.5 之
间ꎬ温度 37℃以下拮抗活性稳定ꎮ Pichia anomala
WC65产生的嗜杀蛋白在 pH 为 2.0 ~ 5.0 之间ꎬ可
对假丝酵母菌有稳定致死作用ꎬ与本文P. anomala
0732 ̄1所产生的 ABS在偏酸性环境下保持抑细菌
活性稳定相一致ꎮ 不同的是 AFS 为嗜杀蛋白ꎬ而
ABS是一类极性较强、易溶于水ꎬ121℃处理仍保
持良好抑菌活性的酸性非蛋白类物质ꎮ
    利用生防菌产酸性 ABS防治细菌病害国外已
有报道ꎬPusey等[5]发现 Pantoea agglomerans能有
效防治梨、苹果树火疫病菌 Erwinia amylovoraꎬ同
时发现在苹果品种“Gala”花期接种 P. agglome ̄
rans E325所产生的酸性 ABS 能降低花朵柱头微
生境中的 pHꎬ这种酸化作用能显著抑制 E. amylo ̄
vora生长ꎮ 本文利用酵母菌 0732 ̄1所产生的酸性
ABSꎬ处理带菌种子 60 min 以上能有效防治哈密
瓜果斑病ꎮ 推测 P. anomala产酸性 ABS可能是防
治瓜类细菌性果斑病菌的生防机理之一ꎮ 这将丰
富 P. anomala 生防应用范围的认识ꎬ有助于全面
了解 P. anomala生防机制ꎮ ABS具体成分及其生
防机理还有待于进一步研究ꎮ
801
 
  1期     2015年«植物病理学报»稿约
Fig. 1  Effect of different treatments on antibacterial substances produced by Pichia anomala 0732 ̄1
参考文献
[1]   Wang X Dꎬ Li G Qꎬ Jiang D Hꎬ et al. Screening of
plant epiphytic yeasts for biocontrol of bacterial fruit
blotch ( Acidovorax avenae subsp. citrulli) of hami
melon [J] . Biological Controlꎬ 2009ꎬ 2:164-171.
[2]   Melin Pꎬ Häkansson Sꎬ Schnürer J. Optimisation and
comparison of liquid and dry formulations of the
biocontrol yeast Pichia anomala J121 [ J ] . Appl.
Microbiol. Biotechnol.ꎬ 2007ꎬ 73:1008-1016.
[3]   Fang Z D. Plant disease research methods (Third Edi ̄
tion) ( in Chinese) [M] . Beijing: China Agriculture
Scientech Press (北京: 中国农业科技出版社)ꎬ 1998.
[4]   Izgü Fꎬ Altınbay Dꎬ Sertkaya A. Enzymic activity of the
K5 ̄type yeast killer toxin and its characterization [ J].
Biosci. Biotechnol. Biochem.ꎬ 2005ꎬ 69:2200-2206.
[5]   Pusey P Lꎬ Stockwell V Oꎬ Rudell D R. Antibiosis
and acidification by Pantoea agglomerans strain E325
may contribute to suppression of Erwinia amylovora
[J] . Phytopathol.ꎬ 2008ꎬ 98:1136-1143.
责任编辑:于金枝
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