全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４６(１): ２７￣３６(２０１６)
收稿日期: ２０１４￣１２￣０６ꎻ 修回日期: ２０１５￣１１￣１４
基金项目: 国家“９７３”计划项目(２０１１ＣＢ１００７０１)ꎻ公益性行业(农业)科研专项(２０１３０３０１５)
通讯作者: 何勇强ꎬ教授ꎬ主要从事分子植物病理学研究ꎻＴｅｌ: ＋８６￣０７７１￣３２３７８９６ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｙｑｈｅ＠ｇｘｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 刘国芳ꎬ女ꎬ山西人ꎬ博士研究生ꎬ主要从事分子植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｌｇｆ８４１１＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１６.０１.００４
十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 ｓｐｏＴＸｃｃ对
Ｔ３ＳＳ基因调控作用的分析
刘国芳１ꎬ 苏辉昭２ꎬ 刘 伟３ꎬ 牛祥娜２ꎬ 玉延华２ꎬ 姜 伟２ꎬ 何勇强１ꎬ２∗
( １广西大学农学院ꎬ南宁 ５３０００４ ꎻ ２广西大学生命科学与技术学院ꎬ南宁 ５３０００４ꎻ
３通化师范学院生命科学学院ꎬ通化 １３４００２)
摘要:通过反向遗传学方法和半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法ꎬ研究了十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因 ｓｐｏＴＸｃｃ与 ＩＩＩ
型分泌系统(Ｔ３ＳＳ)基因的调控关系ꎮ 基于自杀质粒 ｐＫ１８ｍｏｂ 同源整合方法构建了十字花科黑腐病菌 ｓｐｏＴＸｃｃ基因
(ＸＣ＿０９５６)的非极性整合突变体ꎬ检测了突变体的多种表型ꎬ发现 ｓｐｏＴＸｃｃ突变体延迟了在非寄主植物辣椒 ＥＣＷ￣１０Ｒ 上引
发的过敏反应(ＨＲ)ꎮ 利用 ＧＵＳ(β￣葡糖苷酸酶)活性检测、原位组织染色和半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 的方法ꎬ发现 Ｔ３ＳＳ 相关基因
在 ｓｐｏＴＸｃｃ基因的非极性整合突变体中表达量降低ꎬ表明十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因 ｓｐｏＴＸｃｃ显著正调
控 Ｔ３ＳＳ相关基因的表达ꎮ
关键词:十字花科黑腐病菌ꎻ ｓｐｏＴＸｃｃ基因ꎻ 过敏反应(ＨＲ)ꎻ Ｔ３ＳＳꎻ 调控
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｐｏＴＸｃｃ
ａｎｄ Ｔ３ＳＳ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ 　 ＬＩＵ Ｇｕｏ￣ｆａｎｇ１ꎬ ＳＵ
Ｈｕｉ￣ｚｈａｏ２ꎬ ＬＩＵ Ｗｅｉ３ꎬ ＮＩＵ Ｘｉａｎｇ￣ｎａ２ꎬ ＹＵ Ｙａｎ￣ｈｕａ２ꎬ ＪＩＡＮＧ Ｗｅｉ２ꎬ ＨＥ Ｙｏｎｇ￣ｑｉａｎｇ１ꎬ２ 　 ( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ
Ａｇｒｏｎｏｍｙꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ
Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｔｏｎｇｈｕａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔｏｎｇｈｕａ １３４００２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｐｏＴＸｃｃ ａｎｄ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ (Ｔ３ＳＳ) ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉ￣
ｇａｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ. Ａ ｎｏｎ￣ｐｏｌａｒ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｓｐｏＴＸｃｃ (ＸＣ＿
０９５６) ｗａｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｓｕｉｃｉｄｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＫ１８ｍｏｂ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｒｉｏｕｓ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ. Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｐｏＴＸｃｃｍｕｔａｎｔ ｄｅｌａｙｅｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｎ
ｔｈｅ ｎｏｎ￣ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔ ｐｅｐｐｅｒ ＥＣＷ￣１０Ｒ. Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔ３ＳＳ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｓｐｏＴＸｃｃ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｎｔ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｓꎬ ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｎｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｐｏＴＸｃｃ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｈｅ Ｔ３ＳＳ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｘ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓꎻ ｓｐｏＴＸｃｃ ｇｅｎｅꎻ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ (ＨＲ)ꎻ Ｔ３ＳＳꎻ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３５. １１１. ４７　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１６)０１￣００２７￣１０
　 　 细菌经常面临各种极端环境ꎬ营养物质对细菌
的生长和生存就是一个主要的环境因子ꎬ而为了适
应营养物质匮乏的环境ꎬ细菌在长期的进化过程中
形成了复杂的调控机制ꎮ 在营养物质匮乏的环境

　
植物病理学报 ４６卷
中ꎬ细菌会快速调节细胞生理生化的改变ꎬ如激活
或者抑制基因的表达、蛋白的翻译和一些酶的酶活
力ꎬ这个调控过程被称为应急反应[１]ꎮ 细菌的应
急反应是由胞内 ２ 个信号分子 ｐｐＧｐｐ 和 ｐｐｐＧｐｐ
引起的ꎬ通常统称为(ｐ) ｐｐＧｐｐ[２]ꎮ (ｐ) ｐｐＧｐｐ 在
应急反应中与细菌的多种生理变化相关ꎬ包括
ＤＮＡ的转录、复制、蛋白质的翻译、病原菌的致病
力、细菌的繁殖以及潜伏等[３]ꎮ 革兰氏阴性细菌
中(ｐ)ｐｐＧｐｐ是由 ＲｅｌＡ( ｒｅｌａｘｅｄ)和 ＳｐｏＴ ２个酶合
成的ꎬＲｅｌＡ 在氨基酸饥饿时合成 ( ｐ) ｐｐＧｐｐꎬ而
ＳｐｏＴ是一个双功能酶ꎬ它具有较强的( ｐ) ｐｐＧｐｐ
水解酶活性和较弱的(ｐ)ｐｐＧｐｐ 合成酶活性ꎬＳｐｏＴ
在碳源、磷酸、铁离子[４~６]或者脂肪酸[７]缺乏的环
境中可以合成应急因子(ｐ)ｐｐＧｐｐꎮ
　 　 十字花科黑腐病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓꎬ Ｘｃｃ)能够在世界范围内引起十字
花科植物的黑腐病[８]ꎬ是研究病原菌与植物互作
机理的模式微生物之一ꎮ 目前已完成多个 Ｘｃｃ 菌
株的全基因组序列测定ꎬ许多与致病相关的基因得
到鉴定[９~１１]ꎮ Ｔ３ＳＳ是 Ｘｃｃ 的一个重要致病系统ꎬ
由 ｈｒｐ / ｈｒｃ基因簇的基因编码[１２~１４]ꎬ能将效应物蛋
白转运至植物细胞内ꎮ 效应物蛋白具有双重功能ꎬ
在没有相应的抗病基因的寄主植物上ꎬ效应物蛋白
是致病因子ꎻ在有相对应的 Ｒ 基因的寄主植物上ꎬ
效应物蛋白(如ꎬＡｖｒ 蛋白)表现为无毒活性ꎬ其被
Ｒ基因识别后ꎬ引起寄主植物细胞的程序性死亡ꎬ
表现为寄主的 ＨＲ 反应ꎬ也是植物的一种“免疫反
应” [１５~１７]ꎮ
　 　 通过生物信息学分析及同源序列比对ꎬ发现十
字花科黑腐病菌 Ｘｃｃ ８００４ 菌株全基因组中存在
ｓｐｏＴ同源基因ꎬ本文称之为 ｓｐｏＴＸｃｃꎬ基因 ＩＤ为 ＸＣ
＿０９５６ꎮ 试验发现 Ｘｃｃ ８００４ 中的 ｓｐｏＴＸｃｃ基因突变
后ꎬ延迟了该菌在非寄主植物辣椒 ＥＣＷ￣１０Ｒ 上引
发的 ＨＲ反应ꎬ推断 ｓｐｏＴＸｃｃ基因可能与 Ｔ３ＳＳ 相关
基因存在调控关系ꎮ 经过 ＧＵＳ 活性检测、原位组
织染色和半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ的方法ꎬ发现在基本培养
基 ＭＭＸ 和植物体内ꎬＴ３ＳＳ 相关基因 ｈｒｐ 基因在
ｓｐｏＴＸｃｃ基因非极性整合突变体中的表达量降低ꎮ
这是十字花科黑腐病菌中首次关于应急反应相关
基因 ｓｐｏＴＸｃｃ正调控 Ｔ３ＳＳ 相关基因 ｈｒｐ 基因表达
的报道ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 菌株、质粒和培养条件
　 　 所用的菌株、质粒见表 １ꎮ 大肠杆菌在 ＬＢ 培
养基中培养[１８]ꎬ培养温度是 ３７℃ꎮ 十字花科黑腐
病菌在 ＮＹＧＢ 培养基[１９] (５.０ ｇ / Ｌ 多聚蛋白胨、
３.０ ｇ / Ｌ酵母提取物、２０.０ ｇ / Ｌ甘油)和ＭＭＸ培养
基[２０](２.０ ｇ / Ｌ (ＮＨ４) ２ＳＯ４、４.０ ｇ / Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、６.０
ｇ / Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０.２ ｇ / Ｌ ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ、１.０ ｇ / Ｌ 柠
檬酸三钠、５. ０ ｇ / Ｌ 葡萄糖)中培养ꎬ培养温度为
２８℃ꎮ ＬＡ培养基为 ＬＢ培养基添加 １％(Ｗ/ Ｖ)琼
脂的固体培养基ꎬＮＹＧＡ为 ＮＹＧＢ培养基添加 １％
(Ｗ/ Ｖ)琼脂的固体培养基ꎮ 抗生素的用量为:大
肠杆菌和十字花科黑腐病菌均为 ５０ μｇ / ｍＬ 利福
平(Ｒｉｆ)、２５ μｇ / ｍＬ 卡那霉素(Ｋｍ)、１００ μｇ / ｍＬ
壮观霉素(Ｓｐｃ)ꎻ四环素(Ｔｃ)ꎬ大肠杆菌的用量为
１５ μｇ / ｍＬꎬ十字花科黑腐病菌的用量为 ５ μｇ / ｍＬꎮ
１.２　 ｓｐｏＴＸｃｃ基因突变体、功能互补菌株的构建
１.２.１　 ｓｐｏＴＸｃｃ基因突变体构建　 按照 Ｗｉｎｄｇａｓｓｅｎ
等[２１]描述的方法构建 ｓｐｏＴＸｃｃ基因整合突变体ꎬ所
用引物见表 ２ꎮ ＰＣＲ 扩增目标基因 ｓｐｏＴＸｃｃ内部的
ＤＮＡ片段ꎬ经过预先在引物中设计的 ＢａｍＨ Ｉ 和
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ双酶切后ꎬ按照转录方向连接在自杀质粒
载体 ｐＫ１８ｍｏｂ 相应的酶切位点之间ꎬ用引物
０９５６ｎｋＦ / ０９５６ｎｋＲ进行 ＰＣＲ 验证ꎬ并用酶切验证
的方法ꎬ挑取正确的重组质粒ꎬ送样测序ꎬ将测序正
确的重组质粒通过三亲本接合的方法导入野生型
菌株 Ｘｃｃ ８００４中ꎬ在含有相应抗生素 Ｒｉｆ和 Ｋｍ的
ＮＹＧＡ平板上筛选发生同源单交换的三亲本接合
子ꎬ即非极性整合突变体ꎬ挑取阳性克隆用引物
ｐＫ１８ｃｏｎ / ０９５６ｃｏｎＲ进行 ＰＣＲ验证ꎬ随机挑取一个
验证正确的阳性克隆进行下一步试验ꎬ并将验证正
确的突变体命名为 ＮＫ０９５６ꎮ
１.２. ２ 　 功能互补菌株的构建 　 以 Ｘｃｃ ８００４ 总
ＤＮＡ为模板ꎬ通过 ＰＣＲ 方法分别扩增目的基因
ｓｐｏＴＸｃｃ全基因序列的 ＤＮＡ 片段(包括 ｓｐｏＴＸｃｃ基因
上游 ＤＮＡ 片段约 ２６０ ｂｐ)ꎬ测序正确后连接到
ｐＬＡＦＲ３上ꎬ转化至大肠杆菌 ＪＭ１０９ 中ꎬ在含有相
应浓度 Ｔｃ 的 ＬＡ 平板上ꎬ获得转化子ꎬ利用 ＰＣＲ
验证和酶切验证的方法获得含有目的基因的重组
８２

　
　 １期 刘国芳ꎬ等:十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 ｓｐｏＴＸｃｃ对 Ｔ３ＳＳ基因调控作用的分析
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｅ. ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９ ＲｅｃＡ１ꎬｅｎｄＡ１ꎬｇｙｒＡ９６ꎬｔｈｉꎬｓｕｐＥ４４ꎬｒｅｌＡ１△
( ｌａｃ￣ｐｒｏＡＢ) / Ｆ’[ ｔｒａＤ３６ꎬｌａｃＩｑꎬｌａｃＺ△Ｍ１５]
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ＥＤ８７６７ ＲｅｃＡꎬｍｅｔꎬｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＲＫ２０７３ꎬＳｐｃｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
Ｘｃｃ
８００４ Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅꎬＲｉｆｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ＮＫ０９５６ Ａｓ ８００４ꎬ ｂｕｔ ｓｐｏＴ ∶ ∶ ｐＫ１８ｍｏｂꎬＲｉｆｒꎬＫｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＣＮＫ０９５６ ＮＫ０９５６ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ３ｓｐｏＴＸｃｃꎬＲｉｆｒꎬＫｍｒꎬＴｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＡＧＵＳ ８００４ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＡＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＢＧＵＳ ８００４ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＢＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＣＧＵＳ ８００４ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＣＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＤＧＵＳ ８００４ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＤＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＥＧＵＳ ８００４ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＥＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳ ８００４ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳ ８００４ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳ ８００４ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＡＧＵＳ ＮＫ０９５６ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＡＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋｍｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＢＧＵＳ ＮＫ０９５６ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＢＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋｍｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＣＧＵＳ ＮＫ０９５６ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＣＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋｍｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＤＧＵＳ ＮＫ０９５６ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＤＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋｍｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＥＧＵＳ ＮＫ０９５６ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＥＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋｍｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳ ＮＫ０９５６ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋｍｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳ ＮＫ０９５６ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋｍｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳ ＮＫ０９５６ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋｍｒꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｐＬＡＦＲ３ ＰＫ２ ｒｅｐｌｉｃｏｎꎻＭｏｂ＋ꎬＴｒａ－ꎻｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｌａｃꎬＴｅｔｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＲＫ２０７３ Ｈｅｌｐｅｒ ｐｌａｓｍｉｄꎬＴｒａ＋ꎬＭｏｂ＋ꎬＣｏｌＥ１ꎬＳｐｃｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＫ１８ｍｏｂ Ｓｕｉｃｉｄｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｉｎ ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓꎬＫｍｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＮＫ０９５６ ｐＫ１８ｍｏｂ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ５９７ ｂｐ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐｏＴＸｃｃ ｇｅｎｅꎬＫｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＬ３ｓｐｏＴＸｃｃ ｐＬＡＦＲ３ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｏＴ ｇｅｎｅ(２５９１ ｂｐ)ｏｆ ＸｃｃꎬＴｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＬ６ｈｒｐＡＧＵＳ ｐＬＡＦＲ６ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｈｒｐＡ ｏｐｅｒｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｇｕｓＡ ｆｕｓｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔꎬ Ｔｅｔｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＬ６ｈｒｐＢＧＵＳ ｐＬＡＦＲ６ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｈｒｐＢ ｏｐｅｒｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｇｕｓＡ ｆｕｓｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔꎬ Ｔｅｔｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＬ６ｈｒｐＣＧＵＳ ｐＬＡＦＲ６ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｈｒｐＣ ｏｐｅｒｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｇｕｓＡ ｆｕｓｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔꎬ Ｔｅｔｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＬ６ｈｒｐＤＧＵＳ ｐＬＡＦＲ６ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｈｒｐＤ ｏｐｅｒｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｇｕｓＡ ｆｕｓｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔꎬ Ｔｅｔｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＬ６ｈｒｐＥＧＵＳ ｐＬＡＦＲ６ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｈｒｐＥ ｏｐｅｒｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｇｕｓＡ ｆｕｓｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔꎬ Ｔｅｔｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳ ｐＬＡＦＲ６ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｈｒｐＦ ｏｐｅｒｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｇｕｓＡ ｆｕｓｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔꎬ Ｔｅｔｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳ ｐＬＡＦＲ６ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｈｒｐＧ ｏｐｅｒｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｇｕｓＡ ｆｕｓｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔꎬ Ｔｅｔｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳ ｐＬＡＦＲ６ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｈｒｐＸ ｏｐｅｒｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｇｕｓＡ ｆｕｓｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔꎬ Ｔｅｔｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
　 Ｒｉｆｒꎬ Ｋｍｒꎬ Ｔｅｔｒꎬ ａｎｄ Ｓｐｃｒ ＝ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎꎬ ｋａｎａｍｙｃｉｎꎬ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
９２

　
植物病理学报 ４６卷
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５’ ｔｏ ３’) Ｐｒｏｄｕｃｔ ｌｅｎｇｔｈ / ｂｐ
０９５６ｎｋＦ / ０９５６ｎｋＲ ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴ /
ＡＡＧＣＴＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＧ
５９７
ｐＫ１８ｃｏｎ / ０９５６ｃｏｎＲ ＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣ /
ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＡＴＣＧＧＣＡＴＧＴＡ
１ ７４８
Ｃ０９５６Ｆ / Ｃ０９５６Ｒ ＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＴ /
ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＡＴＣＧＧＣＡＴＧＴＡ
２ ５９１
１６Ｓ ｒＲＮＡＦ / １６Ｓ ｒＲＮＡＲ ＣＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴ / ＧＴＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＴＡＧＧＴＧＧＴ １９５
ｈｒｐＧＲＴＦ / ｈｒｐＧＲＴＲ ＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＣ / ＧＧＴＧＣＧＡＴＴＧＡＣＣＧＴＡＴＴＧ １４４
ｈｒｐＸＲＴＦ / ｈｒｐＸＲＴＲ ＧＡＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣ / ＧＣＣＴＧＧＣＡＡＴＡＣＴＣＧＡＡＣＴＣ ２０４
ｈｒｐＢ６ＲＴＦ / ｈｒｐＢ６ＲＴＲ ＡＡＧＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣ / ＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣ １５９
ｈｒｐＣ１ＲＴＦ / ｈｒｐＣ１ＲＴＲ ＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＣＧ / ＡＡＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＡＴＣＣＴＧ １３０
ｈｒｐＦＲＴＦ / ｈｒｐＦＲＴＲ ＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＣＴＡＡＡＣＣＡＧ / ＴＧＣＴＣＡＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＧＴＣＧ １５６
　
质粒 ｐＬ３ｓｐｏＴＸｃｃꎮ 通过三亲本接合将 ｐＬ３ｓｐｏＴＸｃｃ
导入突变体 ＮＫ０９５６ 中ꎬ在含有相应抗生素 Ｒｉｆ、
Ｋｍ和 Ｔｃ的 ＮＹＧＡ平板上筛选三亲本接合子ꎬ选
取 ６ ~ ８ 个接合子ꎬ提取质粒ꎬ用引物 Ｃ０９５６Ｆ /
Ｃ０９５６Ｒ进行 ＰＣＲ验证以及酶切电泳验证ꎬ随机挑
取一个验证正确的阳性克隆进行下一步试验ꎬ并将
验证正确的互补菌株命名为 ＣＮＫ０９５６ꎮ
１.３　 过敏反应(ＨＲ)检测
　 　 过敏反应供试植物为近等基因系辣椒品种
ＥＣＷ￣１０Ｒ(Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ ｃｖ. ＥＣＷ￣１０Ｒ)ꎬ非寄
主辣椒 ＥＣＷ￣１０常用作 Ｘｃｃ检测 ＨＲ反应的供试植
株[２２]ꎮ 辣椒种植约 ２~３个月至成株期后ꎬ选取六至
八叶龄的叶片作为供试植株ꎮ 取待测菌株过夜培养
物离心收集细菌ꎬ弃去上清ꎬ用移液器将残余的培养
基吸干净ꎬ用无菌水重悬菌体ꎬ将菌液稀释至 ＯＤ６００
为 ０.０１ꎻ用针头轻轻使叶片背面破损ꎬ接着将手指垫
在叶片的另一面ꎬ用 １ ｍＬ无针头注射器在破口处压
渗菌液ꎬ将菌液压渗到辣椒叶片背面的叶肉中ꎬ形成
一个肉眼可见的浸润斑ꎬ并且有效控制压渗面积ꎮ
接种后将辣椒苗置于室温并用荧光灯光照ꎬ８ ｈ后每
隔 １~２ ｈ观察并拍照记录过敏反应结果ꎮ
　 　 通过测电导率的方法量化过敏反应(ＨＲ) [２２]ꎮ
将待测菌株的过夜培养菌液稀释至 ＯＤ６００ ＝ ０.０１ꎬ
将菌液压渗至辣椒 ＥＣＷ￣１０Ｒ 叶片背面的叶肉中ꎬ
接种后将辣椒苗放在室温并用荧光灯照耀ꎬ分别在
压渗后 ８、１６ 和 ２４ ｈ 取各菌株的压渗叶片放入超
纯水中ꎬ超声波除去气泡ꎬ测电导率ꎮ 以压渗
ｄｄＨ２Ｏ叶片测得的电导率为负对照ꎬ观察并记录野
生型菌株和突变体菌株的电导率ꎮ
１.４　 半定量ＲＴ￣ＰＣＲ(Ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ)
　 　 采用 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司的 ＳＶ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ提取 Ｘｃｃ菌株的总 ＲＮＡꎬ经过消化去除
总 ＤＮＡ后ꎬ用 Ｉｎｖｅｒｔｒｏｎ公司的 ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ第一链
合成试剂盒将 ＲＮＡ 反转录成 ｃＤＮＡꎬ以 ｃＤＮＡ 为
模板ꎬ以 １６Ｓ ｒＲＮＡ为内参基因校正待测样品模板
量一致ꎬ选择目的基因 ＯＲＦ 内部 ２００ ｂｐ 左右的片
段为 ＰＣＲ产物ꎬ同样条件下对目的基因进行常规
ＰＣＲ扩增反应ꎮ 用琼脂糖凝胶电泳分析目的基因
表达量的差异ꎮ
１.５　 ＧＵＳ(β￣葡糖苷酸酶)活性检测
１.５.１　 标准曲线的绘制　 配制不同浓度的对硝基
苯酚(ｐ￣Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ)ꎬ于 ４１５ ｎｍ 波长处检测吸光
值ꎬ以浓度(ｍｇ / ｍＬ)做横坐标ꎬＯＤ４１５做纵坐标ꎬ绘
制标准曲线ꎬ每个浓度做 ３个重复ꎮ
　 　 将待测菌株接种至含有适当浓度抗生素的
ＮＹＧＢ 培养基中培养过夜ꎬ调节各待测菌株浓度
ＯＤ６００一致ꎬ按 １０％的接菌量将各待测菌株转接至
ＭＭＸ液体培养基中ꎬ２８℃摇床培养 ３６ ｈ 后ꎬ取 ２
ｍＬ待测菌液到比色杯中ꎬ相应的液体培养基作为
空白对照ꎬ测 ＯＤ６００值ꎻ取 １ ｍＬ 测过 ＯＤ６００值的菌
液至 １.５ ｍＬ的 ＥＰ管ꎬ每管加入 ４０ μＬ 甲苯ꎬ振荡
７ ｍｉｎꎻ取出 １２５ μＬ振荡后的菌液至 １.５ ｍＬ 的 ＥＰ
管ꎬ加入 ３７５ μＬ ＧＵＳ 反应液ꎬ混匀ꎬ３７℃水浴反应
１０ ｍｉｎꎻ反应结束后加入 ２００ μＬ ＧＵＳ 反应终止液ꎬ
混匀ꎬ１２ ０００ ｒｐｍꎬ离心 ５ ｍｉｎꎻ取 ５００ μＬ 上清液测
ＯＤ４１５值ꎬ对照是培养基加相应体积的各溶液ꎮ
０３

　
　 １期 刘国芳ꎬ等:十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 ｓｐｏＴＸｃｃ对 Ｔ３ＳＳ基因调控作用的分析
１.５.２　 酶活性定义　 在 ＯＤ６００为 １ 时ꎬ每毫升菌液
每分钟水解对硝基苯酚葡糖苷酸ꎬ产生 １ ｍｇ 对硝
基苯酚的量为一个酶活性单位ꎮ 酶活性计算公式:
　 　 β￣葡糖苷酸酶活性 ( ｍｇ / ｍｉｎ × ＯＤ６００ ) ＝
(ＯＤ４１５－ａ)×０.５ / (ｂ×１０×０.１２５×ＯＤ６００)
　 　 其中ꎬａ、ｂ 是标准曲线中的系数ꎬ反应时间为
１０ ｍｉｎꎬ酶反应体积为 ０.５ ｍＬꎬ反应菌液量是 ０.１２５
ｍＬꎬＯＤ６００是所测菌株的菌液在波长 ６００ ｎｍ 处测
定的光吸收值ꎮ 使用统计分析软件 ＳＰＳＳ ２１.０(ｈｔ￣
ｔｐ: / / ｓｐｓｓ.ｅｎ.ｓｏｆｔｏｎｉｃ.ｃｏｍ / )进行 ｓｔｕｄｅｎｔ’ ｓ ｔ ｔｅｓｔ处
理ꎬ对比相应基因在 Ｘｃｃ ８００４ 和 ＮＫ０９５６ 之间的
表达差异ꎮ
１.６　 原位组织染色
　 　 所用的试验植株是满身红萝卜 ( Ｒａｐｈａｎｕｓ
ｓａｔｉｖｕｓ ｖａｒ. ｒａｄｉｃｕｌｕｓ)ꎬ萝卜苗温室生长约 ２５ ｄ 左
右达到 ４~５叶期ꎬ即可用于试验ꎮ
　 　 将 Ｘｃｃ 待测菌株摇瓶过夜培养ꎬ调节菌液
ＯＤ６００至 １.０ꎻ将调好浓度的菌液用剪叶法接种至寄
主植物满身红萝卜的叶片ꎬ接种后的寄主植物置温
度为 ２８℃ꎬ相对湿度为 ７０％ꎬ光照时间为 １２ ｈ / ｄ的
温室中ꎬ分批诱导 ５ ｄ 和 ７ ｄꎻ诱导后ꎬ从植株上回
收接种的叶片ꎬ将叶片浸泡于 ２００ ｍＬ ＧＵＳ组织染
色缓冲液中ꎬ３７℃培养箱放置 ２４ ｈꎻ用 ７０％乙醇
(或异丙醇)漂洗浸泡叶片数天ꎬ期间更换新的
７０％乙醇以除去叶绿素ꎬ观察结果并照相ꎮ ＧＵＳ
组织染色缓冲液[Ｎａ３ ＰＯ４( ｐＨ ７.０) １００ ｍｍｏｌ / Ｌ、
Ｔｒｉｔｏｎ￣Ｘ￣１００ ０.１％、ＥＤＴＡ １０ ｍｍｏｌ / Ｌ、Ｘ￣ｇｌｕｃ ０.５
ｍｇ / ｍＬ、二甲基亚砜 １％]ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ｓｐｏＴＸｃｃ基因的生物信息学分析
　 　 根据 Ｘｃｃ ８００４ 基因组注释[９]ꎬ基因 ＸＣ＿０９５６
编码一个 ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ￣３′￣ｐｙｒｏｐｈｏｓ￣
ｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ(ＳｐｏＴＸｃｃ)ꎮ ｓｐｏＴＸｃｃ基因全长为 ２ １７２
ｂｐꎬ位于基因组的 １ １５１ １４６ ｂｐ ~ １ １４８ ９７５ ｂｐꎬ转
录方向为反方向ꎮ 其编码蛋白包含 ４个结构域ꎬ从
Ｎ端到 Ｃ 端分别是(ｐ)ｐｐＧｐｐ 水解酶结构域 ＨＤꎬ
其负责将胞内(ｐ)ｐｐＧｐｐ水解为 ＧＴＰ或者 ＧＤＰ和
焦磷酸ꎻ(ｐ) ｐｐＧｐｐ 合成酶结构域 ＲｅｌＡ＿ＳｐｏＴꎬ其
负责在应急环境中将胞内的 ＧＴＰ 和 ＡＴＰ 合成
(ｐ)ｐｐＧｐｐꎻＣ末端的 ＴＧＳ和 ＡＣＴ结构域主要是感
受外界信号的刺激ꎬ起调节酶活性的作用(图 １￣Ａ)ꎻ
Ｆｉｇ. １　 Ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ (ＳｐｏＴ￣Ｘｃｃ)ꎬ Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ (ＳｐｏＴ￣Ｖ. ｃｈｏｌｅｒａｅ) ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ (ＳｐｏＴ￣Ｅ. ｃｏｌｉ)
Ａ: Ｄｏｍａｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳｐｏＴ￣Ｘｃｃꎬ ＳｐｏＴ￣Ｖ. ｃｈｏｌｅｒａｅ ａｎｄ ＳｐｏＴ￣Ｅ. ｃｏｌｉ. ＨＤ: (ｐ)ｐｐＧｐｐ ｈｙｄｒｏｌａｓｅꎻ
ＲｅｌＡ＿ＳｐｏＴ: (ｐ)ｐｐＧｐｐ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅꎻ ＴＧＳ: Ｎａｍｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｒｅｏｙｌ￣ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅꎬ ＧＴＰａｓｅｓ ａｎｄ ＳｐｏＴ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎻ
ＡＣＴ:Ｎｎａｍｅｄ ａｆｔｅｒ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅꎬ ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ ａｎｄ ＴｙｒＲ ｐｒｏｔｅｉｎｓ.
Ｂ: ＨＤ＿４ ｄｏｍａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｆｒｏｍ ＨＤ＿４￣Ｅ. ｃｏｌｉꎬ ＨＤ＿４￣Ｖ. ｃｈｏｌｅｒａｅ ａｎｄ ＨＤ＿４￣Ｘｃｃ.
１３

　
植物病理学报 ４６卷
氨基酸序列同源性分析发现ꎬＸｃｃ ８００４ 的 ＳｐｏＴＸｃｃ
酶和大肠杆菌、霍乱弧菌 ＳｐｏＴ 酶的氨基酸序列的
相似性分别是 ４５.９％和 ４５.５％ꎬ其中 ＨＤ＿４(水解
酶)结构域的相似性分别达到 ６６. ０％和 ６８. ０％
(图 １￣Ｂ)ꎮ
２.２　 构建 ｓｐｏＴＸｃｃ基因突变体及功能互补菌株
　 　 采用整合突变和三亲本接合的方法ꎬ构建了
ｓｐｏＴＸｃｃ基因的非极性整合突变体 ＮＫ０９５６ꎬ还构建
了突变体 ＮＫ０９５６ 的功能互补菌株 ＣＮＫ０９５６ꎬ具
体操作步骤见 １.２ꎮ
２.３ 　 ｓｐｏＴＸｃｃ基因与 Ｘｃｃ 在非寄主植物上产生
ＨＲ反应相关
　 　 将 Ｘｃｃ ８００４、ＮＫ０９５６、ＣＮＫ０９５６稀释至 ＯＤ６００ ＝
０.０１的菌液及无菌水压渗至辣椒 ＥＣＷ￣１０Ｒ 叶片
上ꎬ８ ｈ后ꎬ每隔 ２ ｈ记录一次观察结果ꎬ并进行电导
率测定ꎮ 结果发现ꎬ接种 ８ ｈ 后ꎬ野生型菌株 Ｘｃｃ
８００４和互补菌株 ＣＮＫ０９５６的辣椒叶片接种部位出
现较弱的组织坏死ꎬ而突变体菌株 ＮＫ０９５６ 的辣椒
叶片接种部位没有出现组织坏死(图 ２￣Ａ)ꎻ１０ ｈ后ꎬ
野生型菌株 Ｘｃｃ ８００４和互补菌株 ＣＮＫ０９５６的辣椒
叶片接种部位出现明显的组织坏死ꎬ而突变体
ＮＫ０９５６的辣椒叶片接种部位出现较弱的组织坏死ꎻ
１２ ｈ后ꎬ野生型菌株 Ｘｃｃ ８００４、突变体菌株 ＮＫ０９５６
和互补菌株 ＣＮＫ０９５６ 的接种部位出现明显的组织
坏死ꎬ而接种无菌水的部位则无明显的变化(图 ２￣
Ａ)ꎮ 这一结果与电导率测定的结果(图 ２￣Ｂ)一致ꎮ
对过敏反应(ＨＲ)的量化采用测电导率的方法[２２]ꎮ
压渗有不同菌株的叶片、出现坏死斑较晚的叶片ꎬ其
电导率测出的值较低ꎬ相对应的菌株延迟或者减弱
了 ＨＲ反应的出现ꎮ 这些结果说明ꎬｓｐｏＴＸｃｃ基因突
变后ꎬ延迟和减弱了 Ｘｃｃ 在非寄主植物辣椒上 ＨＲ
反应的出现ꎬ互补菌株 ＣＮＫ０９５６能恢复这一表型至
野生型菌株 Ｘｃｃ ８００４水平ꎮ 此外ꎬ还发现将 ｓｐｏＴＸｃｃ
基因突变后ꎬ突变体菌株 ＮＫ０９５６ 在寄主植物上的
致病力降低(数据未显示)ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ(ＨＲ) ａｓｓａｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ Ｘｃｃ ８００４ꎬＮＫ０９５６ ａｎｄ ＣＮＫ０９５６ ｏｎ ｎｏｎ￣ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔ
Ａ: ＨＲ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｎ ｎｏｎ￣ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔ ｐｅｐｐｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ Ｘ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓꎻ
Ｂ: Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｌｅａｋａｇｅ ｆｒｏｍ ｐｅｐｐｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｘ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ.
２３

　
　 １期 刘国芳ꎬ等:十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 ｓｐｏＴＸｃｃ对 Ｔ３ＳＳ基因调控作用的分析
２.４ 　 ｈｒｐ 基因簇报告质粒在基本培养基中的
ＧＵＳ活性及半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ结果分析
　 　 Ｘｃｃ在非寄主植物上引起 ＨＲ反应受 ｈｒｐ基因
簇调控ꎬ并且 ｈｒｐ基因与 Ｘｃｃ在寄主植物上的致病
性相关ꎬ而 ｈｒｐ基因簇的表达又受到 ２ 个非常关键
的基因 ｈｒｐＧ 和 ｈｒｐＸ 调控ꎮ 为了进一步研究
ｓｐｏＴＸｃｃ基因突变体 ＨＲ 反应延迟和致病力降低是
否是因为影响了 ｈｒｐ基因簇的表达ꎬ比较了 ｈｒｐ 基
因在突变体和野生型菌株中的表达情况ꎮ 将 ｈｒ￣
ｐＧ、ｈｒｐＸ、ｈｒｐＡ、ｈｒｐＢ、ｈｒｐＣ、ｈｒｐＤ、ｈｒｐＥ 和 ｈｒｐＦ 的
ＧＵＳ报告质粒通过三亲本接合的方法分别导入到
野生型菌株 Ｘｃｃ ８００４ 和 ｓｐｏＴＸｃｃ基因整合突变体
ＮＫ０９５６中ꎬ在ＭＭＸ基本培养基中检测 ＧＵＳ活性
表达ꎮ 统计学分析表明ꎬ报告质粒 ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳ
在野生型菌株 Ｘｃｃ ８００４ 和突变体菌株 ＮＫ０９５６ 中
的 ＧＵＳ 活 性 没 有 明 显 差 异ꎬ 而 报 告 质 粒
ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳ、 ｐＬ６ｈｒｐＢＧＵＳ、 ｐＬ６ｈｒｐＣＧＵＳ、
ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳ 在突变体菌株 ＮＫ０９５６ 背景下的
ＧＵＳ活性极显著低于野生型菌株 Ｘｃｃ ８００４背景下
的 ＧＵＳ 活性 ( Ｐ ＝ ０. ０１ꎬ ｔ ｔｅｓｔ)ꎻ ｐＬ６ｈｒｐＡＧＵＳ、
ｐＬ６ｈｒｐＤＧＵＳ、ｐＬ６ｈｒｐＥＧＵＳ 在突变体 ＮＫ０９５６ 背
景下的 ＧＵＳ 活性显著低于野生型菌株 Ｘｃｃ ８００４
背景下的 ＧＵＳ活性(Ｐ＝０.０５ꎬｔ ｔｅｓｔ)(图 ３￣Ａ)ꎮ 半
定量 ＲＴ￣ＰＣＲ的结果(图 ３￣Ｂ)与 ＧＵＳ活性检测结
果基本一致ꎮ 这一结果说明 ｓｐｏＴＸｃｃ基因与 ｈｒｐ 基
因簇的基因 ｈｒｐＸ、ｈｒｐＡ、ｈｒｐＢ、ｈｒｐＣ、ｈｒｐＤ、ｈｒｐＥ 和
ｈｒｐＦ呈正调控关系ꎬ而与 ｈｒｐＧ不存在明显的调控
关系ꎮ 这也说明 ｓｐｏＴＸｃｃ基因在ＭＭＸ培养基中ꎬ可
能是通过调控 ｈｒｐＸ的表达来调控 ｈｒｐ 基因簇其他
基因的表达ꎮ
２.５　 ｓｐｏＴＸｃｃ基因在植物中正调控 ｈｒｐ 基因簇基
因的表达
　 　 为研究 ｓｐｏＴＸｃｃ基因是否在细菌侵染植物过程
中正调控 ｈｒｐ基因簇基因的表达ꎬ以 ｈｒｐＧ、ｈｒｐＸ 和
ｈｒｐＦ作为 ｈｒｐ 基因簇的代表ꎬ检测了报告质粒
ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳ、ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳ 和 ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳ 在植
物中 的 ＧＵＳ 活 性 表 达ꎮ 将 含 有 报 告 质 粒
ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳ、ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳ 和 ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳ 的野
生型菌株 Ｘｃｃ ８００４和 ｓｐｏＴＸｃｃ基因整合突变体菌株
ＮＫ０９５６ꎬ接种至含有相应抗生素的 １０ ｍＬ ＮＹＧＢ
培养基中ꎬ２８℃、２００ ｒｐｍ 摇床培养过夜ꎬ调节待测
菌株的过夜培养物浓度 ＯＤ６００ ＝ １.０ꎬ用剪叶接种的
方法将待测菌株接种至寄主植物满身红萝卜叶片
上ꎬ分批诱导 ５ ｄ和 ７ ｄꎬ进行组织染色ꎮ 结果表明ꎬ
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｘｃｃ ８００４ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｏＴＸｃｃ ｍｕｔａｎｔ
Ａ: ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅａｃｈ ｈｒｐ ｇｅｎｅ’ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｇｕｓＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｉｎ Ｘｃｃ ８００４ ａｎｄ ＮＫ０９５６.
Ｂ: Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｘｃｃ ８００４ ａｎｄ ＮＫ０９５６ ｂｙ Ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ. Ａ ｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ
ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＳＰＳＳ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘｃｃ ８００４ ａｎｄ ＮＫ０９５６.
３３

　
植物病理学报 ４６卷
Ｆｉｇ. ４　 ｓｐｏＴＸｃｃ ｇｅｎｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔ
Ｘｃｃ ｓｔｒａｉｎｓ ８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳꎬ ８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳꎬ ８００４ / ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳꎬ ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳꎬ ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳ
ａｎｄ ＮＫ０９５６ / ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＮＹＧＢ ｍｅｄｉｕｍ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ａｎｄ ｒｅｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｔｏ ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ
ａｔ ＯＤ６００ ＝ １.０ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅｓ ｒａｄｉｓｈ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ｌｅａｆ ｃｌｉｐｐｉｎｇ. Ａｔ ５ ｄａｙｓ ａｎｄ ７ ｄａｙｓ ｐｏｓｔｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎬ
ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ. β￣Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ (ＧＵＳ) ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ.
Ａ:Ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ５ ｄａｙｓ ｐｏｓｔｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. Ｂ:Ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ７ ｄａｙｓ ｐｏｓｔｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
接种含有报告质粒 ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳ、ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳ 和
ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳ的野生型菌株 Ｘｃｃ ８００４ 的叶片显示
深蓝色ꎬ 而接种含有报告质粒 ｐＬ６ｈｒｐＧＧＵＳ、
ｐＬ６ｈｒｐＸＧＵＳ 和 ｐＬ６ｈｒｐＦＧＵＳ 的 突 变 体 菌 株
ＮＫ０９５６的叶片显示淡蓝色或无蓝色(图 ４)ꎮ 这
些结果说明ꎬｓｐｏＴＸｃｃ基因在植物体内正调控 ｈｒｐ 基
因簇基因的表达ꎬｓｐｏＴＸｃｃ基因可能是通过正向调控
ｈｒｐＧ的表达来调控 ｈｒｐＸ 的表达ꎬ进而调控 Ｔ３ＳＳ
其他 ｈｒｐ基因的表达ꎮ
３　 讨论
　 　 十字花科黑腐病菌 Ｘｃｃ ８００４ 全基因组中拥有
一个注释为与应急反应相关的基因 ｓｐｏＴＸｃｃ [９]ꎮ 本
研究通过构建 ｓｐｏＴＸｃｃ基因的非极性整合突变体对
该基因的功能进行了初步研究ꎬ试验结果表明
ｓｐｏＴＸｃｃ基因与 Ｘｃｃ在非寄主植物辣椒 ＥＣＷ￣１０Ｒ上
ＨＲ反应的产生相关ꎬ而 Ｔ３ＳＳ 的组分绝大多数是
由 ｈｒｐ 基因编码的[２３ꎬ ２４]ꎬ受到 ＨｒｐＧ / ＨｒｐＸ 的调
控ꎬｈｒｐ 基因与病原菌在易感染植物上的致病、抗
性寄主植物和非寄主植物上的 ＨＲ 反应相关[２５]ꎮ
为此ꎬ通过 ＧＵＳ活性检测、原位组织染色和半定量
ＲＴ￣ＰＣＲ 的方法ꎬ研究了十字花科黑腐病菌 Ｘｃｃ
８００４中 ｓｐｏＴＸｃｃ基因与 ｈｒｐ 基因(ｈｒｐＧ、ｈｒｐＸ、ｈｒｐＡ￣
ｈｒｐＦ)的调控关系ꎮ 本研究发现ꎬ在基本培养基
ＭＭＸ中的 ＧＵＳ活性检测和半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 的结
果显示ꎬ ｈｒｐＧ 基因在 ｓｐｏＴＸｃｃ 基因整合突变体
ＮＫ０９５６中的表达与野生型菌株 Ｘｃｃ ８００４ 中的表
达没有明显的差异ꎻ而 ｈｒｐＸ、 ｈｒｐＡ、 ｈｒｐＢ、 ｈｒｐＣ、
ｈｒｐＤ、ｈｒｐＥ和 ｈｒｐＦ基因在 ｓｐｏＴＸｃｃ基因整合突变体
ＮＫ０９５６ 中的表达明显低于在野生型菌株 Ｘｃｃ
４３

　
　 １期 刘国芳ꎬ等:十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 ｓｐｏＴＸｃｃ对 Ｔ３ＳＳ基因调控作用的分析
８００４背景中的表达ꎮ 原位组织染色的结果显示:
在植物体内ꎬｈｒｐＧ、ｈｒｐＸ 和 ｈｒｐＦ 在 ｓｐｏＴＸｃｃ基因突
变体 ＮＫ０９５６背景中的表达明显低于野生型菌株
Ｘｃｃ ８００４背景中的表达ꎮ 本研究结果显示在十字
花科黑腐病菌中ꎬｓｐｏＴＸｃｃ基因是在转录水平调控
Ｔ３ＳＳ相关基因ꎻ在基本培养基 ＭＭＸ 中ꎬｓｐｏＴＸｃｃ基
因是通过调控 ｈｒｐＸ的转录来调控其他 ｈｒｐ 基因的
转录ꎬ而在植物体内ꎬｓｐｏＴＸｃｃ基因是通过调控 ｈｒｐＧ
基因的转录来调控 ｈｒｐＸ 基因的转录ꎬ进而来调控
其它 ｈｒｐ基因ꎮ 我们还发现ꎬｓｐｏＴＸｃｃ基因在基本培
养基 ＭＭＸ和植物体内对 Ｔ３ＳＳ 的调控模式有差
异ꎮ 虽然基本培养基 ＭＭＸ 被用来模拟 Ｘｃｃ 寄主
植物体内环境ꎬ但是植物体内的环境和细胞组成成
分比 ＭＭＸ培养基复杂的多ꎬ推测可能由于植物体
内环境的复杂性造成 ｓｐｏＴＸｃｃ基因在基本培养基
ＭＭＸ和植物体内对 Ｔ３ＳＳ相关基因 ｈｒｐ 的调控模
式不同ꎬ其机制值得进一步深入研究ꎮ
　 　 本研究对 Ｘｃｃ ８００４菌株的应急反应相关基因
ｓｐｏＴＸｃｃ做了功能分析ꎬ首次对黄单胞菌的 ｓｐｏＴＸｃｃ基
因与 Ｔ３ＳＳ相关基因的调控关系进行了报道ꎬ为黄
单胞菌属应急反应系统与致病系统关系的研究奠
定了一定的基础ꎮ
致谢: 本 研 究 由 国 家 “ ９７３ ” 计 划 项 目
(２０１１ＣＢ１００７０１)和公益性行业(农业)科
研专项(２０１３０３０１５)提供资助ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｚｈｕ Ｙ Ｘꎬ Ｌｉ Ｙ. Ｍｏｄｅｒｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ( ２ｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ) ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｍ] . Ｂｅｉｊｉｎｇ: Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａ￣
ｔｉｏｎ Ｐｒｅｓｓ (北京:高等教育出版社)ꎬ ２００２. １９８－１９９.
[２] 　 Ｃａｓｈｅｌ Ｍꎬ Ｇｅｎｔｒｙ Ｄ Ｒꎬ Ｈｅｒｎａｎｄｅｓ Ｖ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ
ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ [Ａ] . Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ Ｆ Ｃ. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ. Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕ￣
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ [Ｃ] . Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎꎬ ＤＣ: Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９６. １４５８－１４９６.
[３] 　 Ｗｕ Ｊꎬ Ｘｉｅ Ｊ Ｐ. Ｍａｇｉｃ ｓｐｏｔ: (ｐ) ｐｐＧｐｐ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ ２２０(２): ２９７－３０２.
[４] 　 Ｍｉｔｔｅｎｈｕｂｅｒ Ｇ. Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ( ｐ ) ｐｐＧｐｐ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ /
ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ( ｔｈｅ Ｒｅｌꎬ ＲｅｌＡ ａｎｄ ＳｐｏＴ ｐｒｏｔｅｉｎｓ) [ Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ
２００１ꎬ ３: ５８５－６００.
[５] 　 Ｏｓｔｌｉｎｇ Ｊꎬ Ｈｏｌｍｑｕｉｓｔ Ｌꎬ Ｋｊｅｌｌｅｂｅｒｇ Ｓ. Ｇｌｏｂａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ａ ｍａｒｉｎｅ Ｖｉｂｒｉｏ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｒｅｌＡ
ａｎｄ ｓｐｏＴ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９９６ꎬ １７８:
４９０１－４９０８.
[６] 　 Ｖｉｎｅｌｌａ Ｄꎬ Ａｌｂｒｅｃｈｔ Ｃꎬ Ｃａｓｈｅｌ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｒｏｎ
ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ＳｐｏＴ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｐＧｐｐ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣
ｇｙꎬ ２００５ꎬ ５６(４): ９５８－９７０.
[７] 　 Ｓｅｙｆｚａｄｅｈ Ｍꎬ Ｋｅｅｎｅｒ Ｊꎬ Ｎｏｍｕｒａ Ｍ. ｓｐｏＴ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｔｏ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ [ Ｊ ] .
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａꎬ １９９３ꎬ ９０: １１００４ －
１１００８.
[８] 　 Ａｌｖａｒｅｚ Ａ Ｍ. Ｂｌａｃｋ ｒｏｔ ｏｆ ｃｒｕｃｉｆｅｒｓ [Ａ] . Ｓｌｕｓａｒｅｎｋｏ
Ａ Ｊꎬ Ｆｒａｓｅｒ Ｒ Ｓ Ｓꎬ ｖａｎ Ｌｏｏｎ Ｌ Ｃ. Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ [Ｍ] . Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓꎬ
Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ: Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓꎬ ２０００. ２１ －
５２.
[９] 　 Ｑｉａｎ Ｗꎬ Ｊｉａ Ｙꎬ Ｒｅｎ Ｓ Ｘꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ
ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
[Ｊ] . Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ ２００５ꎬ １５(６): ７５７－７６７.
[１０] Ｔａｎｇ Ｄ Ｊꎬ Ｌｉ Ｘ Ｊꎬ Ｈｅ Ｙ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｚｉｎｃ ｕｐｔａｋｅ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ｚｕｒ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕ￣
ｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２００５ꎬ １８ ( ７): ６５２ －
６５８.
[１１] Ｈｅ Ｙ Ｑꎬ Ｚｈａｎｇ Ｌꎬ Ｊｉａｎｇ Ｂ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｔｅｒ￣
ｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｈｏｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ
ａ ｌａｒｇｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ [ Ｊ ] .
Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ ８(２１８): １－２６.
[１２] Ａｌｆａｎｏ Ｊ Ｒꎬ Ｃｏｌｌｍｅｒ Ａ. Ｔｈｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ (Ｈｒｐ) ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ
ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ: ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ
ｈａｒｐｉｎｓꎬ Ａｖｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ａｎｄ ｄｅａｔｈ [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９９７ꎬ １７９(１８): ５６５５－５６６２.
[１３] Ｔａｍｐａｋａｋｉ Ａ Ｐꎬ Ｓｋａｎｄａｌｉｓ Ｎꎬ Ｇａｚｉ Ａ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ.
５３

　
植物病理学报 ４６卷
Ｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ “ｈａｒｐ”: ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｕｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ
ｈｒｐ / ｈｒｃ ｇｅｎｅｓ [Ｊ] . Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ
２０１０ꎬ ４８: ３４７－３７０.
[１４] Ｍａｖｒｏｄｉ Ｄ Ｖꎬ Ｊｏｅ Ａꎬ Ｍａｖｒｏｄｉ Ｏ Ｖꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ
ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｑ８ｒ１￣９６ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ １９３(１): １７７－１８９.
[１５] Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｊ Ｔꎬ Ｙａｏ Ｎ. Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｐｌａｎｔ￣ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ
[Ｊ] . Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ ６(３): ２０１－２１１.
[１６] Ｃａｐｌａｎ Ｊꎬ Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ Ｍꎬ Ｄｉｎｅｓｈ￣Ｋｕｍａｒ Ｓ Ｐ. Ｐｌａｎｔ
ＮＢ￣ＬＲＲ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ: ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｒａｎ￣
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ [ Ｊ] . Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅꎬ
２００８ꎬ ３(３): １２６－１３５.
[１７] Ｌｅｅ Ｍ Ｗꎬ Ｊｅｌｅｎｓｋａ Ｊꎬ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｊ Ｔ. Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｔｈａｔ ｓｅｃｒｅｔｅ ＨｏｐＷ１￣１ [ Ｊ ] .
Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２００８ꎬ ５４(３): ４５２－４６５.
[１８] Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ Ｈ. Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ [Ｍ] .
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒꎬ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ: Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓꎬ １９７２.
[１９] Ｄａｎｉｅｌｓ Ｍ Ｊꎬ Ｂａｒｂｅｒ Ｃ Ｅꎬ Ｔｕｒｎｅｒ Ｐ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ
ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂｒｏａｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ
ｃｏｓｍｉｄ ｐＬＡＦＲ１ [Ｊ] . ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ １９８４ꎬ ３: ３３２３－
３３２８.
[２０] Ｄａｎｉｅｌｓ Ｍ Ｊꎬ Ｂａｒｂｅｒ Ｃ Ｅꎬ Ｔｕｒｎｅｒ Ｐ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐａｔｈｏｖａｒ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ａｌｔｅｒｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９８４ꎬ １３０: ２４４７－２４５５.
[２１] Ｗｉｎｄｇａｓｓｅｎ Ｍꎬ Ｕｒｂａｎ Ａꎬ Ｊａｅｇｅｒ Ｋ Ｅ. Ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅ
ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ [ Ｊ] . ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓꎬ ２０００ꎬ １９３(２): ２０１－２０５.
[２２] Ｃａｓｔａñｅｄａ Ａꎬ Ｒｅｄｄｙ Ｊ Ｄꎬ Ｅｌ￣Ｙａｃｏｕｂｉ Ｂꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｌｌ ｅｉｇｈｔ ａｖｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｈａｄ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙꎬ ｂｕｔ ｏｎｅ ａｖｒ ｇｅｎｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｒａｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉ￣
ｔｙ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２００５ꎬ
１８(１２): １３０６－１３１７.
[２３] Ｂüｔｔｎｅｒ Ｄꎬ Ｂｏｎａｓ Ｕ. Ｗｈｏ ｃｏｍｅｓ ｆｉｒｓｔ? Ｈｏｗ ｐｌａｎｔ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ [ Ｊ] .
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ ９(２): １９３－
２００.
[２４] Ｃｏｒｎｅｌｉｓ Ｇ Ｒ. Ｔｈｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎｊｅｃｔｉｓｏｍｅ [ Ｊ] .
Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ ４: ８１１－８２５.
[２５] Ｌｉｎｄｇｒｅｎ Ｐ Ｂ. Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ
ｐｌａｎｔ￣ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ [ Ｊ ] . Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ
Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９９７ꎬ ３５: １２９－１５２.
责任编辑:于金枝
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