全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(３): ２３２￣２３８(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０８￣２５ꎻ 修回日期: ２０１４￣０２￣１４
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１０６００１７)ꎻ 广西自然科学基金资助项目(２０１０ＧＸＮＳＦＢ０１３０２０)
通讯作者: 姜伯乐ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病原物分子相互作用研究ꎻ Ｔｅｌ:０７７１￣３２３９２５５ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｊｂｌ１９７１＠ｇｘｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 成春燕ꎬ女ꎬ广西南宁人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病原物分子相互作用研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｓｈｅｎｄｉｈａｉｙａｎｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ
一个用于鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物
分泌与转运的报告质粒的构建
成春燕１ꎬ 杨 威１ꎬ 甘永亮１ꎬ 蒋国凤２ꎬ３ꎬ 杨丽超１ꎬ 阳丽艳１ꎬ 姜伯乐１ꎬ２∗
( １广西大学生命科学与技术学院ꎬ 南宁 ５３０００４ꎻ ２ 亚热带农业生物资源保护与
利用国家重点实验室ꎬ 南宁 ５３０００４ꎻ ３ 广西大学林学院ꎬ 南宁 ５３０００４)
摘要:通过免疫检测的方法鉴定十字花科黑腐病菌(Ｘｃｃ)Ⅲ型效应物的分泌和转运ꎬ将 ｃｙａＡ 基因克隆至带有 ３×ＦＬＡＧ 的
ｐＪＸＧ载体上ꎬ构建带有 ３×ＦＬＡＧ和 ｃｙａＡ基因的报告质粒 ｐＪＡＡꎬ并用已鉴定为Ⅲ型效应物的 ＸＣ＿１５５３启动子区信号区验
证该报告质粒ꎮ 将 ｐＪＡＡ１５５３三亲导入 Ｘｃｃ ８００４∗和 ８００４∗ΔｈｒｃＶꎬ然后通过Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫检测 ＸＣ＿１５５３的分泌ꎬ结
果在 ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３的胞外蛋白中检测到了 ＸＣ＿１５５３ 的分泌ꎬ而在 ８００４∗ΔｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３ 的胞外蛋白中没有检测到
ＸＣ＿１５５３的分泌ꎮ 通过免疫反应定量检测 ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３和 ８００４∗ΔｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３侵染后植物体内的 ｃＡＭＰ 含量ꎬ结
果发现 ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３侵染后植物体内的 ｃＡＭＰ含量比 ８００４∗ΔｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３侵染后植物体内的 ｃＡＭＰ含量高 １５倍ꎮ
结果表明ꎬ报告质粒 ｐＪＡＡ能够应用于鉴定十字花科黑腐病菌的Ⅲ型效应物ꎮ
关键词:十字花科黑腐病菌ꎻ Ⅲ型效应物ꎻ ｃｙａＡꎻ ３×ＦＬＡＧꎻ ｐＪＡＡ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｔｙｐｅ Ⅲ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　 ＣＨＥＮＧ Ｃｈｕｎ￣ｙａｎ１ꎬ ＹＡＮＧ
Ｗｅｉ１ꎬ ＧＡＮ Ｙｏｎｇ￣ｌｉａｎｇ１ꎬ ＪＩＡＮＧ Ｇｕｏ￣ｆｅｎｇ２ꎬ３ꎬ ＹＡＮＧ Ｌｉ￣ｃｈａｏ１ꎬ ＹＡＮＧ Ｌｉ￣ｙａｎ１ꎬ ＪＩＡＮＧ Ｂｏ￣ｌｅ１ꎬ２ 　 ( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ
ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｏ￣ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ
５３０００４ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｐｅ Ⅲ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ.
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ (Ｘｃｃ) ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄꎬ ｔｈｅ ｃｙａＡ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｔｏ ｐＪＸＧ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ３×ＦＬＡＧꎬ
ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＪＡＡ ｃａｒｒｙｉｎｇ ３×ＦＬＡＧ ａｎｄ ｃｙａＡ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ. Ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＸＣ＿１５５３ꎬ ａ ｋｎｏｗｎ ｔｙｐｅ Ⅲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｉｎ Ｘｃｃ. Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＪＡＡ１５５３ ｗａｓ
ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ Ｘｃｃ ８００４∗ ａｎｄ ８００４∗ΔｈｒｃＶ. Ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＸＣ＿１５５３ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ. Ａｓ
ａ ｒｅｓｕｌｔꎬ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＸＣ＿１５５３ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３ꎬ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ８００４∗
ΔｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３. Ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＸＣ＿１５５３ꎬ ｔｈｅ ｃＡＭＰ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｘｃｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ. Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＡＭＰ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３ ｗａｓ １５ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ
ｔｈａｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ８００４∗ΔｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３. Ｔｏ ｓｕｍ ｕｐꎬ ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＪＡＡ ｃａｎ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ
ｔｈｅ ｔｙｐｅ Ⅲ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓꎻ ｔｙｐｅ Ⅲ ｅｆｆｅｃｔｏｒꎻ ｃｙａＡꎻ ３×ＦＬＡＧꎻ ｐＪＡＡ
中图分类号: Ｑ７８２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０３￣０２３２￣０７
　
　 ３期 成春燕ꎬ等:一个用于鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物分泌与转运的报告质粒的构建
　 　 十字花科黑腐病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓꎬ简称 Ｘｃｃ)是一种重要的植物病原
菌ꎬ能在全球范围内侵染所有的十字花科植
物[１ꎬ２]ꎮ 作为 Ｘｃｃ致病因子之一ꎬⅢ型效应物通过
Ｔ３ＳＳ直接注入到寄主细胞内ꎬ通过干扰或调节寄
主的正常生理活动ꎬ从而引起寄主局部或系统抗性
反应[３ꎬ４]ꎮ
效应物的检测方法分为体内( ｉｎ ｖｉｖｏ)和体外
( ｉｎ ｖｉｔｒｏ)２ 种ꎮ 体内检测是利用病原菌在非寄主
或抗性寄主的植物组织上诱发过敏反应(ＨＲ 反
应)或者是利用免疫化学标记方法鉴定效应物的
转运ꎮ 据报道ꎬ无毒蛋白结构域 ＡｖｒＢｓ１５９~４４４在含
有抗性基因 Ｂｓ１ 的辣椒 ＥＣＷ￣１０Ｒ 上引起特异、快
速的 ＨＲ反应[５]ꎬ到目前为止ꎬ在 Ｘｃｃ ８００４ 中利用
ＡｖｒＢｓ１５９~４４４作为报告蛋白ꎬ总共鉴定了 １２ 个Ⅲ型
效应物ꎬ它们的编码基因为 ＸＣ ＿ ００５２[６]、 ＸＣ ＿
０２４１[７]、ＸＣ ＿ １５５３[８]、ＸＣ ＿ ２００４、ＸＣ ＿ ２０８１、ＸＣ ＿
２６０２[９]、ＸＣ＿２９９４、ＸＣ＿２９９５、ＸＣ＿３１６０、ＸＣ＿３１７７、
ＸＣ＿３８０２以及 ＸＣ＿４２７３[１０]ꎮ 通过 ＨＲ反应并不能
定量检测Ⅲ型效应物ꎬ并且无法确定控制的序列定
位(胞内和胞外)在哪里ꎮ 另一种体内检测Ⅲ型效
应物的方法是利用百日咳博德特氏菌(Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ)依赖于钙调素的腺苷酸环化酶(ＣｙａＡ)
结构域作为报告信号[１１]ꎬ这种体内检测手段更方
便、灵敏、且能定量检测ꎬ２００２ 年 Ｃａｔｈａｒｉｎａ Ｃａｓｐｅｒ￣
Ｌｉｎｄｌｅｙ等[１２]在黄单胞菌中首次利用该蛋白成功
鉴定出新的Ⅲ型效应物ꎮ 随后ꎬ这个报告系统广泛
应用于研究植物病原菌的Ⅲ型效应物的转运与分
泌ꎮ 目前在 Ｘ. ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ、 Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏ￣
ｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＧＭＩ１０００ 和 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ 中ꎬ
利用这个报告系统已经鉴定出一批效应物[１３~１５]ꎮ
体外检测方法鉴定Ⅲ型效应物分泌[１６]ꎬ就是将候
选效应物基因克隆到表达载体上ꎬ表达的蛋白为融
合蛋白ꎬ带有一个很小的标签(ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇ)比如 ３×
ＦＬＡＧꎬ在离体培养的条件下ꎬ利用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
检测培养物中目标蛋白的存在ꎮ 大多数Ⅲ型效应
物的体外分泌量很低[１７]ꎬ利用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 体
外检测Ⅲ型效应物可以减少受这种信号检测的限
制ꎮ 对比以上 ３ 种效应物检测方法的特点ꎬ更快
捷、灵敏度更高的是以 ＣｙａＡ和 ３×ＦＬＡＧ作为报告
蛋白的检测方法ꎮ 迄今为止ꎬ未见同时利用 ＣｙａＡ
和 ３×ＦＬＡＧ作为报告蛋白检测 Ｘｃｃ Ⅲ型效应物分
泌和转运的报道ꎮ 由于 ３×ＦＬＡＧ 只能用于检测效
应物分泌ꎬＣｙａＡ 只能用于检测效应物转运ꎬ因此
需耦合这 ２ 种方法鉴定Ⅲ型效应物分泌和转运ꎮ
本文将 ｃｙａＡ 基因克隆至带有 ３×ＦＬＡＧ 标签的报
告质粒 ｐＪＸＧ上ꎬ构建了一个可用于体内体外鉴定
Ⅲ型效应物转运的报告质粒ꎬ用已确定为Ⅲ型效应
物的 ＸＣ＿１５５３ 的启动子信号区验证该报告质粒ꎬ
确认其工作正常ꎬ可用于体内体外鉴定 Ｘｃｃ ８００４
的Ⅲ型效应物ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 菌株、质粒及培养条件
　 　 所用菌株、质粒见表 １ꎮ 大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ) 培养基 ＬＢ ( Ｌｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ )ꎬ培养温度
３７℃ [１８]ꎻ十字花科黑腐病菌培养基 ＮＹＧ(Ｎｕｔｒｉｅｎｔ
Ｙｅａｓｔ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ)ꎬ培养温度 ２８℃ [１９]ꎮ 抗生素利福
平(ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎꎬＲｉｆ) ５０ ｍｇ / Ｌꎬ氨苄青霉素(Ａｍｐｉ￣
ｃｉｌｌｉｎꎬＡｍｐ) １００ ｍｇ / Ｌꎬ四环素(ＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅꎬＴｃ)
Ｅ. ｃｏｌｉ １５ ｍｇ / Ｌꎬ Ｘｃｃ ５ ｍｇ / Ｌꎬ卡那霉素(Ｋａｎａｍｙ￣
ｃｉｎꎬＫａｎ)２５ μｇ / ｍＬꎮ
１.２　 引物和试剂条件
　 　 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶购自 ＴａＫａＲａ 公司(中国大
连)ꎬＴ４ ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶购自 Ｐｒｏｍｅｇａ
公司(中国上海)ꎬＰＣＲ 产物纯化、质粒纯化试剂盒
和 ＤＮＡ 片段凝胶回收试剂盒均购自华舜公司(中
国上海)ꎬ ３ × ＦＬＡＧ、一抗辣根过氧化物酶标记
山羊抗小鼠 ＩｇＧ (Ｈ＋Ｌ)和 ＢｅｙｏＥＣＬ Ｐｌｕｓ 均购自
Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司(中国上海)ꎮ 根据 ＮＣＢＩ 上提供的
百日咳杆菌腺苷酸环化酶基因的核苷酸序列ꎬ按照
实验需要设计出引物 Ｐｒｉｍｅｒ１和 Ｐｒｉｍｅｒ２ꎬ加入酶切
位点 (下划线)及保护碱基ꎬ引物序列:Ｐｒｉｍｅｒ１:
５′￣ｇｇｇｔｃｔａｇａｃａｇｃａａｔｃｇｃａｔｃａｇｇｃｔｇｇｔ￣３′ ꎻ Ｐｒｉｍｅｒ ２ :
５′￣ｇｇｇｃｔｇｃａｇｇｔｃａｔａｇｃｃｇｇａａｔｃｃｔｇｇｃｇ￣３′ꎮ
１.３　 分子遗传操作
标准的分子与遗传操作方法按照文献[２１]进行ꎮ
以质粒 ｐＭＳ１０７为模板ꎬ以 Ｐｒｉｍｅｒ１ 和 Ｐｒｉｍｅｒ２
为引物对ꎬＰＣＲ 反应扩增出 ｃｙａＡ 基因片段(对应
４￣１ ２１５ ｂｐ基因片段)ꎬ经 Ｘｂａ Ⅰ和 Ｐｓｔ Ⅰ双酶切ꎬ
克隆至测序载体 ｐＫ１８ｍｏｂ 上ꎬ获得重组质粒
ｐＫｃｙａＡ ꎬ送华大基因公司测序ꎮ测序无误后ꎬ将
３３２
　
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ Ｘｃｃ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｓｔｒａｉｎ ｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
　 Ｓｔｒａｉｎ
８００４ Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎꎬ Ｒｉｆｒ [１９]
８００４∗ ｈｒｐＧ Ｅ４５Ｋ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｘｃｃ ８００４ꎬ Ｒｉｆｒ Ｏｕｒ ｌａｂ’ｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
８００４∗ΔｈｒｃＶ ｈｒｃＶ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｘｃｃ ８００４∗ꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋａｎｒ Ｏｕｒ ｌａｂ’ｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３ ８００４∗ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＪＡＡ１５５３ꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｔｃｒ Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ
８００４∗ΔｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３ ８００４∗ΔｈｒｃＶ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＪＡＡ１５５３ꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｋａｎｒꎬ Ｔｃｒ Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ
　 Ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＫ１８ｍｏｂ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄꎬ Ｋａｎｒ [２０]
ｐＫ１５５３ ｐＫｌ８ｍｏｂ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＸＣ＿１５５３ꎬ Ｋａｎｒ Ｏｕｒ ｌａｂ’ｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＪＸＧ ｐＬＡＦＲＪ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ３×ＦＬＡＧꎬ Ｔｃｒ Ｏｕｒ ｌａｂ’ｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｐＫｃｙａＡ ｐＫ１８ｍｏｂ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ４￣１ ２１５ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙａＡꎬ Ｋａｎｒ Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ
ｐＪＡＡ ｐＪＸＧ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ４￣１ ２１５ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙａＡꎬ Ｔｃｒ Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ
ｐＪＡＡ１５５３ ｐＪＡＡ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＸＣ＿１５５３ꎬ Ｔｃｒ Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ
ｐＭＳ１０７ ｐｌＣ２０Ｈ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ４￣１ ２１５ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙａＡꎬ Ａｍｐｒ [１１]
ｃｙａＡ基因片段经 Ｘｂａ Ⅰ和 Ｐｓｔ Ⅰ双酶切ꎬ胶回收
后克隆至带有 ３×ＦＬＡＧ 标签的 ｐＪＸＧ上ꎬ获得报告
质粒 ｐＪＡＡꎮ
　 　 用 ＥｃｏＲⅠ和 ＢａｍＨ Ⅰ双酶切 ｐＫ１５５３ꎬ获得
ＸＣ＿１５５３ 启动子信号区片段ꎬ胶回收后克隆至
ｐＪＡＡ的 ＥｃｏＲⅠ和 ＢａｍＨ Ⅰ位点上ꎬ获得重组质粒
ｐＪＡＡ１５５３ꎮ
将重组质粒 ｐＪＡＡ１５５３通过三亲接合ꎬ分别导
入 Ｘｃｃ ８００４∗和 ８００４∗ΔｈｒｃＶ 菌株ꎬ在丰富培养基
上分别以 Ｒｉｆｒ＋Ｔｃｒ 和 Ｒｉｆ ｒ＋Ｋａｎｒ ＋Ｔｃｒ 筛选获得三
亲接合子ꎮ
１.４　 腺苷酸环化酶活性的检测
１.４.１　 样品的制备　 使用培养 ２５ ｄ 的甘蓝京丰 １
号ꎬ蛋白样品的制备过程:把需要检测的菌株用
ＮＹＧ在 ２８℃摇瓶培养 １６ ｈꎬ使 ＯＤ６００大于 ０.５ꎻ把
稀释菌液到 ＯＤ６００ ＝０.１ꎬ用去掉针头的注射器压渗
约 １０ μＬ 的菌液到叶片中ꎻ压渗后 ２４ ｈꎬ收集 １
ｃｍ２ 的叶片ꎬ置于液氮中研磨ꎻ等液氮挥发完后ꎬ加
入 ３２３ μＬ 的 １.１ ｍｏｌ / Ｌ ＨＣｌＯ４ 继续研磨ꎻ等叶片
彻底磨碎后ꎬ１５ ０００ ｇ离心 １０ ｍｉｎꎻ取上清 ２８０ μＬ
加入 ３７.３ μＬ ６ ｍｏｌ / Ｌ Ｋ２ＣＯ３ꎬ１５ ０００ ｇ 离心 １０
ｍｉｎꎻ取上清 ２００ μＬꎬ用真空冷冻抽干机干燥ꎬ干燥
后置于－８０℃保存备用ꎮ
１.４.２　 样品的检测 　 将样品蛋白浓度调成一致ꎬ
按照 Ａｍｅｒｓｈａｍ 的 ｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏ￣
ａｓｓａｙ(ＥＩＡ)Ｓｙｓｔｅｍ使用说明书检测标准样品和待
测样品中 ｃＡＭＰ的含量ꎬ绘制标准曲线ꎬ并按照标
准曲线算出腺苷酸环化酶的活性ꎮ
１.５　 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测蛋白分泌
细菌胞外蛋白提取方法参见文献[２２]ꎮ 细菌
总蛋白的提取过程:取少量提取胞外蛋白时离心下
来的菌体ꎬ重悬于 １ ｍＬ ｄｄＨ２Ｏ 中ꎬ使用细胞破碎
仪破胞 ３ ｍｉｎꎬ注意冰上操作ꎬ并设置运行 １０ ｓ 间
歇 １０ ｓꎬ以保证蛋白质的活性ꎮ 破胞结束后 １２ ０００
ｒｐｍ离心吸取上清液待用ꎮ 将细菌胞外蛋白和总
蛋白进行 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ凝胶电泳ꎬ电泳后电转至 ＮＣ
膜上ꎬ用含有 ５０ ｇ / Ｌ 脱脂奶粉的 ＴＢＳＴ 缓冲液室
温下封闭 １ ｈꎮ 吸净封闭液ꎬＴＢＳＴ 洗膜 ３ 次ꎬ每次
１５ ｍｉｎꎮ 加入 １ ∶ １ ０００稀释的 ３×ＦＬＡＧ一抗 ４℃孵
育过夜ꎮ ＴＢＳＴ 洗膜 ３ 次ꎬ每次 １５ ｍｉｎꎮ 再加入
１ ∶ １ ０００稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 ＩｇＧ
(Ｈ＋Ｌ)ꎬ室温反应 １ ｈꎮ ＴＢＳＴ洗膜 ３次ꎬ每次１５ ｍｉｎꎮ
加入 ＢｅｙｏＥＣＬ Ｐｌｕｓ的工作液进行显色反应ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 报告质粒的构建
以质粒 ｐＭＳ１０７为模板ꎬ以 Ｐｒｉｍｅｒ１ 和 Ｐｒｉｍｅｒ２
为引物对ꎬＰＣＲ 反应扩增出 ｃｙａＡ 基因ꎬ产物预期
４３２
　
　 ３期 成春燕ꎬ等:一个用于鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物分泌与转运的报告质粒的构建
大小为 １ ２１２ ｂｐꎬ结果如图 １￣Ａ 的泳道 １ꎮ 将扩增
出的 ｃｙａＡ基因克隆至 ｐＫ１８ｍｏｂ上ꎬ获得重组质粒
ｐＫｃｙａＡ酶切验证图谱如图 １￣Ｂ 的泳道 ２ꎬ３ꎮ 将
ｐＫｃｙａＡ送华大基因公司测序ꎬ测序结果完全正确
(结果未显示)ꎮ 实验室已构建了带有 ３×ＦＬＡＧ 的
ｐＪＸＧ 载体ꎬ胶回收 １ ２１２ ｂｐ ｃｙａＡ 片段ꎬ克隆至
ｐＪＸＧ 的 Ｘｂａ Ⅰ和 Ｐｓｔ Ⅰ位点上ꎬ获得重组质粒
ｐＪＡＡꎬ酶切图谱如图 １￣Ｃ的泳道 ４ꎬ５ꎮ
２.２　 报告质粒的验证
用 ＥｃｏＲ Ⅰ和 ＢａｍＨ Ⅰ双酶切 ｐＫ１５５３ꎬ获得
ＸＣ＿１５５３启动子信号区片段ꎬ产物预期大小为 ８９４
ｂｐꎬ酶切图谱如图 ２￣Ａ的泳道 １ꎮ 胶回收 ＸＣ＿１５５３
启动子区片段ꎬ将其克隆至报告质粒 ｐＪＡＡ 上ꎬ获
得重组质粒 ｐＪＡＡ１５５３ꎬ用 ＥｃｏＲ Ⅰ和 Ｐｓｔ Ⅰ双酶
切ꎬ产物预期大小为 ２ １０６ ｂｐꎬ酶切图谱如图 ２￣Ｂ
的泳道 ２ꎮ 将重组质粒 ｐＪＡＡ１５５３ 通过三亲接合ꎬ
分别导入 ８００４∗和 ８００４∗ΔｈｒｃＶꎬ在丰富培养基上
分别以 Ｒｉｆｒ＋Ｔｃｒ 和 Ｒｉｆｒ ＋Ｋａｎｒ ＋Ｔｃｒ 筛选三亲接合
子ꎬ三亲接合子的 ＰＣＲ 验证和酶切验证图谱如图
２￣Ｃ的泳道 ３ꎬ４ꎮ
Ｆｉｇ. １　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｃｙａＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ (Ａ)ꎬ Ｅｎｚｙｍｅ￣ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＫｃｙａＡ (Ｂ) ａｎｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＪＡＡ (Ｃ)
Ｌａｎｅ Ｍ: １００ ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅ ２ꎬ３: Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＫｃｙａＡꎻ Ｌａｎｅ ４ꎬ５: Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＪＡＡ.
Ｆｉｇ. ２　 Ｅｎｚｙｍｅ￣ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＫ１５５３ (Ａ) ａｎｄ
ｐＪＡＡ１５５３ (Ｂ)ꎬ ａｎｄ ＰＣＲ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ (Ｃ)
Ｌａｎｅ Ｍ: １００ ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＫ１５５３ꎻ
Ｌａｎｅ ２: Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＪＡＡ１５５３ꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ ｏｆ ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３ꎻ
Ｌａｎｅ ４: Ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ ｏｆ ８００４∗ΔｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３.
５３２
　
植物病理学报 ４４卷
２.３　 腺苷酸环化酶活性检测
２.３.１　 标准曲线的绘制　 参照 ｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ Ｅｎｚ￣
ｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ(ＥＩＡ) Ｓｙｓｔｅｍ 试剂盒说明书ꎬ检
测 ｃＡＭＰ标准品的 ＯＤ４５０吸光值(表 ２)ꎬ按得到的
数据绘制 ｃＡＭＰ标准曲线(图 ３)ꎮ
２.３.２　 腺苷酸环化酶活性检测　 检测各样品相应
的 ｃＡＭＰ含量(表 ３)ꎮ 结果发现 ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３
压渗后植物体内 ｃＡＭＰ 含量是 ８００４∗ ΔｈｒｃＶ /
ｐＪＡＡ１５５３压渗后植物体内 ｃＡＭＰ 含量的 １５ 倍ꎮ
证明 ｐＪＡＡ报告系统中的 ＣｙａＡ报告蛋白是可以正
常工作的ꎮ
２.４　 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
　 　 使用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法定量后ꎬ各取 ４５ μｇ蛋白质样
品上样ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳后ꎬ１８ ｍＡ转膜过夜ꎬ杂交
Ｔａｂｌｅ ２ 　 Ｔｈｅ ｄａｔａ ｏｆ ｃＡＭＰ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ
ａｓｓａｙ
Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＡＭＰ ｓｔａｎｄａｒｄ
ｓａｍｐｌｅ ( ｆｍｏｌ / ｗｅｌｌ)
ＯＤ４５０
０.０ １.８３４
１２.５ １.６３３
２５.０ １.４８２
５０.０ １.２６５
１００.０ １.０１９
２００.０ ０.９１８
４００.０ ０.６４５
８００.０ ０.５３１
１６００.０ ０.２９０
３２００.０ ０.１９５
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｆｏｒ ｃＡＭＰ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
显影后ꎬ结果如图 ４ 所示ꎮ ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３ 的总
蛋白和胞外蛋白都能检测到分泌信号ꎬ而负对照
８００４∗ΔｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３ 只在总蛋白中检测到分
泌ꎬ胞外蛋白中未检测到分泌ꎬ证明报告质粒 ｐＪＡＡ
中的 ３×ＦＬＡＧ标签能正常工作ꎮ
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｔｈｅ ｃＡＭＰ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｌａｎｔａ ２４ ｈ ｐｏｓｔ
ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
Ｓｔｒａｉｎ
Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＡＭＰ ｉｎ ｐｌａｎｔａ
(ｎｍｏｌ / ｍｇ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ)
８００４∗ ０.０１６±０.０００６
８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３ ０.２７１±０.００４６
８００４∗ΔｈｒｃＶ ０.０１８±０.０００９
８００４∗ΔｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３ ０.０１９±０.００２３
Ｆｉｇ. ４　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＸＣ＿１５５３
ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
Ｌａｎｅ １: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３ꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｔｏｔａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ８００４∗ △ｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３ꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ８００４∗ / ｐＪＡＡ１５５３ꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ
８００４∗△ｈｒｃＶ / ｐＪＡＡ１５５３.
３　 讨论
２００２ 年到 ２００９ 年ꎬ前人利用能引起辣椒
ＥＣＷ￣１０Ｒ ＨＲ反应的 ＡｖｒＢｓ１ 为报告蛋白ꎬ鉴定出
了十字花科黑腐病菌中的 １２ 个Ⅲ型效应物ꎮ 近 ３
年没有发现关于通过 ＨＲ检测Ⅲ型效应物的报道ꎬ
原因有可能是Ⅲ型效应物的分泌量低[１７]ꎬ以此方
法的灵敏度ꎬ不足以鉴定出新的Ⅲ型效应物ꎮ 本文
以 ３×ＦＬＡＧ 和 ｃｙａＡ 作为报告基因ꎬ３×ＦＬＡＧ 可用
于检测候选效应物的分泌ꎬＣｙａＡ 可用于检测候选
效应物的转运ꎬ通过 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 和免疫检测
ｃＡＭＰ含量的方法体外体内鉴定 Ｘｃｃ Ⅲ型效应物ꎬ
这 ２种方法灵敏度极高ꎬ可以少受信号弱、难检测
的限制ꎬ使新的Ⅲ型效应物鉴定成为可能ꎮ
全基因组筛选鉴定Ⅲ型效应物的研究ꎬ对于揭
６３２
　
　 ３期 成春燕ꎬ等:一个用于鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物分泌与转运的报告质粒的构建
示植物病原菌的致病机理具有重要意义ꎮ 由于效
应物具有分泌量低、在基因组中多数冗余、保守性
不强等特点ꎬ在基因组时代前期鉴定效应物具有一
定的难度[２３]ꎮ 而进入基因组时代后ꎬ越来越多的
植物病原菌被全基因组测序ꎬ使全基因组鉴定Ⅲ型
效应物成为可能ꎮ 目前 Ｘｃｃ 的 ３ 个菌株 ８００４、
ＡＴＣＣ ３３９１３和 Ｂ１００都相继被测序[１ꎬ２４ꎬ２５]ꎬ使全基
因组筛选鉴定迫在眉睫ꎮ 本文构建的报告质粒
ｐＪＡＡꎬ为进一步全基因组筛选鉴定 Ｘｃｃ ８００４ 的
Ⅲ型效应物提供了有效的工具ꎮ 目前本实验室已
经利用该质粒进行 Ｘｃｃ ８００４ 的Ⅲ型效应物的全基
因组鉴定ꎬ期望找出更多新的Ⅲ型效应物ꎮ
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ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒｆｅ￣
ｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍｓꎬ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ
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ｎｉｚｅｄ ｉｎ ｒａｃｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｓｉｓ￣
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ａ ｔｙｐｅ Ⅲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ ｌｅｕｃｉｎｅ￣ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ
ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐａｔｈｏｖａｒ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
ｃｏｎｆｅｒｓ ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
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植物病理学报 ４４卷
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责任编辑:于金枝
８３２