全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(５): ５４６￣５５１(２０１４)
收稿日期: ２０１４￣０１￣２８ꎻ 修回日期: ２０１４￣０６￣０２
基金项目: 国家公益性行业(农业)科研专项(２０１３０３０１８)ꎻ安徽省农科院院长青年创新基金项目(１１Ｂ１１１１)
通讯作者: 高智谋ꎬ教授ꎬ主要从事真菌学及植物真菌病害研究ꎻＴｅｌ:０５５１￣６５７８６３２２ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｇａｏｚｈｉｍｏｕ＠１２６.ｃｏｍ
戚仁德ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物病原真菌学及 ＩＰＭ技术研究ꎻＴｅｌ:０５５１￣６５１６０８８２ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｒｅｎｄｅ７＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.０１４
研究简报
以 Ｙｐｔ１基因序列为靶标的辣椒疫病菌快速分子检测
李毛毛１ꎬ 赵 伟２ꎬ 汪 涛２ꎬ 谷 雨２ꎬ 高智谋１∗ꎬ 戚仁德２∗
( １安徽农业大学植物保护学院ꎬ合肥 ２３００３６ꎻ ２安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所ꎬ合肥 ２３００３１)
Ｒａｐｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｔｓ Ｙｐｔ１ ｇｅｎｅ ＬＩ Ｍａｏ￣
ｍａｏ１ꎬ ＺＨＡＯ Ｗｅｉ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｔａｏ２ꎬ ＧＵ Ｙｕ２ꎬ ＧＡＯ Ｚｈｉ￣ｍｏｕ１ꎬ ＱＩ Ｒｅｎ￣ｄｅ２ ( １Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ａｎｈｕｉ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｅｆｅｉ ２３００３６ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｇｒｏ￣ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｓａｆｅｔｙꎬ Ａｎｈｕｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉ￣
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈｅｆｅｉ ２３００３１ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｒａｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ (Ｙｐｔ１) ｏｆ Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ.
Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔꎬ Ｙｐｔ１ ｈａｓ ｔｈｅ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｉｎｔｒｏｎ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ (ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ) . Ｏｎｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ
ａｍｐｌｉｆｙ ｏｎｅ Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ １５６ ｂｐ. Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒꎬ ｔｈｅ Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｓｏｉｌｓ
ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ. Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙꎬ Ｙｐｔ１ ｈａｓ ａｎ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｇｅｎｕｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｐｒｉｍｅｒｓ (Ｙｐｔ１Ｆ / Ｙｐｔ１Ｒ)ꎬ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｂｏｕｔ ５４０ ｂｐ ｆｒｏｍ １４ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｅｃｉｃｅｓ
ａｎｄ ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｂｏｕｔ ３５０ ｂｐ ｉｎ Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ ｗｉｔｈ ｎｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｆｕｎｇａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ. Ｂｙ ＰＣＲ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡꎬ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ １０ ｐｇ ａｎｄ １０ ｆｇ ＤＮＡ ｗｅｒｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｉｎ
ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ (ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ) ａｎｄ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ (Ｙｐｔ１Ｆ / Ｙｐｔ１Ｒ ａｎｄ ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ)ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ
ａｎｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｓｏｉｌｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ Ｙｐｔ１ ｇｅｎｅ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０５４６￣０６
辣椒疫霉(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ)是一种重要
的植物病原卵菌ꎬ寄主范围广泛ꎬ除了辣椒以外ꎬ还
可以侵染番茄、茄子及多种瓜类ꎬ造成疫病ꎬ危害作
物生产ꎮ 随着设施农业的大规模发展ꎬ蔬菜种植面
积日益扩大ꎬ该菌所致病害及造成的经济损失逐年
加重ꎮ 对辣椒疫霉菌进行早期检测可以及时采取
防治措施ꎬ控制病害进一步扩展ꎮ 而传统的检测方
法主要为直接观察发病症状、病原物分离后进行形
态鉴定ꎬ费时费力ꎬ不适合于病原物的早期快速鉴
定ꎮ 聚合酶链式反应(ＰＣＲ)通过寻找合适的靶标
基因实现病菌的快速灵敏的分子检测ꎬ使用最多的
是核糖体转录间隔区域( ＩＴＳ)序列ꎮ ＩＴＳ序列具有
种间变异较大、种内保守的特性ꎬ适合对不同物种
进行区分[１]ꎮ 但是一些分类地位很近的物种因具
有非常相似的 ＩＴＳ序列ꎬ很难设计出合适的引物将
其分开ꎮ 例如ꎬ疫霉属中的 Ｐ. ｎｅｍｏｒｏｓａ、Ｐ. ｉｌｉｃｉｓ、
Ｐ. ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ和 Ｐ. ｓｅｕｄｏｓｙｒｉｎｇａｅ ꎬ很难利用 ＩＴＳ
序列将这些种进行区分[２]ꎮ 随着基因组测序工作
５期 李毛毛ꎬ等:以 Ｙｐｔ１基因序列为靶标的辣椒疫病菌快速分子检测
的进行ꎬ很多检测靶标被开发并加以利用ꎬ如疫霉属
中的 ｅｌｉｃｉｔｉｎ相关的 ｐａｒＡ１基因ꎬ线粒体中的编码基
因 Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２ 和储存蛋白编码 Ｌｐｖ 基因ꎮ Ｙｐｔ１ 基
因编码 １个 Ｒａｓ 相关的蛋白ꎬ具有保守的编码区和
变异大的内含子区ꎮ 通过序列比对分析ꎬＳｃｈｅｎａ
等[３]设计了 Ｐ. ｒａｍｏｒｕｍ、Ｐ. ｋｅｒｎｏｖｉａｅ、Ｐ. ｃｉｔｒｉｃｏｌａ
和 Ｐ. ｑｕｅｒｃｉｎａ的特异性检测引物ꎬ可以将这些疫霉
种区分开来ꎮ Ｍｅｎｇ等[４]同样以 Ｙｐｔ１为靶标设计出
了 Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ特异性引物ꎮ 本文以 Ｙｐｔ１ 基因
组序列为靶标ꎬ利用生物信息学分析比对ꎬ在序列变
异较大的内含子区域设计出了 １ 对辣椒疫霉特
异性的检测引物 ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒꎬ可以快速灵敏
地区分辣椒疫霉和其它相似的种ꎮ 本研究建立的方
法可以用于发病植株及田间土壤中残留的辣椒疫霉
的快速分子检测ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 供试菌株
辣椒疫霉(Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ)、大豆疫霉(Ｐ. ｓｏｊａｅ)、
恶疫霉(Ｐ. ｃａｃｔｏｒｕｍ)、隐地疫霉(Ｐ. ｃｒｙｐｔｏｇｅａ)、烟
草疫霉(Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ)、棕榈疫霉(Ｐ. ｐａｌｍｉｖｏｒａ)、
瓜类疫霉(Ｐ. ｍｅｌｏｎｉｓ)、掘氏疫霉(Ｐ. ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ)、
荔枝疫霉(Ｐ. ｌｉｔｃｈｉｉ)、苎麻疫霉(Ｐ. ｂｏｅｈｍｅｒｉａｅ)、
致病疫霉(Ｐ. ｉｎｆｅｓｔａｎｓ)、苜蓿疫霉 (Ｐ. ｍｅｄｉｃａｇｉ￣
ｎｉｓ)、樟疫霉(Ｐ. ｃｉｎｎａｍｏｍｉ)、寄生疫霉(Ｐ. ｐａｒａｓｉｔｉ￣
ｃａ)、腐霉菌 ( Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｐ )、镰孢菌 ( Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｓｐｐ.)、小麦纹枯病菌(Ｒｈｉｚｏｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ)、稻瘟病
菌(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ)、辣椒炭疽病菌(Ｃｏｌｌｅｔｏ￣
ｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ)、油菜菌核病菌(Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏ￣
ｔｉｏｒｕｍ)、灰葡萄孢(Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ)ꎮ
１.２ 培养基
１０％ Ｖ８培养基[５]ꎬＰＤＡ培养基ꎬ选择性培养基
(含 ０.２５ μｇｍＬ－１氨苄青霉素、０.３ μｇｍＬ－１利福
平、０.２５ μｇｍＬ－１五氯硝基苯的 １０％ Ｖ８培养基)ꎮ
１.３ 菌株培养及菌丝制备及 ＤＮＡ提取
将供试疫霉属和腐霉属的不同种菌株转至
１０％ Ｖ８ 平板ꎬ其它真菌菌株转至 ＰＤＡ 平板上ꎬ
２５℃黑暗培养 ３ ｄ 后从菌落边缘切取 １０ 块 ２ ｍｍ
× ２ ｍｍ菌丝块ꎬ２５℃振荡培养 ３~５ ｄꎬ过滤收集菌
丝ꎬ吸干水分后用于提取 ＤＮＡꎮ
１.４ 病田土壤中病菌 ＤＮＡ的提取
采用 ５ 点取样法ꎬ从辣椒发病田块选取 ５ 个
点ꎬ分别采取土样ꎬ土壤混匀后称取 ０.５ ｇ 作为检
测样品ꎮ 将 １００ μＬ含有 １００个游动孢子的悬浮液
注入 ０. ５ ｇ 土壤中ꎬ用做阳性对照ꎮ 采用 Ｆａｓｔ
ＤＮＡ® ＳＰＩＮ试剂盒(Ｑ￣Ｂｉｏｇｅｎｅ Ｌｔｄꎬ ＵＳＡ)提取土
壤样品的 ＤＮＡꎬ提取方法及步骤参见试剂盒说明
书ꎮ 用作阴性对照的土样采自没有发病的辣椒田
块ꎮ 实验重复至少 ３次以上ꎮ
１.５ 基因组的提取
取少量菌丝或植物组织ꎬ吸水纸将水充分吸干
后ꎬ液氮充分研磨成粉ꎬ利用 ＣＴＡＢ 法提取所需基
因组ꎮ 加 ３０ ~ ６０ μＬ 含 ２０ μｇｍＬ－１ ＲＮａｓｅ 的灭
菌超纯水溶解提取的基因组沉淀物ꎬ３７℃处理 ３０
ｍｉｎ后ꎬ－２０℃保存备用ꎮ
１.６ 引物设计及 ＰＣＲ扩增
１.６.１ 引物设计 利用生物信息学进行序列比
对ꎬ在编码区设计出疫霉的通用引物 Ｙｐｔ１Ｆ /
Ｙｐｔ１Ｒꎬ在内含子序列差异大的区域设计并合成出
辣椒疫霉的特异性引物 ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒꎮ
１.６.２ 常规 ＰＣＲ反应 ＰＣＲ反应体系参见 ＴａＫａ￣
Ｒａ公司提供的 ＰＣＲ 配制说明书ꎮ 反应程序为:
９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ然后 ９４℃变性 ３０ Ｓꎬ５８℃退火
３０ Ｓꎬ７２℃延伸 ３０ Ｓꎬ共 ３５ 个循环ꎻ最后 ７２℃延伸
７ ｍｉｎꎮ 反应结束后取 １０ μＬ扩增产物采用 １.０％ 琼
脂糖凝胶进行电泳检测ꎬ１２０ Ｖ电压下电泳 ２５ ｍｉｎꎬ
在凝胶成像系统的紫外光照射下进行检测并拍照ꎮ
１.６.３ 套式 ＰＣＲ 反应 为了提高检测灵敏度ꎬ进
一步建立了套式 ＰＣＲ反应体系ꎮ 以疫霉的通用引
物 Ｙｐｔ１Ｆ / Ｙｐｔ１Ｒ作为第一轮反应引物ꎬ取 １ μＬ 第
一轮 ＰＣＲ反应产物作为模板用辣椒疫霉的特异性
引物 ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ 进行第二轮 ＰＣＲ 反应ꎮ
反应程序及检测方法同上ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 不同菌株 Ｙｐｔ１基因序列比对及引物设计
从不同的疫霉数据库中下载 Ｙｐｔ１ 的基因组序
列进行比对分析ꎬ 分别为辣椒疫霉 ＰｃＹｐｔ１
(Ｐｃ８３１８ꎬ ｈｔｔｐ: / / ｇｅｎｏｍｅ.ｊｇｉ￣ｐｓｆ.ｏｒｇ / Ｐｈｙｃａ１１ / Ｐｈｙ￣
ｃａ１１. ｈｏｍｅ. ｈｔｍｌ)ꎬ大豆疫霉 ＰｓＹｐｔ１ ( Ｐｓ３０９１３６ꎬ
７４５
植物病理学报 ４４卷
ｈｔｔｐ: / / ｇｅｎｏｍｅ.ｊｇｉ￣ｐｓｆ.ｏｒｇ / Ｐｈｙｓｏ３ / Ｐｈｙｓｏ３.ｈｏｍｅ.ｈｔ￣
ｍｌ)ꎬ橡树疫霉 ＰｒＹｐｔ１(Ｐｒ７１３９１ꎬ ｈｔｔｐ: / / ｇｅｎｏｍｅ.ｊｇｉ
－ｐｓｆ.ｏｒｇ / Ｐｈｙｒａ１＿１ / Ｐｈｙｒａ１＿１. ｈｏｍｅ. ｈｔｍｌ)ꎬ致病疫
霉 ＰｉＹｐｔ１ ( ＰＩＴＧ ＿ ０３３９２ꎬ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉ￣
ｔｕｔｅ. ｏｒｇ / ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ / ｇｅｎｏｍｅ / ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ＿ ｉｎｆｅｓ￣
ｔａｎｓ / ＭｕｌｔｉＨｏｍｅ.ｈｔｍｌ)ꎬ寄生疫霉 ＰｐＹｐｔ１ ( ＰＰＴＧ＿
１４８２３ꎬ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ. ｏｒｇ / ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ /
ｇｅｎｏｍｅ / Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ＿ｐａｒａ ｓｉｔｉｃａ / ＭｕｌｔｉＨｏｍｅ.ｈｔｍｌ)
的基因组序列ꎬ这些基因的碱基序列分别含有 ５ 个
较为保守的外显子区域及 ４ 个差异较大的内含子
区域ꎮ 序列比对后设计出疫霉通用引物及辣椒疫
霉的特异性引物(图 １)ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｙｐｔ１ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ
ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｆｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｔｈｅ ｂｌｕｅ ｌｉｎｅｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｙｐｔ１Ｆ / Ｙｐｔ１Ｒꎻ
Ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎ ｏｎｅｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ.
８４５
５期 李毛毛ꎬ等:以 Ｙｐｔ１基因序列为靶标的辣椒疫病菌快速分子检测
所用的疫霉通用引物为:Ｙｐｔ１Ｆ(２０ ｂｐ): ５′￣
ＡＣＧＧＡＧＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＧＡＣ￣３′ꎬＹｐｔ１Ｒ(２０ ｂｐ):
５′￣ＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＴＣＴＴＧＴＴＡＣＣ￣３′ꎮ 所用的辣椒
疫霉特异性引物为:ＰｃＹｐｔ１Ｆ (２１ ｂｐ): ５′ＡＧＡＣ￣
ＴＣＴＧＴＴＧＴＡＴＡＧＣＡＧＡＧ￣３′ꎬＰｃＹｐｔ１Ｒ(２０ ｂｐ): ５′￣
ＡＡＣＧＴＣＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＴＧ￣３′ꎮ
２.２ Ｙｐｔ１疫霉通用引物的验证
Ｙｐｔ１ 通用引物 Ｙｐｔ１Ｆ / Ｙｐｔ１Ｒ 对 １４ 个疫霉属
的不同种菌株、２个腐霉菌株和 ８ 个真菌菌株进行
ＰＣＲ扩增ꎬ结果表明 Ｙｐｔ１ 通用引物在疫霉属的不
同种间能够特异的扩增出 １ 条约 ５４０ ｂｐ 左右特异
性条带ꎬ而在腐霉属的 ２个菌株中扩增出来的条带
(约 ３５０ ｂｐ)明显小于疫霉属的ꎬ在真菌中扩增不
出来任何条带(图 ２)ꎬ由此证明 Ｙｐｔ１Ｆ / Ｙｐｔ１Ｒ 可
以用作疫霉属的通用引物ꎮ
２.３ Ｙｐｔ１辣椒疫霉特异性引物及灵敏度验证
选用 １ 个辣椒疫霉标准菌株 ＰｃＡ１ꎬ２ 个田间
分离的辣椒疫霉菌株所提的基因组为模板ꎬ以辣椒
疫霉 Ｙｐｔ１ 的特异性引物 ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ 进行
ＰＣＲ反应ꎬ可以扩增出 １ 条约 １５６ ｂｐ 大小的电泳
条带ꎬ而其它疫霉菌株、腐霉菌株和真菌菌株均没
有扩增条带(图 ３)ꎬ表明 ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ可以作
为辣椒疫霉的特异性引物ꎮ 辣椒疫霉标准菌株
ＤＮＡ １ ｎｇμＬ－１开始 １０ 倍向下稀释至 １０ ａｇ
μＬ－１ꎬ各个浓度梯度取 １ μＬ 为 ＰＣＲ 模板ꎬ辣椒疫
霉 Ｙｐｔ１的特异性引物 ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ进行 ＰＣＲ
扩增ꎬ取 ７ μＬ 电泳产物进行电泳检测ꎬ该特异性
引物可以检测到 １０ ｐｇ 量的基因组(图 ４Ａ)ꎮ 用
Ｙｐｔ１疫霉通用引物 Ｙｐｔ１Ｆ / Ｙｐｔ１Ｒ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ
取 １ μＬ产物作为下一轮 ＰＣＲ扩增的模板ꎬ以辣椒
疫霉 Ｙｐｔ１ 的特异性引物 ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ 进行
ＰＣＲ扩增ꎬ取 ７ μＬ 电泳产物进行电泳检测ꎬ结果
表明套式 ＰＣＲ 可以检测到 １０ ｆｇ 量的基因组(图
４Ｂ)ꎬ即其灵敏度可以检测到 １ 个卵孢子和 １ 个游
动孢子ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ￣ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ
ｇｅｎｕｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ＹＰＴ１Ｆ / ＹＰＴ１Ｒ
Ｍ: ２０００ ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣２４: Ｏｏｍｙｃｅｔｅ ａｎｄ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｓ ( １. Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉꎻ ２. Ｐ. ｓｏｊａｅꎻ
３. Ｐ. ｃａｃｔｏｒｕｍꎻ ４. Ｐ. ｃｒｙｐｔｏｇｅａꎻ ５. Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎａｅꎻ ６. Ｐ. ｐａｌｍｉｖｏｒａꎻ ７. Ｐ. ｍｅｌｏｎｉｓꎻ ８. Ｐ. ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉꎻ
９. Ｐ. ｌｉｔｃｈｉｉꎻ １０. Ｐ. ｂｏｅｈｍｅｒｉａｅꎻ １１. Ｐ. ｉｎｆｅｓｔａｎｓꎻ １２. Ｐ. ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓꎻ １３. Ｐ. ｃｉｎｎａｍｏｍｉꎻ １４. Ｐ. ｐａｒａｓｉｔｉｃａꎻ
１５￣１６. Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｐ.ꎻ １７￣１９ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ ꎻ ２０. Ｒｈｉｚｏｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓꎻ ２１. Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅꎻ
２２. Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉꎻ ２３. Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍꎻ ２４. Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ) .
Ｆｉｇ. ３ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ
Ｍ: ２０００ ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ ｉｓｏｌａｔｅ ＰｃＡ１ꎻ Ｌａｎｅｓ ２￣３: Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔｓꎻ
Ｌａｎｅｓ ４￣１６: Ｏｔｈｅｒ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｅｃｉｅｓꎻ Ｌａｎｅｓ １７￣１８: Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｐ. ｓｔｒａｉｎｓꎻ Ｌａｎｅｓ １９￣２４: Ｆｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎｓ.
９４５
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ４ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ＰｃＹＰＴ１ ｕｓｉｎｇ ｓｅｒｉａｌｌｙ ｄｉｌｕｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
(１ ｎｇ￣１０ ａｇ) ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ ｉｓｏｌａｔｅ ＰｃＡ１ ａｓ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ
Ａ: Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ＰｃＹＰＴ１Ｆ / ＰｃＹＰＴ１Ｒ (ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ １０ ｐｇ) .
Ｂ: Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ＹＰＴ１Ｆ / ＹＰＴ１Ｒ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｎｄ ＰｃＹＰＴ１Ｆ / ＰｃＹＰＴ１Ｒ
ａｓ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ (ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ １０ ｆｇ)ꎻ Ｍ: ２０００ ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ.
２.４ 辣椒疫霉特异性引物对发病植株及土壤中病
原物的检测
用 １ ０００个游动孢子对辣椒植株进行灌根ꎬ至
辣椒植株发病ꎬ以 ＣＴＡＢ 法提取发生病害的植株ꎬ
取 １ μＬ作为模板ꎬ以辣椒疫霉 Ｙｐｔ１的特异性引物
ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ可以扩增出 １
条特异性条带ꎬ而健康植株没有对应的条带(图
５)ꎬ 这说明辣椒疫霉特异性引物 ＰｃＹｐｔ１Ｆ /
ＰｃＹｐｔ１Ｒ可以用来对发病植株进行快速鉴定ꎮ 检
测采自辣椒发病田间土壤中的病原物ꎬ利用试剂盒
提取基因组后ꎬ用疫霉通用引物 Ｙｐｔ１Ｆ / Ｙｐｔ１Ｒ 扩
增后取 １ μＬ作为模板ꎬ在利用辣椒疫霉 Ｙｐｔ１ 的特
异性引物 ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ两份
采自病田的土样均扩增到了与阳性对照相同大小
的条带(图 ６)ꎬ而作为阴性对照的土样则没有扩增
出任何条带ꎬ说明利用 Ｙｐｔ１ 的特异性引物可以判
断土壤是否有辣椒疫霉病原物的存在ꎮ
Ｆｉｇ. ５ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ
ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｅｐｐｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ
ｕｓｉｎｇ ＰｃＹＰＴ１Ｆ / ＰｃＹＰＴ１Ｒ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｍ: ２０００ ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅｓ
２￣４: Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｅｐｐｅｒ ｔｉｓ￣
ｓｕｅｓꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
Ｆｉｇ. ６ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ
ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｆｉｅｌｄ ｓｏｉｌｓ ｕｓｉｎｇ
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ (ＹＰＴ１Ｆ / ＹＰＴ１Ｒ ａｎｄ
ＰｃＹＰＴ１Ｆ / ＰｃＹＰＴ１Ｒ)
Ｍ: ２０００ ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅｓ
２￣３: Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｆｉｅｌｄ ｓｏｉｌｓꎻ
Ｌａｎｅ ４: Ｎｏｎｉｎｆｅｓｔｅｄ ｓｏｉｌｓꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
３ 讨 论
Ｙｐｔ１是一个小 Ｇ 蛋白 Ｒａｓ 家族的相关的编码
基因ꎬ该基因的编码区域在进化上非常保守ꎬ可以将
不同属的物种进行区分ꎬ而其含有的内含子区域变
异较大ꎬ可以用来设计出不同种的特异性引物ꎮ 本
研究比较分析了疫霉属的 Ｙｐｔ１基因序列ꎬ在此基础
上设计了 １ 对疫霉的通用检测引物 Ｙｐｔ１Ｆ / Ｙｐｔ１Ｒ
及辣椒疫霉特异性的检测引物 ＰｃＹｐｔ１Ｆ / ＰｃＹｐｔ１Ｒꎬ
使用该引物可以对含有辣椒疫霉的发病植株及土壤
进行 快 速 灵 敏 的 检 测ꎮ Ｓｃｈｅｎａ 等[３] 以 Ｙｐｔ１
基因序列为靶标设计出了疫霉的通用引物ꎬ但我们
在试验中发现其在疫霉属和腐霉属中均能扩增出
条带大小较为一致的目的片段ꎬ因此很难将这两个
０５５
５期 李毛毛ꎬ等:以 Ｙｐｔ１基因序列为靶标的辣椒疫病菌快速分子检测
属区分开来ꎮ 本文通过序列比对ꎬ设计的疫霉属通
用引物虽然也能在腐霉属中扩增出目的片段ꎬ但其
片段却比疫霉属中的目的片段要小ꎬ可以很直观的
将两种不同属的物种区分开来ꎮ 本实验设计的辣
椒疫霉特异性引物对辣椒疫霉可以扩增出 １ 条
１５６ ｂｐ特异性条带ꎬ而在其它疫霉种中扩增不出
该条带ꎮ 该特异性引物与套式 ＰＣＲ 配套使用ꎬ最
低可以检测出 １０ ｆｇ 含量的基因组ꎬ检测灵敏度
高ꎬ这与 Ｍｅｎｇ 等[４]利用 Ｙｐｔ１ 基因为靶标在烟草
疫霉中的检测灵敏度相似ꎬ可以用于辣椒疫霉所致
病害的早期快速分子检测ꎮ
参考文献
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责任编辑:李晖
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