全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(１): ３３￣４０(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０５￣０１ꎻ 修回日期: ２０１４￣１０￣２４
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(２０１００３０６６)ꎻ 国家西甜瓜产业技术体系(ＣＡＲＳ￣２６)ꎻ 中国农业科学院创新工程
通讯作者: 赵廷昌ꎬ研究员ꎬ主要研究方向为分子植物病理学ꎻＴｅｌ:０１０￣６２８１５９３３ꎬＥｍａｉｌ:ｔｃｚｈａｏ＠ ｉｐｐｃａａｓ.ｃｎ
第一作者: 严婉荣ꎬ女ꎬ陕西宝鸡人ꎬ研究实习员ꎬ农学硕士ꎬ主要研究方向为分子植物病理学ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙａｎｗａｎｒｏｎｇ８１８＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０１.００５
瓜类细菌性果斑病菌 ｈｒｃＮ基因的生物学功能分析
严婉荣１ꎬ ２ꎬ 王铁霖１ꎬ 杨玉文１ꎬ 戴良英３ꎬ 赵廷昌１∗
( １中国农业科学院植物保护研究所ꎬ植物病虫害生物学国家重点实验室ꎬ北京 １００１９３ꎻ２海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所ꎬ
海南省植物病虫害防控重点实验室ꎬ海口 ５７１１０ꎻ３湖南农业大学生物安全科学技术学院ꎬ长沙 ４１０１２８)
摘要:以分离自西瓜上的 Ａａｃ５ 菌株为例ꎬ通过同源重组的方法ꎬ构建了 ｈｒｃＮ 基因插入缺失突变体ꎬ通过 ＰＣＲ 方法和
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ验证突变菌株ꎬ对突变体进行致病性、致敏性、生长曲线和运动性测定ꎮ 为明确 ｈｒｃＮ基因与其他基因的关系ꎬ
通过实时荧光定量 ＰＣＲ法定量检测了 ｈｒｐＡ、ｈｒｃＶ、ｈｒｃＵ、ＬｕｘＩ、ＬｕｘＲ ５个基因的表达量ꎮ 结果显示:与野生型相比ꎬ突变体致
病力和致敏性明显减弱ꎬ致病时间延迟ꎬ群体感应信号减弱ꎬ生长能力明显下降ꎬ运动性减弱ꎬ互补菌株只能恢复部分功能ꎻ
５个基因在突变体中的表达量均上调ꎬｈｒｃＮ基因与这 ５个基因之间均为负调控关系ꎮ 说明 ｈｒｃＮ基因在果斑病菌致病能力
上发挥重要作用ꎮ
关键词: 果斑病菌ꎻ 致病性ꎻ ｈｒｃＮ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｒｃＮ ｇｅｎｅ ｏｆ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ 　 ＹＡＮ Ｗａｎ￣ｒｏｎｇ１ꎬ２ꎬ
ＷＡＮＧ Ｔｉｅ￣ｌｉｎ１ꎬＹＡＮＧ Ｙｕ￣ｗｅｎ１ꎬ ＤＡＩ Ｌｉａｎｇ￣ｙｉｎｇ３ꎬ ＺＨＡＯ Ｔｉｎｇ￣ｃｈａｎｇ１ 　 ( １Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓꎬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＣｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬＣｈｉｎａꎻ
２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏ￣Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ＆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈａｉｎａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈａｉｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓꎬ Ｈａｉｋｏｕ ５７１１００ꎬＣｈｉｎａꎻ ３Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏ￣ｓａｆｅｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＨｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌ￣
ｔｕｒａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｒｕｉｔ ｂｌｏｔｃｈ ｏｆ ｍｅｌｏｎｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ(Ｓｃｈａａｄ ｅｔ ａｌ.２００８) ｉｓ ａ ｗｏｒｌｄ￣ｗｉｄｅ
ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｇｉｖｅｓ ｒｉｓｅ ｔｏ ｓｅｒｉｏｕｓ ｄａｍａｇｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｃｕｒｂｉｔｓ ｐｌａｎｔｓ. Ｓｔｒａｉｎ Ａａｃ５ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｗａｓ ａ
ｍｕｔａｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｎｅｒ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｒｃＮ ｇｅｎｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ. Ｔｈｉｓ ｍｕｔａｎｔ
ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ. Ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅꎬ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎꎬ ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇꎬ ｇｒｏｗｔｈ ａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ. Ａｌｌ ｔｈｅｓｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｃｏｕｌｄ
ｂｅ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｔｏｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｂｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｎｇ ｈｒｃＮ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｒｃＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓꎬ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅｓ(ｈｒｐＡꎬｈｒｃＶꎬｈｒｃＵ) ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙꎬｔｗｏ
ｇｅｎｅｓ (ＬｕｘＩꎬ ＬｕｘＲ)ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ａ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ(ｐｉｌＴ) ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ￣Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｆｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ. Ｔｈｕｓ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｒｃＮ ａｎｄ ｆｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ
ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ. Ａｌｌ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｈｒｃＮ ｇｅｎｅ ｐｌａｙｅｄ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙꎻ ｈｒｃＮ
中图分类号: Ｓ４３２.４２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０１￣００３３￣０８
　
植物病理学报 ４５卷
　 　 瓜类细菌性果斑病 ( Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｒｕｉｔ ｂｌｏｔｃｈꎬ
ＢＦＢ)是一种严重为害西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作
物的世界性病害ꎬ其病原菌的分类地位由类产碱假
单胞菌西瓜亚种 [Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｓｕｂｓｐ.ｃｉｔｒｕｌｌｉ (Ｓｃｈａａｄ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９７８)][１]变更为西瓜嗜
酸菌[Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ (Ｓｃｈａａｄ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００８)][２]ꎮ
１９６５年美国首次报道了该病害ꎮ １９９２ 年ꎬ该病在
美国乔治亚州大面积发生[３]ꎮ １９９８ 年我国海南省
乐东、东方等县的西瓜上发生该病害[４]ꎮ 果斑病
可经由种子传播[５]ꎬ其传播蔓延的速度很快ꎬ一旦
病害发生将很难控制和根除ꎬ给西甜瓜种植业造成
巨大经济损失ꎮ
　 　 Ⅲ型分泌系统 ( ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬ
Ｔ３ＳＳ)的 ｈｒｃＮ基因属于 ＡＡＡ＋ ＡＴＰａｓｅ家族ꎬ产物
为 ＡＴＰａｓｅꎬ该家族蛋白可以利用水解 ＡＴＰ 的能量
重塑多种底物蛋白ꎬ从而在蛋白修饰、膜融合和降
解等多种生理过程中发挥作用[６]ꎮ 在 Ｐｓｅｕｄｏ￣
ｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ中ꎬＨｒｃＮ是膜上的
一个外围蛋白ꎬ通过蛋白表达分析和电镜观察ꎬ发
现 ＨｒｃＮ 有 ４ 种不同的组成形式ꎬ即 ４８ ｋＤａ (单
体)、３００ ｋＤａ(六聚体)、５７５ ｋＤａ(十二聚体)和 ３.５
ＭＤａꎬ十二聚体是膜的主要组成形式ꎬ其 ＡＴＰａｓｅ
活性可以通过单体形式的活性刺激显著提高[７]ꎮ
研究显示ꎬ在 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｏ￣
ｒｉａ中ꎬＨｒｃＮ蛋白能够水解体外的 ＡＴＰꎬ而且对 ＩＩＩ
型分泌系统和细菌的致病性极其重要[８]ꎮ ＨｒｃＮ的
稳定性取决于保守的 ＨｒｃＬ 蛋白ꎬ两者在生物体内
和体外都可直接互作ꎬＨｒｃＮ和 ＨｒｃＬ结合到内膜蛋
白 ＨｒｃＵ上ꎬ并且在 ＩＩＩ 型分泌系统允许的条件下ꎬ
特异性地定殖于细菌的膜上ꎮ 蛋白互作研究显示ꎬ
ＨｒｃＮ还与 ＩＩＩ 型分泌系统中的特异性运动蛋白
ＨｐａＣ和全局性伴侣蛋白 ＨｐａＢ 互作ꎬ启动了多个
效应蛋白的分泌[８]ꎮ
　 　 通过比对发现ꎬ果斑病菌中的 ｈｒｃＮ 基因与假
单胞菌 ( Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ
１４４８Ａ)、欧文氏杆菌(Ｅｒｗｉｎｉａ ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ Ｅｔ９９)、
劳尔氏菌(Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＰＳ１０７)以及黄
单胞菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ＰＸＯ９９Ａ)
中的 ｈｒｃＮ 基因具有较高的相似性ꎬ 分别为
５８.５７％、５５.５５％、７１.１４％、６８.２６％ꎬ与劳尔氏菌的
相似性最高ꎮ 本文以分离自西瓜的台湾菌株 Ａａｃ５
为背景ꎬ通过同源重组的方法构建了 ｈｒｃＮ 基因插
入缺失的突变菌株[ ９ ]ꎬ并对 ｈｒｃＮ 基因的相关生物
学功能做了初步探索ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
１.１.１　 供试菌株、质粒及引物　 所用菌株、质粒及
引物见表 １ꎮ
１.１.２　 培养基及培养条件　 果斑病菌及突变体在
ＫＢ培养基中 ２８℃培养ꎬ大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ￣
ｌｉ)在 ＬＢ 培养基中 ３７℃培养ꎬ群体感应信号报告
菌(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＴＬ４)在 ＡＢＭ培养
基中 ２８℃过夜培养ꎬ群体感应阳性对照菌大白菜
软腐病菌(Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ. ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ)在
ＫＢ培养基中 ２８℃过夜培养ꎮ 培养过程中所用抗
生素终浓度分别为氨苄青霉素(Ａｍｐ)５０ μｇ / ｍＬ、
卡那霉素(Ｋｍ)５０ μｇ / ｍＬ、庆大霉素(Ｇｍ)５０ μｇ
/ ｍＬ、链霉素(Ｓｔｒ)５０ μｇ / ｍＬꎬ其中转化后的大肠
杆菌所用氨苄青霉素(Ａｍｐ)浓度为 １００ μｇ / ｍＬꎮ
１.２　 方法
１.２.１　 ｈｒｃＮ 基因突变体的制备及验证　 在 ＮＣＢＩ
上获取果斑病菌全基因组信息ꎬ设计引物 ｈｒｃＮＳ /
ｈｒｃＮＡ扩增 ｈｒｃＮ基因内部 ９０３ ｂｐ片段ꎬ回收后连接
到 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体上ꎬ获得重组质粒 ｈｒｃＮ￣Ｔꎬ测序验
证ꎮ 用 Ｈｉｎｄ Ⅲ和 Ｘｂａ Ｉ酶切 ｈｒｃＮ￣Ｔꎬ连接到经过同
样酶切处理的 ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ 自杀性质粒上ꎮ ｈｒｃＮ
基因内部存在相距 １７３ ｂｐ的 ＰｓｔⅠ和 ＳｐｈⅠ２个酶切
位点ꎬ酶切后插入一个 Ｇｍ 基因ꎬ构建重组质粒
ｐＫ１８￣ｈｒｃＮ￣Ｇｍꎮ 将该质粒用电击的方法导入 Ａａｃ５
感受态细胞中ꎬ由于用于基因交换的自杀性质粒载
体 ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ含有蔗糖致死基因 ｓａｃＢꎬ带有该质
粒的菌体在含有蔗糖的培养基上不能生长ꎮ 而重组
成功后含有 Ｇｍ的基因进入 Ａａｃ５菌株基因组中ꎬ具
有 ＧｍＲꎬＡａｃ５菌株本身具有 ＡｍｐＲꎬ因此将电击转
化后的菌液涂布于 ＧｍＲ＋ＡｍｐＲ＋２５％蔗糖的 ＫＢ平
板上ꎬ筛选转化子ꎬ得到突变体ꎮ
　 　 对突变体用引物 ｈｒｃＮＳ / ｈｒｃＮＡ、ＧｍＳ / ＧｍＡ 以
及果斑病菌特异性引物 ＷＦＢ１ / ＷＦＢ２ 进行菌液
ＰＣＲꎬ筛选和验证突变体ꎮ 提取野生型和突变体基
因组ꎬ野生型用 ＥｃｏＲⅠ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切ꎬ突变体用
两组酶酶切ꎬ即 ＥｃｏＲⅠ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ、 ＥｃｏＲⅠ和
ＰｓｔⅠꎬ将整个基因组切成弥散的条带ꎬ以Ｇｍ基因序
４３
　
　 １期 严婉荣ꎬ等:瓜类细菌性果斑病菌 ｈｒｃＮ基因的生物学功能分析
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｔｒａｉｎｓꎬ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｓｔｒａｉｎꎬ ｐｌａｓｍｉｄꎬ ｐｒｉｍｅｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｓｔｒａｉｎ　 　 　 　 　 　 　
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ (Ａａｃ５) Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅꎬ ＡｍｐＲ ＴａｉｗａｎꎬＣｈｉｎａ
ＭｈｒｃＮ Ｍｕｔａｎｔꎬ Ｉｎｎｅｒ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｈｒｃＮ ｇｅｎｅꎬ ＡｍｐＲꎬ ＧｍＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＣＭｈｒｃＮ
Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｉｎꎬＡｍｐＲꎬ ＧｍＲꎬＳｐＲꎬ
ＭｈｒｃＮ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＨＭｈｒｃＮ
Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＮＴＬ４
ＧｍＲꎬｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｓｔｒａｉｎꎬＣｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｒａＧ::ｌａｃＺ Ｆｕｓｉｏｎ
Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｒａＲ ｇｅｎｅꎬｗｉｔｈｏｕｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｃｙｌ￣ＨＳＬꎬＢｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ
ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｃｙｌ￣ＨＳＬ
[１０]
Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ.
ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ(Ｅｃｃ￣３)
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ Ｔｈｉｓ ｌａｂ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ꎬΔ( ｌａｃＺＹＡ￣ａｒｇＦ)Ｕ１６９ꎬ ｒｅｃＡ１ꎬｅｎｄＡ１ꎬｔｈｉ￣１ ＴＩＡＮＧＥＮ
Ｐｌａｓｍｉｄ　 　 　 　 　 　 　
ｐＭＤ１８￣Ｔ ＡｍｐＲꎬＣｏｌＥ１ ｏｒｉｇｉｎꎬＴ￣ｖｅｃｔｏｒ ＴａＫａＲａ
ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ ＫｍＲꎬ ｓａｃＢꎬｌａｃＺａꎬｍｃｓ ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ [１１]
ｐＨＭ１ ＳｐＲꎬＳｍＲꎬｃｏｓꎬｐａｒＡꎬＩｎｃＷꎬｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｐＲＩ４０ [１２]
ｐｋ１８￣ｈｒｃＮ￣Ｇｍ ｐＫ１８ｓａｃＢ ｗｉｔｈ ｄｅｌｅｔｅｄ ｐａｒｔｓ ｏｆ ｈｒｃＮ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｎｋ Ｇｍ ｇｅｎｅ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＨＭｈｒｃＮ ｐＨＭ１ ｗｉｔｈ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｒｃＮ Ｇｅｎｅ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ　 　 　 　 　 　 　
ｈｒｃＮＳ ＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧ(ＸｂａⅠ) Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｈｒｃＮＡ ＧＴＣＧＡＣＴＧＧＡＡＣＧＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧ(ＳａｌⅠ) Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＧｍＳ ＧＣＡＴＧＣＧＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＡＡ(Ｐｓｔ Ｉ) Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＧｍＡ ＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧＡＣＡＡＴＴＴ(Ｓｐｈ Ｉ) Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＷＦＢ１ ＧＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＷＦＢ２ ＣＴＧＣＣＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＧＡ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＨｈｒｃＮＳ ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＧＴＣＧＧＧＡＴＴＧＣＴ(Ｈｉｎｄ Ⅲ) Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＨｈｒｃＮＡ ＧＴＣＧＡＣＴＧＧＡＡＣＧＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧ(ＳａｌⅠ) Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｈｒｐＡ１ ＧＣＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｈｒｐＡ２ ＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＣＧＧ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｈｒｃＶ１ ＡＡＣＣＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｈｒｃＶ２ ＣＡＴＡＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＴＣＴＣＧＣ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｈｒｃＵ１ ＡＧＴＣＧＡＧＧＧＧＧＣＣＧＡＴＧＡＣＣ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｈｒｃＵ２ ＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＧＴＣＧＴ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＬｕｘＩ１ ＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＧＴＧＧＡ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＬｕｘＩ２ ＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＴＣＡＴＡＧＧＡＣ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＬｕｘＲ１ ＴＴＴＣＴＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＴＣ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＬｕｘＲ２ ＴＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＡＧＧＣＡ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐｉｌＴ１ ＧＡＴＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧＧ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐｉｌＴ２ ＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＧ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
　 Ｎｏｔｅ:Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅｓ ａｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｇｎｅｄ ｉｎ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ.
５３
　
植物病理学报 ４５卷
列为探针进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交验证ꎬＳｏｕｔｈｅｒｎ 杂交试
剂盒使用 Ｒｏｃｈｅ 公司的 ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａ￣
ｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ Ⅰꎬ探针的制备使
用试剂盒中提供的随机引物ꎮ
１.２.２　 互补菌株的构建及验证 　 以 Ａａｃ５ 基因组
为模板ꎬ以 ＨｈｒｃＮＳ / ＨｈｒｃＮＡ 为引物ꎬ扩增 ｈｒｃＮ 基
因包含自身启动子在内的 １ ８８７ ｂｐ片段ꎬ引物自身
包含 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 和 Ｓａｌ Ｉ 酶切位点ꎬ连接到 ｐＭＤ１８￣Ｔ
载体上ꎬ转化大肠杆菌后进行 ＰＣＲ 验证、测序ꎮ 用
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和 Ｓａｌ Ｉ双酶切回收 １ ８８７ ｂｐ片段ꎬ连接到
经过同样双酶切处理的 ｐＨＭ１ 载体上ꎬ转化大肠
杆菌感受态细胞ꎬ得到互补质粒 ｐＨＭｈｒｃＮꎬ将互补
质粒 ｐＨＭｈｒｃＮ 通过电击导入突变体感受态细胞
中ꎮ 在含有 ＳｔｒＲ＋ＡｍｐＲ的 ＫＢ平板上多次筛选ꎬ将
筛选到的互补菌株提取 ｐＨＭｈｒｃＮ 质粒ꎬ进行 ＰＣＲ
和双酶切分析ꎮ
１.２.３　 致病性及表型测定
　 　 (１)致病性和致敏性测定　 将 Ａａｃ５、ＭｈｒｃＮ、
ＣＭｈｒｃＮ待测菌株在 ＫＢ 培养基上活化后ꎬ挑取单
菌落在 ＫＢ液体培养基中振荡培养至细菌浓度为
１０８ＣＦＵ / ｍＬꎮ 喷雾法测定致病性ꎬ用喷壶将菌液
均匀喷于叶片的正反两面ꎮ 同时用针刺法测定致
病性ꎬ用一次性针头轻轻碰触瓜苗的子叶和真叶ꎬ
造成轻微的伤口ꎬ取 １ μＬ 菌液滴在伤口处ꎬ每个
菌株接种 ３盆西瓜苗ꎬ每盆接 ３ 片子叶、３ 片真叶ꎮ
用清水做对照ꎬ放在恒温光照培养箱中ꎬ设定 １５ ｈ
白天、２８℃ꎬ１２ ｈ黑夜、１６℃ꎬ６０％光照强度ꎬ９０％以
上的湿度培养ꎬ３ ｄ后记录发病情况ꎬ６ ｄ 后再记录
一次发病情况ꎬ重复 ３次ꎮ
　 　 待测菌生长到对数期后ꎬ用灭菌的针管吸取菌
液接种到烟草叶背面的主脉与侧脉交接处ꎬ轻轻推
动针管直到烟叶背面出现水浸状的大斑ꎬ以清水做
对照ꎬ３次重复ꎬ培养条件同致病性测定ꎬ２４ ｈ 后观
察结果ꎮ
　 　 (２)群体感应信号测定　 向 １０ ｍＬ ＡＢＭ液体
培养基中加入 ５０ μＬ －８０℃保存的信号报告菌株
(Ａ. ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＴＬ４)ꎬ２８℃培养 １２ ｈꎮ 活化 Ｅｃｃ￣
３、Ａａｃ５、ＭｈｒｃＮ、ＣＭｈｒｃＮ 待测菌株ꎬ在 ＫＢ 液体培
养基中过夜培养ꎮ 将含 ０.８％琼脂的 １００ ｍＬ ＡＢＭ
固体培养基融化后倒平板ꎬ取 ２０ μＬ ２０ ｍｇ / ｍＬ Ｘ￣
ｇａｌ涂布平板ꎬ吸取 １ μＬ信号报告菌和待测菌液点
在制备好的平板上ꎬ做好标记ꎮ 在恒温箱中 ２８℃
培养 ２ ｄ 后观察菌落周围是否有蓝色晕圈出
现[１３]ꎮ
　 　 (３)生长曲线测定 　 将待测菌用新鲜的液体
ＫＢ培养基培养至 ＯＤ６００ ＝ ０.５ꎬ按照 １ ∶ １０００ 的比
例将其加入到 １０ ｍＬ 新鲜的 ＫＢ 培养基中ꎬ２８℃ꎬ
１８０ ｒ / ｍｉｎ培养 ６ ｈ后第一次取样测定 ＯＤ６００值ꎬ共
取样 ７次ꎬ做图比较生长能力ꎮ
　 　 (４)运动性测定　 将待测菌在 ＫＢ培养基上活
化ꎬ挑取单菌落接种于 ＫＢ 液体培养基中ꎬ２８℃ꎬ
１８０ ｒ / ｍｉｎ过夜培养至对数期ꎬ用液体 ＫＢ 稀释菌
液至 ＯＤ６００ ＝ ０.５ꎬ取１ μＬ培养液点接于 ０.３％的半
固体 ＫＢ培养基上ꎬ２８℃恒温箱内培养 ３ ~ ５ ｄꎬ比
较观察细菌的运动痕迹[９]ꎮ
１.２.４　 ｈｒｃＮ基因对相关基因表达量的影响　 分别
选取与Ⅲ型分泌系统有关的 ３ 个基因 ｈｒｐＡ、ｈｒｃＶ
和 ｈｒｃＵꎬ与群体感应有关的 ２ 个基因 ＬｕｘＩ 和
ＬｕｘＲꎬ一个内参基因( ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ) ｐｉｌＴꎬ设计引
物(表 １)ꎬＰＣＲ 验证引物的特异性ꎮ 提取野生型和
突变体菌株的总 ＲＮＡꎬ消化 ＤＮＡꎬ将 ＲＮＡ调节至统
一浓度后ꎬ反转录合成第一链 ｃＤＮＡꎬ建立Ｒｅａｌ￣Ｔｉｍｅ
ＰＣＲ反应体系ꎮ ＲＮＡ 提取、反转录及荧光定量试剂
盒均购自天根生化(北京)科技有限公司ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ｈｒｃＮ基因突变体的制备及验证
　 　 将质粒 ｐＫ１８￣ｈｒｃＮ￣Ｇｍ 用电击的方法导入果
斑病菌 Ａａｃ５ 中ꎬ质粒中 Ｇｍ 基因两侧的序列与果
斑病菌中的 ｈｒｃＮ 具有同源性ꎬ当它们共培养时可
以发生同源重组双交换ꎬ将 Ｇｍ基因置换进入果斑
病菌 ｈｒｃＮ 基因中ꎬ同时剔除了 ｈｒｃＮ 内部 １７３ ｂｐ
的碱基ꎬ使 ｈｒｃＮ 基因的表达不完整ꎮ 用引物
ｈｒｃＮＳ / ｈｒｃＮＡ对得到的突变体进行 ＰＣＲ 验证(图
１)ꎮ 以 ｐＫ１８￣ｈｒｃＮ￣Ｇｍ 质粒和野生型 ＰＣＲ 结果ꎬ
分别作为突变体和野生型的对照条带ꎮ 由于
ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ 质粒含有蔗糖致死基因 ｓａｃＢꎬ理论
上在含有蔗糖的平板上该质粒不能正常生长ꎬ但
是ꎬ试验证明 ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ对蔗糖的敏感性不强ꎬ
ＰＣＲ得到没有交换成功的条带(图 １ꎬ泳道 ３￣５)ꎬ同
时也得到了交换成功的条带(图 １ꎬ泳道 ６￣８)ꎮ 通
过继代培养筛选交换成功的突变体ꎬ在含有 Ｋｍ的
平板上该突变体不能生长ꎮ 用 ｈｒｃＮＳ / ｈｒｃＮＡ 引物
６３
　
　 １期 严婉荣ꎬ等:瓜类细菌性果斑病菌 ｈｒｃＮ基因的生物学功能分析
进行菌液 ＰＣＲꎬ得到了 １ ５９１ ｂｐ 的单一片段ꎮ 用
果斑病菌特异性引物 ＷＦＢ１ / ＷＦＢ２ 进行 ＰＣＲ 验
证ꎬ得到了 ３６０ ｂｐ的特异性条带ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ
Ｌａｎｅ １:ｐＫ１８￣ｈｒｃＮ￣Ｇｍꎻ Ｌａｎｅ ２: Ａａｃ５ꎻ Ｌａｎｅ ３￣５:Ｎｏｔ ｓｕｃ￣
ｃｅｓｓｆｕｌ ｍｕｔａｎｔｓꎻ Ｌａｎｅ ６￣８:Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｍｕｔａｎｔｓ.
　 　 以 Ｇｍ基因作为探针ꎬ杂交插入到突变体中的
Ｇｍ基因ꎬ用两组不同的酶酶切突变体基因组ꎬ酶
切结果可以看到整个基因组呈弥散的条带ꎮ 野生
型中不存在 Ｇｍ基因ꎬ未杂交到 Ｇｍ 基因(图 ２ꎬ泳
道 １)ꎬ而在突变体中可以杂交到不同大小条带的
Ｇｍ基因(图 ２ꎬ泳道 ２、３)ꎮ 证明成功获得突变菌
株ꎮ
Ｆｉｇ. ２ 　 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａａｃ５ ａｎｄ
ＭｈｒｃＮ
Ｌａｎｅ１: Ｔｈｅ ＥｃｏＲ Ｉꎬ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ａａｃ５ꎻ
Ｌａｎｅ ２: Ｔｈｅ ＥｃｏＲ Ｉꎬ Ｐｓｔ Ｉ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ＭｈｒｃＮꎻ
Ｌａｎｅ ３: Ｔｈｅ ＥｃｏＲ Ｉꎬ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ＭｈｒｃＮ.
２.２　 互补菌株的构建及验证
　 　 将导入互补质粒的突变体菌株提取质粒后进
行酶切ꎬ酶切结果可以看到 １ ８８７ ｂｐ 的互补片段ꎬ
得到互补菌株ꎮ
２.３　 致病性及表型测定
２.３.１　 致病性测定 　 致病性测定结果显示:喷雾
法接种ꎬ突变菌株致病力丧失(图 ３￣Ａ、Ｂ)ꎻ针刺法
接种突变菌株则有微弱致病力(图 ３￣Ｃ、Ｄ)ꎮ 说明
ｈｒｃＮ基因与果斑病菌的致病力有关ꎬ不同的接种
方法其致病力不同ꎮ
Ｆｉｇ. ３ 　 Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ Ａａｃ５ꎬ ＭｈｒｃＮ
ａｎｄ ＣＭｈｒｃＮ
ａ: Ａａｃ５ꎻ ｂ: ＭｈｒｃＮꎻ ｃ: ＣＭｈｒｃＮꎻ ｄ: ＣＫ.
Ａꎬ Ｃ: Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｉｎ ｌｅｍｏｎ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎꎻ Ｂ: Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
ｔｅｓｔ ｉｎ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｌｅａｆꎻ Ｄ: Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｉｎ ｌｅｍｏｎ ｌｅａｆ.
２.３.２　 致敏性测定 　 烟草致敏性结果显示:突变
菌株对烟草的致敏性明显减弱ꎬ接种 ２４ ｈ 后ꎬ突变
体没有出现过敏反应ꎬ互补菌株过敏反应不明显ꎻ
接种 ４８ ｈ后ꎬ突变体出现轻微的过敏反应ꎬ互补菌
株过敏反应明显ꎮ
２.３.３ 　 群体感应信号测定 　 通过测定 Ｅｃｃ￣３、
Ａａｃ５、ＭｈｒｃＮ、ＣＭｈｒｃＮ均可产生群体感应现象ꎬ阳
性菌株产生群体感应信号的能力最强ꎬ野生菌株次
７３
　
植物病理学报 ４５卷
之ꎬ突变体产生群体感应的能力减弱ꎬ互补菌株只
能恢复部分功能ꎮ
２.３.４　 生长曲线测定　 突变体比野生型菌株生长
能力明显下降(图 ４)ꎬ而且生长周期明显缩短ꎬ在
接近 ３０ ｈ时野生型生长最旺盛ꎬ而突变体已进入衰
亡期ꎬ互补菌株恢复了部分生长能力ꎮ 说明 ｈｒｃＮ基
因的突变一定程度上影响了细菌的生长能力ꎮ
２.３.５　 运动性测定 　 突变体的运动能力也有所下
降ꎬ推测 ｈｒｃＮ基因的缺失可能影响了鞭毛的运动性
(图 ５)ꎮ
Ｆｉｇ. ４ 　 Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ａａｃ５ꎬＭｈｒｃＮ ａｎｄ
ＣＭｈｒｃＮ
２.４　 ｈｒｃＮ基因对相关基因表达量的影响
　 　 提取细菌总 ＲＮＡꎬ电泳结果可以清楚看到
２３Ｓ、１６Ｓ、５Ｓ 的 ３ 条带ꎬＲＮＡ 样品完整性良好ꎬ将
同一浓度的 ＲＮＡ 反转录合成第一链 ｃＤＮＡꎬ建立
荧光定量 ＰＣＲ 反应体系ꎮ 实时定量 ＰＣＲ 结果显
示ꎬ各基因的熔解曲线具有单一峰值ꎬ说明产物特
异性良好ꎮ
　 　 根据扩增结果得到的 Ｃｔ 值ꎬ用 ２－△△ＣＴ法计算
ｈｒｐＡ、ｈｒｃＶ、ｈｒｃＵ、ＬｕｘＩ、ＬｕｘＲ ５ 个基因在 ＭｈｒｃＮ 中
的相对表达量ꎬ各个基因分别上调 ５. ５０ 倍、７. ０６
倍、７.４７倍、１０.０３ 倍、９.６０ 倍(图 ６)ꎮ ５ 个基因在
突变体中的表达量均上调ꎬ说明 ｈｒｃＮ 对这 ５ 个基
因均是负调控ꎮ
　 　 果斑病菌中 ｈｒｐＡ 基因是依赖 ＡＴＰ 的解旋酶
(ＡＴＰ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｅｌｉｃａｓｅ ｈｒｐＡ)ꎬｈｒｃＶ和 ｈｒｃＵ是组
成 ＩＩＩ型分泌系统的蛋白ꎬＬｕｘＩ 蛋白是自体诱导物
合成酶ꎬ能够合成酰基高丝氨酸内酯(ＡＨＬ)类信
号分子ꎬ是产生群体感应信号的物质ꎬＬｕｘＲ蛋白是
细胞内自体诱导物感受因子ꎬ是接受信号的物质ꎬ
当胞外的 ＡＨＬｓ 信号达到临界值时就与 ＬｕｘＲ 蛋
白结合ꎬ结合物能激发相关基因的表达[１４ꎬ１５]ꎬ群
体感应系统中产生ＡＨＬｓ信号的多少与细菌数量
Ｆｉｇ. ５　 Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａａｃ５ꎬＭｈｒｃＮ ａｎｄ ＣＭｈｒｃＮ
Ａ:Ａａｃ５ꎻ Ｂ:ＭｈｒｃＮꎻ Ｃ:ＣＭｈｒｃＮ.
Ｆｉｇ. ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｒｐＡꎬ ｈｒｃＶꎬ ｈｒｃＵꎬ ＬｕｘＩ ａｎｄ ＬｕｘＲ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
８３
　
　 １期 严婉荣ꎬ等:瓜类细菌性果斑病菌 ｈｒｃＮ基因的生物学功能分析
有关ꎬ随着细菌密度的增高ꎬ信号分子浓度也会随
之增高ꎬ虽然突变体中 ＬｕｘＩ、ＬｕｘＲ ２ 个基因的表达
量增加ꎬ但是突变体的生长能力、运动能力都明显
下降ꎬ与野生型相比ꎬ单位时间内细菌的密度较小ꎬ
产生的信号分子量也比较少ꎮ 另外ꎬ细菌有自我调
节功能ꎬ当 ＬｕｘＩ、ＬｕｘＲ ２ 个基因高表达时ꎬ推测信
号从产生到接受过程中也有可能受阻ꎮ 因此ꎬ出现
了基因表达量和表型变化不相符的现象ꎮ
３　 结论与讨论
　 　 瓜类细菌性果斑病是一种严重为害葫芦科作
物的病害ꎬ国内外关于该病的研究主要集中在病原
鉴定[６]、种子带菌检测[１７]、药剂防治[１８]、遗传多样
性[１９]等方面ꎮ 近年来ꎬ其研究多集中在基因克隆
及功能分析ꎬ尤其对群体感应、鞭毛和菌毛及Ⅲ型
分泌系统的研究较多[２０－２２]ꎮ
　 　 本研究以 ＩＩＩ 型分泌系统中产生 ＡＴＰａｓｅ 的
ｈｒｃＮ基因为研究对象ꎬ借助基因敲除载体和同源
重组原理获得了 ｈｒｃＮ 基因部分缺失的突变菌株ꎬ
突变体致病性及表型变化明显ꎬ互补菌株可以部分
恢复其功能ꎮ 通过测定突变体的部分表型变化和
对突变体进行荧光定量ꎬ初步明确了 ｈｒｃＮ 基因在
果斑病菌中的作用ꎬ为防治该病害提供了分子基
础ꎮ Ｌｉｕ等[２３]通过 Ｔｎ５ 转座子插入的方法构建了
果斑病菌基因组突变体文库ꎬ通过序列分析发现转
座子插入到 ｈｒｃＮ 基因的第 ９３８ 个碱基处ꎬ突变体
丧失了侵染黄瓜引起果斑病症状的能力ꎬ失去了诱
导烟草产生过敏性反应的能力ꎬ这与本研究的结果
基本一致ꎬ不同的是本研究中突变体在接种 ４８ ｈ
后有轻微的过敏反应ꎮ Ｌｏｒｅｎｚ[８]等的研究证明ꎬ在
黄单胞菌中 ＨｒｃＮ是一个重要的致病因子ꎬ当 ｈｒｃＮ
基因突变时突变体丧失了在辣椒上的致病能力ꎬ
ＨｒｃＮ可与内膜蛋白 ｈｒｃＶ 和 ｈｒｃＵ 进行互作[２４]ꎬ进
一步说明 ＩＩＩ 型分泌系统中的 ｈｒｃＮ 基因与细菌的
致病性密切相关ꎮ
　 　 在果斑病菌的 ＩＩＩ 型分泌系统中ꎬｈｒｃＮ 基因的
产物为 ＡＴＰａｓｅꎬ编号 Ａａｖｅ０４６３ꎬＡＴＰａｓｅ 可以催化
ＡＴＰ产生能量ꎬＩＩＩ 型分泌系统中许多效应蛋白的
转运需要能量ꎬ而有些效应蛋白决定了病菌对寄主
的致病性ꎬ因此 ｈｒｃＮ 基因的缺失可能导致某些需
要能量转运的致病性蛋白的转运受阻ꎬ进而导致致
病力下降ꎬ一定程度上影响了细菌的表型ꎮ ｈｒｃＮ
基因的突变导致群体感应信号的减弱ꎬ推测群体感
应系统中某些信号可能通过 ＩＩＩ 型分泌系统来分
泌ꎬ或者 ＩＩＩ型分泌系统间接地影响了群体感应系
统ꎮ 细菌中有些基因是细胞生长必须的ꎬ如果将这
些基因突变后会导致细胞死亡ꎬ但是 ｈｒｃＮ 基因的
部分缺失并没有使细胞死亡ꎬ推测 ｈｒｃＮ 基因只是
对细菌的致病力及相关表型有影响ꎮ 另外ꎬ产生
ＡＴＰａｓｅ的基因除了Ⅲ型分泌系统中的 ｈｒｃＮ 基因ꎬ
与 ＡＴＰａｓｅ 有关的基因有很多ꎬ其中直接产生 ＡＴ￣
Ｐａｓｅ 的基因有 ３ 个ꎬ 编号分别为 Ａａｖｅ１０６３、
Ａａｖｅ１２４９和 Ａａｖｅ２１６３ꎬＩＩＩ型分泌系统中某些蛋白
转运需要的能量可能从这 ３个直接产生 ＡＴＰａｓｅ的
基因中获取ꎮ
　 　 本研究仅对 ｈｒｃＮ 基因的功能做了初步探索ꎬ
探究 ｈｒｃＮ基因的具体功能ꎬ例如 ｈｒｃＮ基因所表达
的蛋白质体外纯化后是否能将 ＡＴＰ 水解ꎬ它是单
独行使功能还是需要其他基因的协作来完成 ＡＴＰ
的水解ꎬｈｒｃＮ基因突变后与野生型表现出不同的
性状ꎬ这种性状差异能否通过补偿外界 ＡＴＰａｓｅ 而
使之恢复等需要进一步深入研究ꎮ
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[１８] Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｄ Ｌꎬ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｃ Ｍꎬ Ｈｉｌｇｒｅｎ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｗｅｔ
ｓｅｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｅｒｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｒｕｉｔ ｂｌｏｔｃｈ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｅｅｄｂｏｒｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ
ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ ２００３ꎬ ８７(１２): １４９５－
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[１９] Ｗａｌｃｏｔｔ Ｒ Ｒꎬ Ｆｅｓｓｅｈａｉｅ Ａꎬ Ｃａｓｔｒｏ Ａ Ｃ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｒｏｕｐｓ
ｏｆ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｕｌｌｉ ｏｎ ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｈｏｓｔｓ
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ １５２:２７７－２８５.
[２０] Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｋ. Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｆｆｅｃｔｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｅｅｄ￣
ｔｏ￣ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ.
ｃｉｔｒｕｌｌｉꎬ ｔｈｅ ｃａｕｓａｌ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｒｕｉｔ ｂｌｏｔｃｈ[ Ｊ] .
Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０１０ꎬ １００(Ｓ) : １４８.
[２１] Ｂａｈａｒ Ｏꎬ Ｄｅ Ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ Ｌꎬ Ｂｕｒｄｍａｎ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ
ａｄｈｅｓｉｏｎꎬｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ
ｃｉｔｒｕｌｌｉ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒｓ [ Ｊ] . ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓꎬ ２０１０ꎬ ３１２(１):３３－３９.
[２２] ＷａｎｇＸꎬ Ｗａｎｇ Ｗꎬ Ｑｉａｎ Ｇ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｕｌｌｉ
ｐａｒｔｉａｌ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ(ｈｒｐ)
ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ[ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ￣
ｇｙꎬ ２０１１ꎬ １９(１):３６－４４.
[２３] Ｌｉｕ Ｊꎬ Ｌｕｏ Ｓ Ｚꎬ Ｚｈａｎｇ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｎ５ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ [ Ｊ ] .
Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０１２ꎬ ６１(２):３６４－３７４.
[２４] Ｌｏｒｅｎｚ Ｃꎬ Ｈａｕｓｎｅｒ Ｊꎬ Ｂüｔｔｎｅｒ Ｄ. ＨｒｃＱ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ
ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌａｔｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ[Ｊ] . ＰＬｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１２ꎬ ７
(１１): ５１０６３.
责任编辑:于金枝
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