全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
!"#$*"!*"!
&修改稿收到日期$
!"#$*"+*#)
基金项目$农业部公益性行业"农业#科研专项"
!"#!"%"!
#&中央级公益性科研院所基本科研业务费专项"
#&%""%!"#!"!&
#&海南大学应用
科技学院基金"
123#+"!
#&海南省应用技术研发与示范推广专项"
4567!"#$"#&
#
作者简介$魏军亚"
#)+(
#!女!博士!主要从事植物分子生物学研究
8*9:.;
$
-
<0
=
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!
#!&,@A9
"
通信作者$刘德兵!博士!副教授!主要从事果树生物技术研究
8*9:.;
$
;B?C.0
D!
#!&,@A9
芒果
10,2$
基因的克隆与表达分析
魏军亚#!唐
!
杰!!刘国银%!刘德兵%"!陈业渊#
"
#
中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所%农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室!海南儋州
$)#)%)
&
!
海南大
学 农学院!海口
$)"!!E
&
%
海南大学 应用科技学院!海南儋州
$)#)%)
#
摘
!
要$
7F5G*CAH
转录因子在多种植物的发育过程(特别是花器官的发育过程中发挥着重要的作用为研究
7F5G*CAH
转录因子在芒果花器官发育中的作用!利用
IJ*KLI
和
IFL8
技术分离到
#
个芒果的
!"##
基因!命
名为
$!"##
"
M?0N:0O
登录号为
3K+"+"+
#
$!"##
编码区为
)%%C
P
!编码
!!%
个氨基酸!蛋白质相对分子质量
为
!$,&O5
!理论等电点为
E,&
序列比对和系统进化树分析表明!
$!"##
具有保守的
7F5G*CAH
及半保守的
3
区!属于
7F5G*CAH
家族
GQL#
%
J7%
亚家族组织特异性表达分析表明!
$!"##
基因在芒果各个组织部位均有
表达!但在茎(叶和花芽中表达量高!而在根和花中表达量低
关键词$芒果&
$!"##
&克隆&表达
中图分类号$
R)E$
&
R)E&
文献标志码$
F
%&"#
(
)!*+
,
-.//#"0)&
1
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3..#4)
(
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1$/
3
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Z
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!
L[.0:
#
07/8-)98
$
7F5G*CAHZY:0/@Y.
P
Z.A0\:@ZAY
P
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P
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P
9?0Z
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P
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D
Z[?
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D
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D
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P
Z.A0\:@*
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9?0Z
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P
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D
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#
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D
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%
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1
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9:0
D
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D
?0?
&
@;A0?
&
D
?0??H
P
Y?//.A0
!!
高等植物开花受一系列内外因素的共同调控! 许多特定基因在特定时空环境下表达及相互作用!
以确保植物在适当的时间和地点发生从营养生长向
生殖生长的转变!从而保证植物在适宜时间开花)#*
开花相关基因的表达和调控是实现这一转变过程的
分子基础!花分生组织特征基因和花器官特征基因
绝大多数都是
7FG5*CAH
类基因)!*
7FG5*CAH
基因是高等植物中一类重要的转录调控因子!参与
植物的生长发育调控和信号传导等多个方面!尤其
在花发育调控中发挥关键作用
!"##
"
GXKKI8G*
GQIQ` Qa8I86KI8GGTQVQ` LQVGJFVG#
#
基因是植物开花途径中控制开花时间的基因!它整
合了光周期途径(春化途径(自主途径和赤霉素途径
等诱导开花途径的各种信号!作用于下游花分生组
织特异基因!促进植物的营养分生组织向花序分生
组织转变!从而促进植物的开花)%*目前已从拟南
芥"
%&()*+
,
-)-./0)1
#(水稻"
"&
2
3-.)4
#(小
麦"
5&).)6789-.)478
#(非洲菊"
:9&(9&/
2
(&)*
#(
甜橙"
#).&7--)191-)-
#(大豆"
:0
2
6)198;
#等)+**多
个物种中克隆到
!"##
基因!研究发现
!"##
基因
除了能整合多种开花信号!还具有其他功能!如控制
一年生拟南芥的生长习性)#"*!参与天气冷凉延迟开
花(温暖气候促进开花的微调)##*等
芒果是重要的热带(亚热带果树!享有+热带果
王,的盛誉!具有很高的经济价值)#!*目前有关于
芒果开花机理的分子生物学研究较少!众多与开花
有关的基因!如
#"
(
<5
(
=<>
(
<=#
(
%?#
等中!仅
对
=<>
)
#%
*和
%?#
)
#+
*基因进行了一些研究为克隆
新的芒果开花有关的
7F5G*CAH
基因!研究其在芒
果花发育中的作用!本研究利用
IJ*KLI
和
IFL8
技术克隆得到
#
个芒果开花调控的重要转录因子
!"##
基因的同源基因
$!"##
的序列全长!进行了
相关生物信息学分析!并研究分析了
$!"##
基因
在芒果植株不同组织部位的表达!以期为从分子水
平上认识芒果成花机理等研究积累资料奠定基础
#
!
材料和方法
$,$
!
试验材料
供试材料吕宋芒"
L:Y:C:A
#采自中国热带农业
科学院热带作物品种资源研究所芒果种质资源圃
于
!"#%
年年
#!
月
#$
日采收吕宋芒花序!用液氮速
冻后!保存在
(E"b
冰箱中备用!作为提取总
IVF
的植物材料!用于基因克隆研究于
!"#+
年
#
月
!"
日分别采收吕宋芒花芽(花以及根(茎(叶等器
官!用液氮速冻后!保存在
(E"b
冰箱保存!用于基
因的组织表达特异性分析
$6<
!
10,2$
基因全长
9=>0
克隆
$6<6$
!
总
?>0
提取及
9=>0
第一链合成
!
参照改
良
LJFN
法)#$*提取吕宋芒花序总
IVF
将提取的
总
IVF
取
%
"
W
在
",Ec
琼脂糖凝胶上电泳检测!
并用紫外分光光度计检测
Q5
值!计算
IVF
浓度
和纯度以
#,"
D
总
IVF
为模板!
Q;.
D
A
"
BJ
#
P
Y.9?Y
为引物!采用
J:3:I:KY.9?G@Y.
P
Z
J7
IJ*
KLI3.Z
试剂盒)宝生物工程"大连#有限公司*合成
@5VF
第一链
$6<6<
!
芒果
10,2$
基因
@AB?0%*
和
CAB?0%*
及
全长的克隆
!
以本实验室前期通过简并引物进行
IJ*KLI
扩增得到一个
7F5G*CAH
基因的保守片
段为依据!分别设计
%d*IFL8
和
$d*IFL8
引物"表
#
#!以上述花序组织反转录的
@5VF
为模板进行
%d*
IFL8
和
$d*IFL8
扩增
IFL8
操作参照
%d*`<;
IFL8LAY?G?Z
试剂盒和
$d*`<; IFL8LAY?G?Z
试剂盒"
J:3:I:
#推荐的方法进行
KLI
反应条件
为
+b
变性
$9.0
后进入循环!循环参数为
+b
变性
+$/
(
$$b
退火
+$/
(
)!b
延伸
!9.0
!
%&
个循
环!
)!b
延伸
#"9.0
根据
$d*IFL8
和
%d*IFL8
测序结果!将
%d*
IFL8
(
$d*IFL8
和已知片段进行拼接获得全长
@5VF
序列!根据拼接序列设计全长特异性引物
GQL#*#
和
GQL#*!
"表
#
#!以花序组织反转录
@5*
VF
第一链为模板进行
KLI
扩增!
KLI
反应条件
为$
+b
预变性
$9.0
(
+b
变性
%"/
(
$$b
退火
+$
/
(
)!b
延伸
#,$9.0
!
%"
个循环&
)!b
延伸
#"9.0
#c
琼脂糖凝胶电泳检测后!切胶回收与
K75#E*J
载体"
J:O:Y:
#连接!转化大肠杆菌
51$
#
!筛选阳性
克隆测序
表
$
!
D%?
扩增所用引物及其序列
J:C;?#
!
KY.9?Y/Y?
_
<.Y?B.0KLI:9
P
;.\.@:Z.A0
引物类型
KY.9?YZ
=P
?
引物名称
KY.9?Y0:9?
引物序列
KY.9?Y/?
_
"
$d
#
%d
#
%d*IFL8
引物
%d*IFL8
P
Y.9?Y/
%*Q MLFFFMFMFFMFFFJMMMLJM
%*T JLJMJJLJJJMJMFJMLJMFMMJ
$d*IFL8
引物
$d*IFL8
P
Y.9?Y/
$*Q JJLLFLLFLFLJJLJLFMLLFMLLJJF
$*T FJMMJFFMMMLFFLLJLFMLFJLFLFF
@5VF
引物
@5VF
P
Y.9?Y/
GQL#*# MMFFJJLMFLFMFFFMFMJJMMMMJM
GQL#*! MLJLJFMFLJFJJJMMLJFMJFMJLFFFFJ
荧光定量
KLI
引物
IJ*KLI
P
Y.9?Y/
F@Z.0I LFJFFFMMMFMFMMFLFM
F@Z.0` LMJFMLFLLFMFFMFFLF
GQL#*% FLFMLMJFFMLFFLFJJLM
GQL#*+ LLFLLFLFLJJLJLFMLLF
%"#
&
期
!!!!!!!!!!!!!!!
魏军亚!等$芒果
$!"##
基因的克隆与表达分析
$,C
!
生物信息学分析
利用
VLNT
的
NWFGJ
工具进行同源分析&利
用
QI`
"
Q
P
?0I?:B.0
D
Y`:9?
!
QI`
#
.`0B?Y
软件
寻找开放阅读框&利用
KYAZK:Y:9
软件"
[ZZ
P
$%%
>?C,?H
P
:/
=
,AY
D
%
P
YAZ
P
:Y:9
%#分析编码蛋白的氨基
酸序列组成(分子量(等电点等理化性质采用
8H*
KFG
=
KYAZK:Y:9
软件分析序列 等 电 点采 用
L;和
7?
D
:
软件进行推导氨基酸序列的多
序列比对和系统进化树构建
$,E
!
基因表达特性分析
采用半定量
IJ*KLI
和实时荧光定量
KLI
检
测
$!"##
基因在不同组织"花芽(花(根(茎和叶#
的表达模式其中!半定量
IJ*KLI
程序为$
+b
预变性
$9.0
&
+b
变性
%"/
!
+$b
退火
+$/
!
)!b
延伸
"/
!
%$
个循环&
)!b
延伸
#"9.0
每个反应
%
次重复!扩增产物用
",Ec
琼脂糖凝胶电泳进行检
测采用
G2NI
$
MY??0
%
嵌合荧光法进行实时定
量
KLI
!反应体系为$
#"
"
WG2NI
$
KY?9.H8H5
@
混合液!正(反向引物各
#
"
W!
"
W@5VF
!加入
BB1
!
Q
补足到
!"
"
W
体系反应程序为
$b
预变
性
%9.0
&然后
$b$/
!
&"b%"/
!共
+"
个循环!
试验以
%6.)1
为内参基因!
%
次重复!($$#.法)#&*计
算不同时间
$!"##
基因相对表达量!应用
8H@?;
进行数据统计分析
!
!
结果与分析
<6$
!
芒果
10,2$
基因克隆与鉴定
以芒果花序
@5VF
为模板!利用
IFL8
方法分
别获得
)EC
P
的
%d
端片段"图
#
!
F
#和
!&EC
P
的
$d
端片段"图
#
!
N
#将得到的
%
段序列"中间序列(
%d
端(
$d
端序列#在
5VF7FV
中进行序列拼接!根据
拼接序列在
QI`
两端设计引物进行
KLI
扩增!得
到
$!"##
基因的
9IVF
全长
QI`
序列"图
#
!
L
#!测序结果显示!该
KLI
产物长度为
)%%C
P
!测
序结果与拼接序列相应片段完全一致
通过
VLNT
的
N;:/ZH
比对!发现该序列与四季
芒"
G.
-
.$1
A
)
B
9&)1*)6W,
#的
!"##
"
M?0N:0O
登录号为
F56)%!+,#
#序列一致性达
c
!其推
导的蛋白序列具有
7F5G
-
78` !
类保守结构域和
3*CAH
结构域!说明所克隆的基因属于典型的
7FG5*CAH
基因因此!初步认为克隆得到了芒果
!"##
基因!将其命名为
$!"##
!
M?0N:0O
登录号
为
3K+"+"+
<6<
!
芒果
10,2$
全长
9=>0
序列及生物信息学
分析
利用
VLNT
在线工具分析芒果
$!"##
的开放
阅读框!发现
$!"##
基因编码区由
&&
个核苷酸
组成!编码
#
个含有
!!%
个氨基酸的蛋白质!起始密
码子为
FJM
!终止密码子为
JMF
!且含有加尾信号
FFJFFF
序列和
P
A;
=
F
序列"图
!
#通过
VLNT
的
N;:/Z
P
比对发现!
$!"##
基因的
%
&
))
位氨基
酸为典型的
7F5G
结构域!进一步分析发现!
$!"##
基因的第
)$
&
#)"
位氨基酸为一个
3*CAH
结构域利用
8HKFG
=
KYAZK:Y:9
软件分析其理化
性质!推测该蛋白的分子式为
L
##"E
1
#E!E
V
%%!
Q
%+&
G
##
!
相对分子质量为
!$&E,%
!预测其等电点"
P
T
#为
E,&
蛋白由
!"
个氨基酸组成!其中负电荷系数
)"
F/
P
eM;<
#
f%$
*!正电荷系数)"
FY
D
eW
=
/
#
f
%
*!该蛋白中相对含量较多的氨基酸是
M;<
"
8
#
!
占
#%,"c
!
W?<
"
W
#
!!
占
,c
!
FY
D
"
I
#
!#
占
,+c
!
W
=
/
"
3
#
E
占
E,#c
!其中
K
=
;
(
G?@
含量为
"
不稳定系数为
&$,$#
!说明该蛋白是一个不稳定蛋
白"
+"
以下为稳定蛋白#
将
$!"##
基因推导的氨基酸序列和其他物种
GQL#
蛋白的氨基酸序列进行同源比对"图
%
#!结果
发现该氨基酸序列与很多植物
GQL#
蛋白氨基酸序
图
#
!
芒果
$!"##
基因
%d*IFL8
"
F
#!
$d*IFL8
"
N
#和全长
QI`
扩增结果"
L
#
.`
D
,#
!
KLI
P
YAB<@Z/A\%d*IFL8
"
F
#!
$d*IFL8
"
N
#
:0B\<;;?0
D
Z[QI`
"
L
#
A\$!"##
D
?0?
7,5W!"""
+"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
!
!
$!"##
基因核苷酸序列和推测氨基酸序列
带下划线的碱基序列
FJM
表示起始密码子&
"
表示终止密码子
JMF
.`
D
,!
!
@5VF/?
_
:@.B/?
_
J[?0<@;?AZ.B?/?
_
.Z[<0B?Y;.0?B9?:0/
.0.Z.:ZAY@ABA0
&
JMF>.Z[
"
9?:0/Z?Y9.0:ZAY@ABA0
列具有较高的同源性其中与四季芒"
!)
C
)$1D
A
)
B
9&)1*)6
#
GQL#
蛋白氨基酸序列相似性最高!
达
c
&与荔枝"
=).6/)6/)191-)-
#
GQL#
蛋白氨基
酸序列的相似性为
)!c
&和甜橙"
#).&7--)191-)-
#
GQL#
蛋白氨基酸序列的相似性为
)+c
7F5G*CAH
结构域相似性在
E%c
&
#""c
之间!
3*CAH
结构域相
似性在
$#c
&
&$c
之间芒果
7GQL#
在
L
端具有
一个
GQL#
%
J7%
亚家族特有的基序!说明所获得的
7GQL#
属于
7F5G*CAH
基因家族中的
GQL#
%
J7%
亚家族从系统进化树也可以看出"图
+
#!
7GQL#
也与四季芒""
F56)%!+,#
#亲缘关系较近!归属于
7F5G*CAH
基因家族
GQL#
%
J7%
亚家族
<6C
!
芒果
10,2$
基因的器官特异表达分析
用半定量
IJ*KLI
方法分析
$!"##
在芒果不
同组织的表达情况!结果如图
$
所示!
$!"##
基因
在根部(茎部(叶片(花芽和花中均有表达!但是表达
程度不同在叶片中表达强度最高!其次是茎部(花
芽和根!花中表达量最低
为了进一步研究
$!"##
在不同组织器官中的
图
%
!
不同植物
GQL#
氨基酸序列比对
划线部分为
7F5G*CAH
(
3*CAH
结构域
.`
D
,%
!
F;.
D
09?0ZA\:9.0A:@.B/?
_
P
;:0Z/
J[?7F5G*CAH:0B *`CAH:Y?<0B?Y;.0?B
$"#
&
期
!!!!!!!!!!!!!!!
魏军亚!等$芒果
$!"##
基因的克隆与表达分析
图
+
!
芒果与其他物种中
GQL#
蛋白的系统进化树
.`
D
,+
!
K[
=
;A
D
?0?Z.@ZY??A\Z[?B?B<@?B:9.0A:@.B/?
_
D
A:0BAZ[?YB.\\?Y?0Z/
P
?@.?/
图
$
!
$!"##
在芒果不同组织部位的表达
.`
D
,$
!
5.\\?Y?0Z?H
P
Y?//.A0;?^?;/A\$!"##
D
?0?.0B.\\?Y?0ZAY
D
:0/A\$E)1*)6
图
&
!
$!"##
在芒果不同组织部位的相对表达量
.`
D
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基因
具有显著的组织表达特异性尤其在营养器官的
根(茎和叶中特异表达!在花芽中也表达!而花的表
达量最低
%
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讨
!
论
近年来!随着分子生物学的发展!参与调控植物
花器官特征的
7F5G*CAH
基因研究获得了突破性
的进展其中
!"##
作为开花时间调控路径的结点
基因!广泛存在于单子叶植物和双子叶植物中)#)*
!"##
整合了多条开花途径的开花信号!不仅可调
控开花时间!而且也能参与花器官形态建成)#E*
N?@O?Y
等)#*认为
GQL#
主要在营养器官中表达!在
营养器官发育和营养生长向生殖生长转变也起重要
的作用在拟南芥中
!"##
在各个部位均表达!在
茎尖中表达量最高!其表达量随着营养生长的进程
而增加!在成花转变时表达量大量增加!与下游花分
生组织特异基因共同作用完成成花转变)!"*
本研究通过
IJ*KLI
和
IFL8
技术克隆得到
芒果
$!"##
基因!并对其亚家族的分属和表达模
式进行了分析其推导的蛋白序列具有
7F5G
-
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类保守结构域和
3*CAH
结构域!属于典型的
7FG5*CAH
基因!在其
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端具有一个
GQL#
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亚家族特有的基序!系统发育树分析将其属于
7F5G*CAH
基因家族中的
GQL#
%
J7%
亚家族对
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进行不同组织部位的表达分析表明!该基
因在根(茎(叶(花和早期花芽中均有表达!且在根中
表达水平较低!在叶片和茎中表达较高!花芽的表达
量比叶片和茎稍低在拟南芥中!
!"##
基因是调
控植物从营养生长向生殖生长转变的重要基因)!"*!
由此推测芒果
$!"##
基因可能调控芒果花芽分化
前期的表达!在芒果营养生长向生殖生长转变过程
中起着重要作用
!"##
整合了多条开花途径的开花信号!调控
花分生组织的建成目前人们对模式植物拟南芥
!"##
已经有了比较广泛和深入的研究!但是仍然
有许多问题没有研究清楚!本研究得到
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基
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学
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因!为进一步深入研究基因表达模式和功能奠定了
基础下一步将构建
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植物表达载体!进行
转基因技术研究!以期在分子水平上揭示
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基因在芒果调控营养生长向生殖生长转变过程中的
分子机制和作用机理
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