全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(１): ９３￣９６(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０２￣１２ꎻ 修回日期: ２０１４￣１１￣１５
基金项目: 农业部公益性行业科研专项(２０１００３００４)ꎻ 安徽省农科院院长青年基金(１１Ｂ１１１１)
通讯作者: 戚仁德ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病原真菌学及 ＩＰＭ技术研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｒｅｎｄｅ７＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０１.０１４
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研究简报
利用环介导等温扩增(ＬＡＭＰ)技术快速检测辣椒疫霉菌
赵 伟１ꎬ ２ꎬ 汪 涛１ꎬ ２ꎬ 戚仁德１ꎬ ２∗
( １安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所ꎬ合肥 ２３００３１ꎻ ２ 农业部合肥有害生物科学观测实验站ꎬ合肥 ２３００３１)
Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ ｂｙ ａ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ (ＬＡＭＰ) ａｓｓａｙ 　 ＺＨＡＯ Ｗｅｉ１ꎬ ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｔａｏ１ꎬ ２ꎬ ＱＩ Ｒｅｎ￣ｄｅ１ꎬ ２ 　 ( １ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ａｇｒｏ￣ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｓａｆｅｔｙꎬ Ａｎｈｕｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈｅｆｅｉ ２３００３１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｐｅｓｔｓ ｉｎ Ｈｅｆｅｉꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｈｅｆｅｉ ２３００３１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉꎬ ａ ｓｅｔ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ
ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ (ＬＡＭＰ) ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｒａｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ￣ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ
(ＰｃＹｐｔ１) ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ. Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ ｉｓｏｌａｔｅｓꎬ ｃｌｏｓｅｌｙ
ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ.ꎬ Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｐ. ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｎｌｙ Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ ｇａｖｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ａｌｌ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｔｅｓｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇａｖｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ. Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ＰｃＹｐｔ１ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ １００ ｐｇ / μＬ Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ. Ｔｈｕｓꎬ ｔｈｅ ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｒｅｌｉ￣
ａｂｌｅꎬ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｃｏｓｔ￣ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ ｉｎ ｆｉｅｌｄ￣ｇｒｏｗｎ ｐｅｐｐｅｒ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｏ￣
ｄｕｃｔｉｏｎ ｆｉｅｌｄｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉꎻ ＬＡＭＰꎻ ＰｃＹｐｔ１
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０１￣００９３￣０４
　 　 辣椒疫霉(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ)是一种重要
植物病原菌ꎬ能造成植株坏死、果实腐烂ꎬ严重影响
产量[１]ꎮ 辣椒疫霉侵染植物的早期病症并不明
显ꎬ易被忽视ꎮ 因此ꎬ对辣椒疫霉早期快速、准确检
测显得尤为重要ꎮ
　 　 聚合酶链式反应(ＰＣＲ)为动植物病原物检测
的重要方法ꎬ但需要较昂贵的仪器、试剂与耗材ꎬ后
期的电泳检测也费时费力ꎬ致使这一技术很难在生
产一线普及推广ꎮ Ｎｏｔｏｍｉ 等 ２０００ 年研发了环介
导等温扩增技术(ＬＡＭＰꎬ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ) [２]ꎬ只需在 ６５℃恒温条件下对目标
片段进行扩增ꎬ在反应体系中加入羟基萘酚蓝
(ＨＮＢꎬ ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈｏｌ ｂｌｕｅ)ꎬ若溶液颜色由紫色
变为天蓝色ꎬ则说明其中存在被扩增的目标片
段[３]ꎮ 该方法已广泛应用于植物病毒、病原真菌、
卵菌的检测ꎮ 本研究以编码小 Ｇ蛋白的 Ｙｐｔ１作为
靶标基因ꎬ设计出 ＬＡＭＰ引物组ꎬ通过恒温扩增进
行辣椒疫霉检测ꎮ 该方法不需昂贵设备ꎬ操作简
单ꎬ特异性强ꎬ结果直观ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 供试菌株: 辣椒疫霉(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ)、
大豆疫霉(Ｐ. ｓｏｊａｅ)、恶疫霉(Ｐ. ｃａｃｔｏｒｕｍ)、隐地
疫霉(Ｐ. ｃｒｙｐｔｏｇｅａ)、烟草疫霉(Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ)、棕
榈疫霉(Ｐ. ｐａｌｍｉｖｏｒａ)、瓜类疫霉(Ｐ. ｍｅｌｏｎｉｓ)、掘
　
植物病理学报 ４５卷
氏疫霉(Ｐ. ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ)、荔枝疫霉(Ｐ. ｌｉｔｃｈｉｉ)、苎麻
疫霉(Ｐ. ｂｏｅｈｍｅｒｉａｅ)、致病疫霉(Ｐ. ｉｎｆｅｓｔａｎｓ)、苜
蓿疫霉(Ｐ. ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ)、樟疫霉(Ｐ. ｃｉｎｎａｍｏｍｉ)、
寄生疫霉(Ｐ. ｐａｒａｓｉｔｉｃａ)、腐霉属(Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｐ.)、
镰刀菌属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ.)、小麦纹枯病菌(Ｒｈｉｚｏｃ￣
ｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ)、稻瘟病菌(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ)、辣
椒炭疽病菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ)、油菜菌核病
菌(Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ)、灰葡萄孢菌(Ｂｏｔｒｙｔｉｓ
ｃｉｎｅｒｅａ)ꎬ由安徽省农科院、南京农业大学和福建
农科院提供ꎮ
１.２　 菌株培养、菌丝制备及 ＤＮＡ提取
　 　 采用 ５点取样法从发生辣椒疫病的田块采集
土样ꎬ混匀后称取 ０.５ ｇ 作为检测样品ꎬ将 １００ μＬ
含有 １００个游动孢子的悬浮液注入该样品ꎬ作为阳
性对照ꎮ 将采自未发病田块的土样作阴性对照ꎮ
用 ＦａｓｔＤＮＡ® ＳＰＩＮ 试剂盒(Ｑ￣Ｂｉｏｇｅｎｅ Ｌｔｄꎬ ＵＳＡ)
按说明书提取样品 ＤＮＡꎮ 试验重复 ３次[４]ꎮ
１.３　 引物设计
　 　 分别从辣椒疫霉 ＰｃＹｐｔ１(Ｐｃ８３１８)、大豆疫霉
ＰｓＹｐｔ１(Ｐｓ＿３０９１３６)、橡树疫霉 ＰｒＹｐｔ１(Ｐｒ＿７１３９１)、
致病疫霉 ＰｉＹｐｔ１(ＰＩＴＧ＿０３３９２)、寄生疫霉 ＰｐＹｐｔ１
(ＰＰＴＧ＿１４８２３)的数据库中下载 Ｙｐｔ１ 的基因组序
列进行比对分析ꎬ利用在线软件 ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅ Ｖ４
设计辣椒疫霉 ＬＡＭＰ 引物ꎬ外引物 Ｆ３ / Ｂ３ꎬ前内引
物(ＦＩＰ)由 Ｆ１反向互补序列 Ｆ１ｃ 加上 Ｆ２ 构成ꎬ后
内引物(ＢＩＰ)由 Ｂ１反向互补序列 Ｂ１ｃ 加上 Ｂ２ 构
成ꎬ环引物 ＬＢ位于 Ｂ２和 Ｂ１之间(图 １￣Ａ、Ｂ)ꎮ
１.４　 ＬＡＭＰ反应体系
　 　 ２５ μＬ反应体系中包括 ２.５ μＬ １０×热聚合酶缓冲
液 (Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ)ꎬ甜菜碱 (Ｂｅｔａｉｎｅꎬ
０.８ ｍｏｌ / Ｌ)ꎬＭｇＳＯ４(８ ｍｍｏｌ / Ｌ)ꎬ羟基萘酚蓝(ＨＮＢꎬ
１５０ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬｄＮＴＰ (１. ４ ｍｍｏｌ / Ｌ)ꎬ内引物 ＦＩＰ、
ＢＩＰ各１.６ μｍｏｌ / Ｌꎬ外引物Ｆ３、Ｂ３各０.２ μｍｏｌ / Ｌꎬ
Ｆｉｇ. １　 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ａ: ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐａｒｔｉａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｐｔ１ ｇｅｎｅ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ ｆｒｏｍ
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ (ＰｃＹｐｔ１)ꎬ Ｐ. ｓｏｊａｅ (ＰｓＹｐｔ１)ꎬ Ｐ. ｒａｍｏｒｕｍ (ＰｒＹｐｔ１)ꎬ Ｐ. ｉｎｆｅｓｔａｎｓ (ＰｉＹｐｔ１) ａｎｄ
Ｐ. ｐａｒａｓｉｔｉｃａ (ＰｐＹｐｔ１)ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ ｉｎ ｇｒｅｙ ｌｉｎｅｓ.
Ｂ: Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ.
４９
　
　 １期 赵 伟ꎬ等:利用环介导等温扩增(ＬＡＭＰ)技术快速检测辣椒疫霉菌
环引物 ＦＬ、ＢＬ各 ０.８ μｍｏｌ / Ｌꎬ１ μＬ Ｂｓｔ ＤＮＡ 聚合
酶ꎬＤＮＡ模板１ μＬꎬ灭菌去离子水定容至 ２５ μＬꎮ
６５℃恒温水浴 ６０ ~ ８０ ｍｉｎꎮ 阳性反应与阴性反应
判断标准:反应后溶液颜色保持紫色不变的为阴性
反应ꎬ溶液颜色由紫色变为天蓝色的为阳性反应ꎮ
最后进一步凝胶电泳检测[２ꎬ４]ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ引物的特异性
　 　 恒温水浴 １ ｈ 后观察反应小离心管中溶液颜
色的变化ꎮ 结果只有以辣椒疫霉基因组为模板的
反应管中ꎬ溶液由紫色变为天蓝色ꎬ即发生了阳性
反应ꎬ而以其他疫霉、腐霉或真菌基因组作为模板
进行 ＬＡＭＰ扩增时ꎬ溶液颜色没有变化ꎬ表明其为
阴性反应(图 ２￣Ａ)ꎮ 进一步通过 ２％的琼脂糖凝胶
电泳和 ＥＢ染色观察ꎬ以辣椒疫霉基因组为模板的
扩增产物呈现典型 ＬＡＭＰ 梯型条带ꎬ而其他病原
菌没有扩增条带(图 ２￣Ｂ)ꎮ 说明 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ 引
物可以作为辣椒疫霉的特异性检测靶标ꎮ
２.２　 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ检测辣椒疫霉菌的灵敏度
　 　 将 １ μｇ / μＬ 标准辣椒疫霉菌株 ＤＮＡ １０ 倍梯
度稀释至 １００ ｆｇ / μＬꎬ分别作反应模板ꎬ６５℃等温条
件下反应 ８０ ｍｉｎꎮ 凝胶电泳(图 ３￣Ａ)和 ＨＮＢ显色
(图 ３￣Ｂ)结果均显示ꎬ在 ２５ μＬ 的反应体系中ꎬ
ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ检测灵敏度为 １００ ｐｇ / μＬꎮ
２.３　 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ的检测应用
　 　 以辣椒疫病发病株提取的总 ＤＮＡ 为模板进
行 ＬＡＭＰ 扩增ꎬ结果表明 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ 可以特异
性地检测出辣椒疫霉ꎮ 为进一步比较验证不同检
测技术的灵敏度ꎬ采集了不同地区的疑似辣椒疫病
发病株 ８３份ꎬ通过常规分离培养和形态学鉴定ꎬ共
分离鉴定出辣椒疫霉 ２１份ꎬ检出率为 ２５.３％ꎻ用常
规 ＰｃＹｐｔ１ＰＣＲ检测ꎬ共检测出阳性样品４８份(其
Ｆｉｇ. ２　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ
Ｌａｎｅ １￣４: Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉꎻ Ｌａｎｅ ５￣１７: Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ.ꎻ Ｌａｎｅ １８ꎬ１９: Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｐ..
Ａ: Ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ ｂｙ ＨＮＢ ｉｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｕｂｅ. Ｂ: ２％ ａｇｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ.
５９
　
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ
Ｌａｎｅ １￣５: １ μｇ / μＬꎬ １００ ｎｇ / μＬꎬ １０ ｎｇ / μＬꎬ １ ｎｇ / μＬꎬ １００ ｐｇ / μＬꎻ
Ｌａｎｅ ６￣８: １０ ｐｇ / μＬꎬ １ ｐｇ / μＬꎬ １００ ｆｇ / μＬ. Ａ: ２％ ａｇｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ.
Ｂ: Ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ ｂｙ ＨＮＢ ｉｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｕｂｅ.
中包含常规分离检出的 ２１ 份病株)ꎬ检出率５７.８％ꎻ
而使用 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ 检测的阳性样品为 ４６ 份(其
中亦包括常规分离检出的 ２１ 份病株)ꎬ检出率为
５５.４％ꎮ 表明ꎬＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ 与常规 ＰＣＲ 的检测结
果相似ꎬ检出率远高于传统分离鉴定方法ꎮ
　 　 利用 ＰｃＹｐｔ１ ＰＣＲ 和 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ 检测发病
田块土样 ５２份ꎬ其中 ＰｃＹｐｔ１ ＰＣＲ检测阳性反应土
样 １５ 份ꎬ检出率为 ２８. ８％ꎻ而使用 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ
检测ꎬ检测出阳性反应土样 １８ 份 (其中包括
ＰｃＹｐｔ１ ＰＣＲ检出的 １５份)ꎬ检出率 ３４.６％ꎮ
３　 讨论
　 　 ＬＡＭＰ 技术具有普通 ＰＣＲ 所不能比拟的优
点ꎬ整个过程只需一个恒温水浴锅ꎬ且结果直观ꎬ可
通过溶液颜色变化直接判断ꎬ不需要专门的检测成
像系统ꎮ 同时可结合 ＮａＯＨ 法快速基因组提取技
术[５]ꎬ将 ＬＡＭＰ病原分子检测技术直接应用到田
间地头ꎮ
　 　 ＬＡＭＰ检测一般要设计出 ４ ~ ６ 条引物ꎬ特异
性检测靶标的确定最为关键ꎮ 本文使用的 Ｙｐｔ１ 是
个单拷贝 Ｒａｓ相关编码蛋白基因ꎬ其基因序列由保
守编码区与变异的非编码区相互间隔ꎬ适于开发为
检测靶标ꎮ 本研究选用辣椒疫霉 Ｙｐｔ１ 基因序列中
的 ２个内含子间包含有一段外显子的区域作为引
物设计区ꎬ由 ５条引物组成 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ组ꎬ试验
表明该引物组具有种间特异性ꎬ能满足辣椒疫霉检
测鉴定的要求ꎮ 本研究 ＰｃＹｐｔ１￣ＬＡＭＰ引物的检测
灵敏度为 １００ ｐｇ / ｍＬꎬ可满足病害预测预报或染病
植株及田间残留病原体的检测ꎮ ＬＡＭＰ 检测具有
操作简单、检测特异性强、灵敏度高、结果直观的特
点ꎮ 本研究以 Ｙｐｔ１为靶标设计出的分子检测方法
可为辣椒疫霉所致病害的早期预警提供可靠的技
术支撑ꎮ 同时ꎬ因其所需仪器简单、成本低ꎬ该项技
术便于在生产中普及应用ꎮ
致谢:南京农业大学王源超教授、福建农科院陈庆
河研究员惠赠了部分菌株ꎮ
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责任编辑:于金枝
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