全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(３): ２８０￣２８７(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０１￣２１ꎻ 修回日期: ２０１４￣１２￣２０
基金项目: 农业部现代农业产业技术体系建设专项资金(ＣＡＲＳ￣２８)ꎻ国家科技支撑计划项目(２０１３ＢＡＤ０２Ｂ０１)ꎻ国家自然科学基金项目
(３０９００９６８ꎻ ３１２０１６０２)
通讯作者: 康国栋ꎬ副研究员ꎬ主要研究方向为苹果育种ꎻＴｅｌ:０４２９￣３５９８１２１ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｋｇｄｃａａｓ＠１６３.ｃｏｍ
丛佩华ꎬ研究员ꎬ主要研究方向为苹果育种ꎻＴｅｌ:０４２９￣３５９８１０３ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｃｏｎｇｐｈ＠１６３.ｃｏｍ
第一作者: 张彩霞ꎬ女ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ研究方向为苹果分子育种ꎻＴｅｌ:０４２９￣３５９８１３５ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｃｘｚｈａｎｇ￣ｂｊ＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０３.００７
苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学分析
张彩霞１ꎬ ２ꎬ 田 义１ꎬ ２ꎬ 张利义１ꎬ ２ꎬ 肖 龙１ꎬ ２ꎬ 康国栋１ꎬ ２∗ꎬ 丛佩华１ꎬ ２∗
( １农业部园艺作物种质资源利用重点实验室ꎬ兴城 １２５１００ꎻ ２中国农业科学院果树研究所ꎬ兴城 １２５１００)
摘要:蛋白质提取方法是双向电泳分析的关键ꎮ 本研究中ꎬ我们通过优化提取条件ꎬ建立了适于苹果枝条表皮总蛋白提取
的技术体系ꎮ 在此基础上ꎬ开展了苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学研究ꎬ以期明确轮纹病菌胁迫下苹果枝条
表皮细胞参与抗病反应的关键蛋白ꎮ 具体方法是以未接菌及接菌后的苹果枝条表皮为材料ꎬ分别提取总蛋白ꎬ利用双向凝
胶电泳技术结合质谱(ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＴＯＦ / ＭＳ)检测分析差异表达蛋白ꎮ 经质谱检测及数据库检索ꎬ共有 ２２ 个蛋白点得到
成功鉴定ꎬ按照功能划分为光合作用相关、糖类及能量代谢相关、防御反应相关、蛋白质合成相关及未知功能蛋白等 ５ 类ꎮ
其中参与防御反应的病程相关蛋白(ＡＰＸ、 β￣１ꎬ３￣葡聚糖酶、Ｍａｌ ｄ１、ＰＲ￣１)可能是苹果枝条表皮细胞应答轮纹病菌胁迫过
程中参与抗病反应的关键蛋白ꎮ
关键词:苹果枝条表皮ꎻ 总蛋白ꎻ 轮纹病菌ꎻ 胁迫ꎻ 差异蛋白质组ꎻ 质谱
Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｒｋ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎ￣
ｃｈｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ ＺＨＡＮＧ Ｃａｉ￣ｘｉａ１ꎬ２ꎬ ＴＩＡＮ Ｙｉ１ꎬ２ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｌｉ￣ｙｉ１ꎬ２ꎬ
ＸＩＡＯ Ｌｏｎｇ１ꎬ２ꎬ ＫＡＮＧ Ｇｕｏ￣ｄｏｎｇ１ꎬ２ꎬ ＣＯＮＧ Ｐｅｉ￣ｈｕａ１ꎬ２ ( １ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｒｏｐｓ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｘｉｎｇｃｈｅｎｇ １２５１００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｏｍｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｘｉｎｇｃｈｅｎｇ １２５１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｂｙ ｔｗｏ￣ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ (２￣ＤＥ) . Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ
ｔｈｅ ｂａｒｋ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓꎬ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ２￣ＤＥ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ. Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｋｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａꎬｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ
ｆｒｏｍ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｒａｎｃｈｅｓꎬ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｗｏ￣ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ. Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＴＯＦ / ＭＳ. Ｉｎ ｔｏｔａｌꎬ ２５ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ. Ａｆｔｅｒ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎꎬ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＴＯＦ / ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄａｔａｂａｓｅ
ｓｅａｒｃｈｉｎｇꎬ ２２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｗｅｒｅ ｆｉｎａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ. Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ２２ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ
ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬ ｇｌｕｃｏｓｅ / ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍꎬ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓꎬ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｕｎｋｎｏｗｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ.
Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ (ＡＰＸꎬ β￣１ꎬ３￣ｇｌｕｃａｎａｓｅꎬ Ｍａｌ ｄ１ ａｎｄ ＰＲ￣１) ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｍａｙ ｐｌａｙ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｂ. ｄｏｔｈｉｄｅａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｂａｒｋ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓꎻ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａꎻ ｓｔｒｅｓｓꎻ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓꎻ
ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
中图分类号: Ｓ４３６.６１１.１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０３￣０２８０￣０８
３期 张彩霞ꎬ等:苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学分析
苹果轮纹病又称瘤皮病、疣状粗皮病ꎬ是由轮
纹病菌(Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ)侵染枝干、果实
引起的真菌性病害ꎬ也是我国目前苹果主产区危害
最严重、发生最普遍的三大病害之一ꎮ 迄今为止ꎬ
尚未发现对 Ｂ. ｄｏｔｈｉｄｅａ完全免疫的栽培品种[１ꎬ ２]ꎮ
近年来ꎬ以提高树体自身抗性为目标的抗性育种研
究日益受到重视[３ꎬ ４]ꎮ 苹果是多年生木本植物ꎬ童
期长、遗传背景高度杂合ꎬ依靠常规育种很难在短
期内培育出高抗优质新种质ꎮ 分子生物学理论和
技术的日臻完善使挖掘苹果抗病相关调控基因或
蛋白、阐明其调控机制ꎬ从而利用基因工程手段加
快苹果抗病遗传改良的育种进程成为现实ꎮ 病原
菌是诱发寄主植物发病的主要生物胁迫因子ꎮ 以
往关于模式植物抗病分子机制研究表明ꎬ植物受病
原菌胁迫时ꎬ体内先天免疫受体(即抗病蛋白)会
识别病原菌效应因子ꎬ引发寄主抗病反应ꎬ实现对
病原菌胁迫信号的响应、传递以及生物学防
御[４~７]ꎮ ２０１０ 年ꎬ苹果栽培品种 “金冠” (Ｇｏｌｄｅｎ
Ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ)全基因组草图的公布[８]ꎬ其测序结果所
产生的海量数据ꎬ为应用蛋白质组学相关技术开展
苹果属植物抗病相关蛋白的筛选研究提供了理论
依据和参考ꎮ
目前ꎬ国内外关于苹果轮纹病的研究主要集中
于防治方法、病原菌鉴定、种质资源抗性评价等方
面[１ꎬ ２ꎬ ９~１４]ꎮ 有关苹果响应 Ｂ. ｄｏｔｈｉｄｅａ 胁迫的应
答机制研究报道较少ꎬ而利用蛋白质组学技术开展
果树寄主响应 Ｂ. ｄｏｔｈｉｄｅａ 胁迫抗性蛋白的研究尚
未见报道ꎮ
开展苹果响应轮纹病菌胁迫的差异蛋白质组
研究ꎬ通过对抗性相关蛋白的差异表达分析ꎬ可从
分子水平直接了解苹果属植物应答轮纹病菌胁迫
所启动的抗性机制ꎮ 本研究以苹果枝条与 Ｂ. ｄｏ￣
ｔｈｉｄｅａ为研究对象ꎬ利用差异蛋白质组学方法ꎬ分
析轮纹病菌侵染后及未受侵染苹果枝条表皮的蛋
白组变化ꎬ以揭示苹果寄主应答轮纹病菌胁迫的蛋
白质组表达差异ꎬ为优质抗病苹果新种质的遗传改
良研究提供部分理论依据和借鉴ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 苹果试材及病原菌接种
轮纹病菌(Ｂ. ｄｏｔｈｉｄｅａ)接种试验在国家苹果
育种中心资源圃内进行ꎬ以 ８ 年生杂交组合(“嘎
啦”ד华富”)Ｆ１代杂种实生苗为研究对象ꎬ选择 ３
个抗病株系的当年生枝条进行接种试验ꎮ 供试轮
纹病菌由中国农业科学院果树研究所植保中心惠
赠ꎬ枝条接种病原菌方法参考 Ｚｈｏｕ 等[１３]略有改
动ꎮ 将活化后病原菌接种于 ＰＤＡ 培养基(Ｐｏｔａｔｏ
Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒꎬ购自 Ｓｉｇｍａ公司ꎬ称取 ３９ ｇ粉末ꎬ定
容至 １ Ｌꎬ调 ｐＨ值至 ６.０~７.０)上ꎬ倒扣于恒温培养
箱中ꎬ２５℃条件下培养至菌落长满整个培养皿ꎮ 用
７５％酒精棉球擦拭枝条进行表面消毒ꎬ取菌落边缘
菌饼(直径 １.０ ｃｍ)ꎬ使菌丝面粘贴在枝条表面ꎬ无
菌封口膜进行包裹ꎬ５ ｄ 后除去封口膜ꎮ 每抗病株
系接种 ８个枝条ꎬ每个枝条接种 ３ 个点ꎬ以贴覆空
白培养基、且封口膜包裹处理的枝条为对照ꎮ 分别
于处理后 ３０ ｄ 取样ꎬ每个植株取 ２ 个枝条ꎮ 处理
及对照培养均设 ３个重复ꎬ整个试验重复 ３次ꎮ
１.２ 苹果枝条表皮总蛋白提取
用无菌湿棉球擦除接种部位残余菌丝ꎬ快速剥
下接种枝条的嫩皮ꎮ 准确称取对照表皮及接种后
表皮各 ５ ｇꎬ于液氮中迅速研磨成粉末ꎮ 总蛋白提
取方法参考 Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ 等[１５]以及 Ｗａｎｇ 等[１６]略有
改进ꎮ 具体过程:将研磨好的粉末样品转入 ５０ ｍＬ
的离心管中ꎬ悬浮于 １０ ｍＬ 酚(Ｔｒｉｓ￣ｂｕｆｆｅｒｅｄꎬｐＨ
８.０ꎬＳｉｇｍａ)和 １０ ｍＬ 的提取液 (２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ
(ｐＨ ７. ５)ꎬ ３００ ｍＭ 蔗糖ꎬ １０ ｍＭ ＥＧＴＡꎬ １ ｍＭ
ＰＭＳＦꎬ１ ｍＭ ＤＴＴꎬ１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００ꎬ１０％ ＰＶＰＰ)
中ꎬ４℃下涡旋振荡 １５ ｍｉｎꎮ ４℃ꎬ５ ０００ ｇꎬ离心 １５
ｍｉｎꎮ 收集上层酚相ꎬ加入 ５ 倍体积 ０.１ Ｍ 甲醇醋
酸铵溶液ꎬ－２０℃沉淀 ２ ｈ 以上ꎮ ４℃ꎬ１５ ０００ ｇꎬ离
心 １０ ｍｉｎꎬ沉淀物经冷丙酮(含 ２０ ｍＭ ＤＴＴ)漂洗
３次ꎬ室温风干ꎬ－８０℃条件下保存备用ꎮ
１.３ 蛋白质样品溶解与定量
将制备好的蛋白干粉溶于样品裂解液(７ Ｍ
尿素ꎬ２ Ｍ 硫脲ꎬ４％ ｗ / ｖ ＣＨＡＰＳꎬ２％ ＩＰＧ ｂｕｆｆｅｒꎬ
１％ ｗ / ｖ ＤＴＴ)ꎬ室温下充分溶解 ６ ｈ 以上ꎬ４℃ꎬ
１５ ０００ ｇꎬ离心 ３０ ｍｉｎꎬ取上清重复离心一次ꎬ上清
液即为蛋白质样品ꎮ 采用双向电泳蛋白定量试剂
盒(２￣Ｄ ＱＵＡＮＴ ＫＩＴꎬＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)对蛋白溶液
样品进行定量ꎮ
１８２
植物病理学报 ４５卷
１.４ 双向电泳
本试验等电聚焦过程采用预制 ＩＰＧ 胶条(１８
ｃｍꎬ ｐＨ ４~７ꎬ 线性ꎬＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)ꎬ取定量后的蛋
白质溶液样品ꎬ每根胶条上样量为 ８００ μｇꎬ上样体积
３５０ μＬꎬＩＰＧ 泡涨盘( ＩＰＧ ｂｏｘꎬＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)室温
下完成被动水化过程ꎬ水化时间 １０ ~ １２ ｈꎮ 水化结
束后立即在等电聚焦仪(Ｅｔｔａｎ ＩＰＧｐｈｏｒ３ꎬＧＥ Ｈｅａｌｔｈ￣
ｃａｒｅ)上进行等电聚焦电泳( ＩＰＧ￣ＩＥＦ)ꎬ升压程序参
考 Ｚｈａｎｇ等[１７]完成ꎮ 等电聚焦过程结束后ꎬ将胶条
分别置于含 １％ ＤＴＴ 和 ２.５％ 碘乙酰胺的平衡液[１７]
中分别平衡 １５ ｍｉｎꎬ 然后再转移至分离胶浓度为
１２.５％、厚度为 １ ｍｍ的 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 胶上端ꎬ在垂直
板电泳槽(Ｅｔｔａｎ ＤＡＬＴｓｉｘꎬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)上进行第
二向电泳[１７]ꎮ 电泳完成后ꎬ取下凝胶ꎬ考马斯亮蓝
Ｒ￣３５０(ＣＢＢ Ｒ￣３５０)染色ꎮ
１.５ 图像扫描及分析
凝胶脱色后立即用 Ｉｍａｇｅ Ｓｃａｎｎｅｒ 扫描仪(ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)进行扫描ꎬ分辨率 ３００ ｄｐｉꎮ 凝胶图像
采用 Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄ Ｐ１ａｔｉｎｕｍ ７.０ 分析软件(ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)进行差异点分析ꎬ选择相对体积增加或
降低≥１. ５ 倍的蛋白点ꎬ运用 ＳＰＳＳ ( ＳＰＳＳ ｉｎｃ.ꎬ
Ｃｈｉｃａｇｏꎬ ＩＬ)统计软件进行 ＡＮＯＶＡ(Ｐ<０.０５)分
析ꎬ具有显著差异的蛋白点被认为是差异蛋白ꎮ
１.６ 差异蛋白点酶解处理及质谱分析
将差异表达蛋白点从凝胶上切下来ꎬ通过胶内
原位酶解方法ꎬ抽提酶解肽段ꎬ再经过 ＺｉｐＴｉｐ 脱
盐、酶解液真空浓缩等完成酶解处理ꎮ 浓缩后的酶
液用 ４８００ 串联飞行时间质谱仪(４８００ Ｐｌｕｓ ＭＡＬＤＩ
ＴＯＦ / ＴＯＦＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ) (Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓꎬＵＳＡ)
进行质谱分析ꎮ 肽质量指纹(ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｆｉｎｇｅｒ￣
ｐｒｉｎｔｉｎｇꎬ ＰＭＦ)扫描范围为 ８００~ ４ ０００ Ｄａꎬ选择信
噪比大于 ５０的母离子进行二级质谱(ＭＳ / ＭＳ)分
析ꎮ 本研究中蛋白点质谱分析 (ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣
ＴＯＦ / ＭＳ)工作由中科院(上海)蛋白质组研究分
析中心来完成ꎮ
１.７ 数据库检索
酶解样品经过质谱检测后得到 ＰＭＦ 图谱数
据ꎬ将这些数据利用 Ｍａｓｃｏｔ 软件(Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｌｔｄ.ꎬ Ｌｏｎｄｏｎꎬ ＵＫ)在 ＮＣＢＩ 数据库中进行检索鉴
定蛋白ꎮ 对于检索的结果ꎬ软件提供一个可信度分
值(ＭＯＷＳＥ ｓｃｏｒｅ)ꎬ当检索到的蛋白分值大于该值
时结果是可信的(在 Ｐ< ０.０５水平显著)ꎮ 当出现多
个大于标准ＭＯＷＳＥ ｓｃｏｒｅ值的结果时候ꎬ选取得分
最大的结果ꎬ同时参考其匹配肽段数 ( ｐｅｐｔｉｄｅｓ
ｃｏｕｎｔ)以及分子量、等电点等参数来加以确定ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 苹果枝条表皮应答轮纹病菌胁迫的双向电泳
图谱分析
为了阐释苹果枝条应答轮纹病菌胁迫的防御
反应机制ꎬ我们利用差异蛋白质组学方法ꎬ对未接
种病原菌及病原菌侵染后苹果枝条表皮总蛋白进
行了分析ꎮ 两组材料的总蛋白分别经双向电泳分
离后ꎬ获得清晰的蛋白质表达谱(图 １)ꎮ 两组凝胶
图谱经 Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄ Ｐ１ａｔｉｎｕｍ ７.０ 软件分析ꎬ
每张图谱上均有 ８００ 个以上可重复清晰蛋白点被
检测到ꎬ蛋白点主要分布在 ｐＨ４~ ７ꎬ分子量为 １０ ~
１００ ｋＤａ的区域内(图 １)ꎮ
通过 Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄ软件计算蛋白点相对丰
度的变化ꎬ可初步获得差异表达的蛋白点ꎮ 两组图
谱差异分析结果显示ꎬ有 ４１ 个蛋白质点发生变化
(相对体积增加或者降低≥１.５ 倍)ꎬ蛋白点再经
ＳＰＳＳ软件分析ꎬ共有 ２５ 个蛋白点通过了显著性
(Ｐ<０.０５)检验(图 １)ꎮ
２.２ 差异蛋白质点质谱分析
将通过检验的 ２５ 个差异蛋白点进行质谱
(ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ / ＴＯＦ ＭＳ)分析ꎬ分别根据各蛋白点
鉴定所得 ＰＭＦ图谱数据ꎬ去除杂峰后ꎬ进入蛋白质
数据库进行匹配检索ꎮ 根据鉴定标准ꎬ除了 ３个蛋
白点(ｓｐｏｔ ２３ꎬ２４和 ２５)未检测成功外ꎬ共有 ２２ 个
差异蛋白点得到成功鉴定(图 １ꎬ表 １)ꎮ 在成功鉴
定的差异蛋白中共包括 １２ 个下调蛋白和 １０ 个上
调蛋白(图 ２)ꎮ 此外ꎬ已鉴定的 ２２ 个蛋白点中除
了 ９个与苹果属植物同源的蛋白外ꎬ其余蛋白均为
与其他植物高度同源的相关蛋白ꎮ
２８２
３期 张彩霞ꎬ等:苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学分析
Ｆｉｇ. １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂａｒｋ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ
ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ
Ａ:Ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｒａｎｃｈｅｓꎻ Ｂ:Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｒａｎｃｈｅｓ( ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｏｒ ３０ ｄ) .
Ｔｈｅ ｓｐｏｔｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｒｅ ｃｉｒｃｌｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｎｅｓ.
Ｆｉｇ. ２ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ ｔｈｅ ｂａｒｋ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ
ＣＫ: Ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｒａｎｃｈｅｓꎻ３０ ｄ:Ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｂ. ｄｏｔｈｉｄｅａ ｆｏｒ ３０ ｄ.
２.３ 蛋白功能鉴定及丰度变化分析
将所鉴定的蛋白点进行数据库检索及相关的
文献查阅ꎬ共获得 ２２个蛋白质点的功能信息ꎬ各蛋
白点丰度变化见图 ２ꎮ 其中 ２ 个蛋白质点鉴定为
未知功能蛋白(ｓｐｏｔ １１和 １２)ꎬ其功能有待于进一
步深入研究ꎬ其余 ２０ 个蛋白质点依据其相关功能
分为 ４类(图 ３)ꎮ 应答轮纹病菌胁迫的差异表达
蛋白点中ꎬ防御反应相关蛋白共包括 ５ 个ꎬ其中推
定的抗坏血酸过氧化物酶(ｓｐｏｔ １３)、β￣１ꎬ３￣葡聚糖
酶(ｓｐｏｔ １９)和致病相关蛋白(ｓｐｏｔ ２２)应答轮纹病
菌胁迫呈明显上调表达ꎬ而鉴定的另一个抗坏血酸
过氧化物酶( ｓｐｏｔ １４)和主要过敏原蛋白 Ｍａｌ ｄ１
(ｓｐｏｔ ２０)则呈现明显下调表达ꎮ 光合作用相关蛋
白(ｓｐｏｔ ３、９ 和 １０)除了 １ꎬ５ 二磷酸核酮糖羧化加
氧酶(ｓｐｏｔ ９)下调表达外ꎬ其他 ２ 个蛋白应答轮纹
病菌胁迫均呈明显上调表达ꎮ 本研究共鉴定获得
１０个糖类及能量代谢相关蛋白ꎬ其中 ４ 个蛋白点
(ｓｐｏｔ ４、１６、２０和 ２１)应答轮纹病菌侵染呈上调表
达ꎬ其余 ６个蛋白点(ｓｐｏｔ ２、５、６、７、８和 １７)均呈现
下调表达ꎮ 此外ꎬ还鉴定得到 ２个参与蛋白质合成
相关的蛋白( ｓｐｏｔ １ 和 １５)ꎬ经轮纹病菌胁迫后ꎬ在
苹果枝条表皮中均呈下调表达ꎮ
３８２
植物病理学报 ４５卷
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４８２
３期 张彩霞ꎬ等:苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学分析
Ｆｉｇ. ３ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
３ 结论与讨论
３.１ 苹果枝条表皮总蛋白提取方法的确立
针对苹果枝条表皮这样低蛋白含量的植物材
料ꎬ确定适宜的蛋白质提取方法对于其后续的双向
电泳分析至关重要ꎮ 酚抽提方法是针对低蛋白含
量植物材料的有效方法[１ ８ ]ꎮ 本研究尝试将已报
道的 ＨＢ￣酚抽提方法[１５ꎬ １６]进行多次摸索及改良ꎬ
最终建立适于苹果枝条表皮总蛋白提取的技术系
统ꎮ 因苹果枝条表皮富含多糖、纤维素等杂质ꎬ影
响了蛋白质样品的提取纯度ꎬ改良的 ＨＢ￣酚抽提方
法在已有基础上ꎬ提高了蔗糖的浓度ꎬ并在匀浆缓
冲液中添加了 １０％ ＰＶＰＰ(聚乙烯聚吡咯烷酮)ꎬ使
得该方法提取的总蛋白损失相对较少ꎬ且纯度较
高ꎬ可确定为苹果枝条表皮总蛋白提取的理想方
法ꎮ
３.２ 光合作用、糖类及能量代谢相关蛋白参与苹
果枝条表皮细胞的防御反应
光合作用是绿色植物最主要的生理功能ꎬ叶绿
体是植物发生光合作用的主要场所ꎬ病原菌的侵染
对寄主植物最明显的影响是破坏其绿色组织ꎬ使寄
主植物正常的光合作用减弱[１９]ꎮ 本研究中共鉴定
得到 ３个光合作用相关蛋白ꎬ其中ꎬＲｕｂｉｓｃｏ是卡尔
文循环中的关键酶ꎬＡｇｒａｗａｌ等[２０]通过研究臭氧胁
迫下水稻叶片蛋白质组变化ꎬ发现其中 ４ 个 Ｒｕｂｉ￣
ｓｃｏ 蛋白发生明显上调表达ꎮ Ｃｈｅｎ 等[２１] 证实
Ｒｕｂｉｓｃｏ可因活性氧的产生而受抑制ꎬ发生下调表
达ꎮ 本研究中鉴定得到 ２ 个为 Ｒｕｂｉｓｃｏ( ｓｐｏｔ ３ 和
９)的蛋白ꎬ表达量分别表现为上调和下调ꎬ可能与
轮纹病菌侵染后苹果枝条表皮细胞内复杂的应答
反应相关ꎮ
鉴定得到 １０ 个糖类及能量代谢相关蛋白ꎬ有
５ 个参与三羧酸循环、磷酸戊糖途径等糖代谢途
径ꎬ除了磷酸核酮糖差向(异构)酶(ｓｐｏｔ１６)上调表
达外ꎬ其余 ４个蛋白(ｓｐｏｔ ２、６、７和 １７)呈现明显下
调表达ꎮ 此外ꎬ鉴定得到的其余 ５个能量代谢相关
蛋白(Ｓｐｏｔ ４、５、８、２０ 和 ２１)也表现出明显的差异
表达ꎮ 表明苹果枝条表皮寄主细胞在应答轮纹病
菌侵染过程中ꎬ可能通过调控糖类及能量代谢反
应ꎬ为完成抗病反应提供物质基础ꎮ
３.３ 防御反应相关蛋白是寄主应答病原菌胁迫的
关键因素
病程相关(ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄꎬＰＲ)蛋白是植
物中存在的一类具有广谱抗性的可溶性蛋白[６ꎬ ７]ꎬ
根据 ＰＲ蛋白的植物来源、氨基酸序列同源性以及
生化功能等ꎬ可将 ＰＲ 蛋白分为 １７ 类ꎬ其中包括:
富含甘氨酸的 ＰＲ 蛋白( ＰＲ￣１)、β￣１ꎬ３￣葡聚糖酶
(ＰＲ￣２)、几丁质酶(ＰＲ￣３)、类甜蛋白 (ＰＲ￣５)、过氧
化物酶类 (ＰＲ￣９)、过敏反应相关的 ＰＲ 蛋白(ＰＲ￣
１０) [２２]等ꎮ 本研究共鉴定了 ５ 个差异表达的 ＰＲ
类蛋白(ｓｐｏｔ １３、１４、１８、１９和 ２２)ꎮ
５８２
植物病理学报 ４５卷
抗坏血酸过氧化物酶(ＡＰＸ)是植物体内 ＡｓＡ￣
ＧＳＨ氧化还原途径的重要组分ꎬ是清除 Ｈ２Ｏ２的关
键酶[２３]ꎬ属于病程相关蛋白 ＰＲ￣９ 家族ꎮ 本研究
中ꎬ２个蛋白点( ｓｐｏｔ １３ 和 １４)均鉴定为抗坏血酸
过氧化物酶ꎬ分别发生了明显的上调和下调表达ꎬ
表明在苹果枝条表皮细胞受轮纹病菌侵染后ꎬ通过
调控 ＲＯＳ浓度ꎬ减轻病原菌对寄主的伤害ꎮ 推测
抗氧化机制也是苹果枝条表皮细胞应答轮纹病菌
胁迫的重要机制ꎮ
苹果过敏原蛋白(Ｍａｌ ｄ１)是苹果体内重要的
抗性相关蛋白ꎬ属病程相关蛋白 ＰＲ￣１０ 家族的一
员ꎬ与植物抗病性密切相关[２４]ꎮ 在本研究中ꎬ苹果
枝条表皮经轮纹病菌侵染后ꎬＭａｌ ｄ１ 蛋白( ｓｐｏｔ
１８)呈明显下调表达ꎬ推测该蛋白也与苹果枝条表
皮应答轮纹病菌侵染的防御反应相关ꎬ通过下调表
达ꎬ降低病原菌对寄主的伤害程度ꎮ
β￣１ꎬ３￣葡聚糖酶是重要的抗病相关蛋白[２５]ꎬ属
ＰＲ￣２家族ꎬ在植物寄主应答病原菌侵染过程中ꎬ植
物寄主通过分泌 β￣１ꎬ３￣葡聚糖酶ꎬ以水解病原真菌
细胞壁ꎬ最终抑制病原菌侵染[２５]ꎮ 本研究鉴定得
到的 β￣１ꎬ３￣葡聚糖酶(ｓｐｏｔ １９)ꎬ应答轮纹病菌侵染
呈明显上调表达ꎬ表明该蛋白参与了苹果枝条表皮
细胞的抗病反应ꎮ
此外ꎬ病程相关蛋白( ｓｐｏｔ ２２)属 ＰＲ￣１ 家族ꎬ
也是植物应答病原菌侵染的关键抗病蛋白[７]ꎬ在
本研究中呈现明显的上调表达ꎬ推测其在苹果枝条
表皮细胞应答轮纹病菌胁迫反应中也发挥了重要
的作用ꎮ
３.４ 可能与轮纹病菌胁迫应答相关的其他蛋白
在已鉴定的差异表达蛋白中ꎬ蛋白质合成代谢
相关及未知功能蛋白均为 ２ 个(图 ３)ꎬ其中ꎬ轮纹
病菌侵染后ꎬ蛋白质合成代谢相关蛋白( ｓｐｏｔ １ 和
１５)均呈现明显下调表达ꎬ而其他 ２ 个未知功能蛋
白(ｓｐｏｔ １１ 和 １２)也发生了明显的差异表达ꎬ推测
这些蛋白也参与了苹果枝条表皮细胞应答轮纹病
菌侵染的防御机制ꎮ 关于这些蛋白的具体功能分
析有待于进一步深入研究ꎮ
综上所述ꎬ苹果枝条表皮细胞应答轮纹病菌胁
迫过程中ꎬ可以通过启动多个途径来实现对病原菌
胁迫的防御ꎬ包括光合作用、糖类及能量代谢、防御
反应等相关蛋白的差异表达ꎮ 推测其中的防御反
应相关的 ＰＲ 类蛋白(ＡＰＸ、β￣１ꎬ３￣葡聚糖酶、Ｍａｌ
ｄ１、ＰＲ￣１)是苹果枝条表皮细胞应答轮纹病菌胁迫
的关键蛋白ꎬ与苹果抗病性相关ꎮ 本研究从蛋白质
水平上初步认识了苹果枝条表皮应答轮纹病菌胁
迫的抗性相关蛋白表达情况ꎬ为进一步开展苹果轮
纹病抗性新种质的遗传改良提供参考ꎮ
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Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｓｉｎｉｃａ (园艺学报)ꎬ
２０１０ꎬ３７(４): ５３９－５４６.
[３] Ｊｕｒｉｃｋ Ｗ Ｍꎬ Ｊａｎｉｓｉｅｗｉｃｚ Ｗ Ｊꎬ Ｓａｆｔｎｅｒ Ｒ Ａꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ ａｐｐｌｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ (Ｍａｌｕｓ ｓｐｐ.)
ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ ｄｅｃａｙ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ａｃｕｔａｔｕｍ [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇꎬ ２０１１ꎬ １３０: ４８１－４８６.
[４] Ｖｏｌｋ Ｇ Ｍꎬ Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｃ Ｍꎬ Ｒｅｉｌｌｅｙ Ａꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｗｉｌｄ Ｍａｌｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
ｆｒｏｍ Ｔｕｒｋｅｙ ａｎｄ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｕｓｓｉａ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ ２００８ꎬ
１３３: ３８３－３８９.
[５] Ｂｅｄｎａｒｅｋ Ｐꎬ Ｏｓｂｏｕｒｎ Ａ. Ｐｌａｎｔ￣ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ:
ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ [ Ｊ ] . Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ
２００９ꎬ ３２４: ７４６－７４８.
[６] Ｌｉ Ｚ Ｔꎬ Ｄｈｅｋｎｅｙ Ｓ Ａꎬ Ｇｒａ Ｄ. ＰＲ￣１ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ
ｇｒａｐｅｖｉｎｅ: ａ ｕｎｉｑｕｅｌｙ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ ＰＲ￣１ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ａ
Ｖｉｔｉｓ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｏｒｔｓꎬ ２０１１ꎬ ３０: １－１１.
[７] Ｓｏｈ Ｈ Ｃꎬ Ｐａｒｋ Ａ Ｒꎬ Ｐａｒｋ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １０ ( ＰＲ１０ )
ｇｅｎｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｕｎｇａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐｅｐｐｅｒｓ
[ Ｊ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０１２ꎬ １３２:
３７－４８.
[８] Ｖｅｌａｓｃｏ Ｒꎬ Ｚｈａｒｋｉｋｈ Ａꎬ Ａｆｆｏｕｒｔｉｔ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ
ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ ａｐｐｌｅ (Ｍａｌｕｓ×ｄｏｍｅｓｔｉｃａ
６８２
３期 张彩霞ꎬ等:苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学分析
Ｂｏｒｋｈ.) [Ｊ] . Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ ２０１０ꎬ ４２(１０): ８３３－
８３９.
[９] Ｏｇａｔａ Ｔꎬ Ｓａｎｏ Ｔꎬ Ｈａｒａｄａ Ｙ. Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｓｐｐ. ｉｓｏ￣
ｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｐｐｌｅ ａｎｄ ｓｅｖｅｒａｌ ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅｓ ａｒｅ
ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｗａｒｔｓ ｏｎ ｔｗｉｇｓꎬ ｓｉｚｅ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａꎬ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ＩＴＳ ｒｅｇｉｏｎｓ [ Ｊ] .
Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ ２０００ꎬ ４１: ３３１－３３７.
[１０] Ｓｌｉｐｐｅｒｓ Ｂꎬ Ｓｍｉｔ Ｗ Ａꎬ Ｃｒｏｕｓ Ｐ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔａｘｏｎｏｍｙꎬ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ ａｓ￣
ｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｍｅ ａｎｄ ｓｔｏｎｅ ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅｓ ｉｎ Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ
ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ
２００７ꎬ ５６: １２８－１３９.
[１１] Ｇｕｏ Ｌ Ｙꎬ Ｌｉ Ｊ Ｙꎬ Ｌｉ Ｂ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ
ｃａｎｋｅｒ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏ￣
ｔｅｃｔｉｏｎ (植物保护)ꎬ２００９ꎬ ３５(４): １２０－１２３.
[１２] Ｐｉｔｔ Ｗ Ｍꎬ Ｈｕａｎｇ Ｒꎬ Ｓｔｅｅｌ Ｃ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅ￣
ａｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ Ｎｅｗ
Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ [Ｊ] . Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒ￣
ｎａｌ ｏｆ Ｇｒａｐｅ ａｎｄ Ｗｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ ２０１０ꎬ １６: ２５８－２７１.
[１３] Ｚｈｏｕ Ｚ Ｑꎬ Ｈｏｕ Ｈꎬ Ｗａｎｇ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｒｕｎｋ ａｐｐｌｅ ｒｉｎｇ
ｒｏｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｃｕｌｔｉｖａｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ
Ｓｃｉｅｎｃｅ(果树学报)ꎬ２０１０ꎬ ２７ (６): ９５２－９５５.
[１４] Ｙａｎｇ Ｌ Ｌꎬ Ｚｈｕａｎｇ Ｙꎬ Ｗａｎｇ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃ￣
ｔｕｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｆｒｕｉｔ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] .
Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｓｉｎｉｃａ (园艺学报 )ꎬ ２０１２ꎬ ３９
(５): ９６３－９６９.
[１５] Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｓ Ｃꎬ Ｗｉｔｔｅｒｓ Ｅꎬ Ｌａｕｋｅｎｓ Ｋꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｒｅｐａｒａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ:
Ａｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｗｏ￣ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ [Ｊ] . Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓꎬ ２００５ꎬ ５:
２４９７－２５０７.
[１６] Ｗａｎｇ Ｘ Ｑꎬ Ｙａｎｇ Ｐ Ｆꎬ Ｇａｏ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙ￣
ｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｉｇｈ￣ｓａｌｉｎｉｔｙ ｓｔｒｅｓｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔａꎬ
２００８ꎬ ２２８: １６７－１７７.
[１７] Ｚｈａｎｇ Ｃ Ｘꎬ Ｃｈｅｎ Ｙꎬ Ｌｉ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ－
ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｆｒｏｍ ａｐｐｌｅ ｌｅａｖｅｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ
Ｓｃｉｅｎｃｅ (果树学报)ꎬ ２０１２ꎬ ２９ (３): ４８８－４９２.
[１８] Ｓｏｎｇ Ｊꎬ Ｂｒａｕｎ Ｇꎬ Ｂｅｖｉｓ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ ｆｒｕｉｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ
ｆｏｒ ２￣ＤＥ ａｎｄ ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ [Ｊ] . Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓꎬ ２００６ꎬ
２７(１５): ３１４４－３１５１.
[１９] Ｄｉｎａｋａｒａ Ｃꎬ Ｄｊｉｌｉａｎｏｖ Ｄꎬ Ｂａｒｔｅｌｓａ Ｄ. Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｉｎ ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｐｌａｎｔｓ: Ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ
ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｄｅｆｅｎｓｅ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ ２０１２ꎬ
１８２: ２９－４１.
[２０] Ａｇｒａｗａｌ Ｇ Ｋꎬ Ｒａｋｗａｌ Ｒꎬ Ｙｏｎｅｋｕｒａ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ
ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｏｚｏｎｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｒｉｃｅ (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉ￣
ｖａ Ｌ.) ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ [Ｊ] . Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓꎬ ２００２ꎬ ２: ９４７－９５９.
[２１] Ｃｈｅｎ Ｘ Ｆꎬ Ｆｕ Ｓ Ｆꎬ Ｚｈａｎｇ Ｐ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｄｉｓｅａｓｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｅｓｉｏｎ ｍｉｍｉｃ
ｍｕｔａｎｔ ｓｐｏｔｔｅｄ ｌｅａｆ ５ ｉｎ ｒｉｃｅ [Ｊ] . Ｒｉｃｅꎬ ２０１３ꎬ ６:１－１０.
[２２] Ｌｏｏｎ Ｌ Ｃꎬ Ｒｅｐ Ｍꎬ Ｐｉｅｔｅｒｓｅ Ｃ Ｍ. Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｆｅｎｓｅ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ
[Ｊ] . Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｙꎬ ２００６ꎬ ４４:１３５
－１６２.
[２３] Ｆａｉｚｅａ Ｍꎬ Ｂｕｒｇｏｓ Ｌꎬ Ｆａｉｚｅｂ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｏｂａｃｃｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｕｓｉｎｇ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ
ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ Ｃｕꎬ Ｚｎ￣ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０１２ꎬ ６１: ８５８－８６６.
[２４] Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒ Ｈꎬ Ｅｂｎｅｒ Ｃ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｏｏｄ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ [ Ｊ ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ ２０００ꎬ
１０６: ２７－３６.
[２５] Ｌｉｕ Ｂꎬ Ｘｕｅ Ｘ Ｄꎬ Ｃｕｉ Ｓ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ￣
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｗｈｅａｔ β￣１ꎬ３￣ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ
[ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓꎬ ２０１０ꎬ ３７: １０４５ －
１０５２.
责任编辑:李晖
７８２