全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０９４ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
许沛冬，郑肖兰，赵艳，李秋洁，吴伟怀，贺春萍，习金根，梁艳琼，郑金龙，戚山江，张晓波，易克贤．柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株１８６９的ＴＤＮＡ
插入位点侧翼序列的克隆．草业学报，２０１５，２４（８）：１４２１４９．
ＸｕＰＤ，ＺｈｅｎｇＸＬ，ＺｈａｏＹ，ＬｉＱＪ，ＷｕＷ Ｈ，ＨｅＣＰ，ＸｉＪＧ，ＬｉａｎｇＹＱ，ＺｈｅｎｇＪＬ，ＱｉＳＪ，ＺｈａｎｇＸＢ，ＹｉＫＸ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆｔｈｅｆｌａｎｋｉｎｇｇｅｎｅｏｆＴＤＮＡｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ，ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｄｅｆｅｃｔｉｖｅ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊ｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎ１８６９．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，
２０１５，２４（８）：１４２１４９．
柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株１８６９的
犜犇犖犃插入位点侧翼序列的克隆
许沛冬１，２，郑肖兰２，赵艳１，李秋洁２，吴伟怀２，贺春萍２，习金根２，
梁艳琼２，郑金龙２，戚山江１，张晓波４，５，易克贤２，３
（１．海南大学农学院，海南 海口５７０２２８；２．中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口５７１１０１；３．中国热带农业科学院
热带生物技术研究所，海南 海口５７１１０１；４．热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室（海南大学），
海南 海口５７０２２８；５．海南大学旅游学院，海南 海口５７０２２８）
摘要：通过对实验室已构建的柱花草炭疽菌ＴＤＮＡ突变体库中各转化子致病力的测定，获得致病力丧失突变菌株
１８６９。对其进行ＰＣＲ检测以验证ＴＤＮＡ在１８６９基因组中插入情况，并测定观察其菌落直径、菌落形态及产孢量
等生物学特性，利用ＴＡＩＬＰＣＲ克隆标记基因侧翼序列，采用生物信息学方法比对基因信息。结果表明，与柱花草
炭疽菌野生型菌株ＣＨ００８相比，突变菌株１８６９表现致病力丧失，菌落生长速率也显著低于野生型；然而，在分生
孢子形态、产孢能力、孢子萌发率等方面与野生型并无明显差异。ＴＡＩＬＰＣＲ扩增得到ＴＤＮＡ插入位点ＲＢ端序
列４６７ｂｐ，ＬＢ端侧翼序列３８８ｂｐ，经两侧序列拼接比对，所得序列与犘犪犮１同源性达到９２％～９６％，推测可能由于
基因表达产物调节菌株对ｐＨ值的敏感性，从而影响了其致病过程。
关键词：柱花草；炭疽菌；ＴＤＮＡ；致病力；基因克隆
犕狅犾犲犮狌犾犪狉犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狕犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犳犾犪狀犽犻狀犵犵犲狀犲狅犳犜犇犖犃犻狀狊犲狉狋犻狅狀犪犾，狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犻狋狔
犱犲犳犲犮狋犻狏犲犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀１８６９
ＸＵＰｅｉＤｏｎｇ１，２，ＺＨＥＮＧＸｉａｏＬａｎ２，ＺＨＡＯＹａｎ１，ＬＩＱｉｕＪｉｅ２，ＷＵ ＷｅｉＨｕａｉ２，ＨＥＣｈｕｎＰｉｎｇ２，ＸＩＪｉｎ
Ｇｅｎ２，ＬＩＡＮＧＹａｎＱｉｏｎｇ２，ＺＨＥＮＧＪｉｎＬｏｎｇ２，ＱＩＳｈａｎＪｉａｎｇ１，ＺＨＡＮＧＸｉａｏＢｏ４，５，ＹＩＫｅＸｉａｎ２，３
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲，犎犪犻狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犎犪犻犽狅狌５７０２２８，犆犺犻狀犪；２．犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犪狀犱犘犾犪狀狋犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犆犃犜犃犛，
犎犪犻犽狅狌５７１１０１，犆犺犻狀犪；３．犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犜狉狅狆犻犮犪犾犅犻狅狊犮犻犲狀犮犲犪狀犱犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犆犃犜犃犛，犎犪犻犽狅狌５７１１０１，犆犺犻狀犪；４．犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅
狉狔狅犳犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犇犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犝狋犻犾犻狕犪狋犻狅狀狅犳犜狉狅狆犻犮犪犾犆狉狅狆犌犲狉犿狆犾犪狊犿犚犲狊狅狌狉犮犲狊（犎犪犻狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔），犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犈犱狌犮犪
狋犻狅狀，犎犪犻犽狅狌５７０２２８，犆犺犻狀犪；５．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犜狅狌狉犻狊犿，犎犪犻狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犎犪犻犽狅狌５７０２２８，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊ｉｓａｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｏｆ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃａｕｓｉｎｇａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ
ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｄｅｆｅｃｔｉｖｅｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆ犆．犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊ｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｉｎｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄｓｔｒａｉｎ
１８６９ｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｓｔｕｄｙ．ＴｈｅｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｗｉｌｄｔｙｐｅｓｔｒａｉｎＣＨ００８ｆｏｒｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ，ｃｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙａｎｄｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅ．Ｃｏｌｏ
第２４卷 第８期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．８
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年８月
Ａｕｇ，２０１５
收稿日期：２０１５０２２０；改回日期：２０１５０３３０
基金项目：国家自然科学基金（３１０７２０７６，３１１０１４０８），公益性行业科研专项（２０１３０３０５７）和中央级公益性科研院所基本科研业务专项
（２０１５ｈｚｓ１Ｊ００２）资助。
作者简介：许沛冬（１９９０），男，内蒙古集宁人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｘｕｒｉｄｏｎｇｓｈｅｎｇｘｐｄ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｙｉｋｅｘｉａｎ＠１２６．ｃｏｍ，ａｎｇｉａｏｏ＠１２６．ｃｏｍ
ｎｙｄｉａｍｅｔｅｒｏｆＣＨ００８ａｎｄｓｔｒａｉｎ１８６９ｄｉｆｆｅｒｅｄ，ｂｕｔｔｈｅｏｔｈｅｒｔｒａｉｔｓｄｉｄｎｏｔ．ＤＮＡｏｆｔｈｅｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎｗａｓｅｘ
ｔｒａｃｔｅｄ，ａｎｄｕｓｉｎｇｔｈｅｒｍａｌａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｉｎｔｅｒｌａｃｅｄＰＣＲ（ＴＡＩＬ－ＰＣＲ）ａＴ－ＤＮＡｉｎｓｅｒｔｉｏｎｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｂｅ
ｌｉｅｖｅｄｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｌｏｓｓｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．ＴｈｅＲＢａｎｄＬＢｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｔｔｈｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎ
ｓｉｔｅｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄ，ａｌｓｏｕｓｉｎｇＴＡＩＬ－ＰＣＲ．ＴｈｅＲＢｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ４６７ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈ，ｗｈｉｌｅｔｈｅＬＢｆｌａｎ
ｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ３８８ｂｐ．ＴｈｅＢＬＡＳＴｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈａｄ９２％－９６％ ｈｏｍｏｌｏｇｙｔｏｇｅｎｅ
犘犪犮１．Ｂｙｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆａｐｒｏｔｅｉｎｃｏｄｅｄｂｙｔｈｅｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｗｅｉｎｆｅｒｒｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｅｉｎｑｕｅｓ
ｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｐＨ，ａｎｄｉｎｔｈｉｓｗａｙａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆ犆．犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻犪狊；犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊；ＴＤＮＡ；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ；ｇｅｎｅｃｌｏｎｅ
柱花草（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊）是广泛种植于热带、亚热带地区的优质豆科牧草，在我国有“北有苜蓿
（犕犲犱犻犮犪犵狅），南有柱花草”的美誉，被称为“热带牧草之王”［１２］。柱花草炭疽病是影响柱花草产量的重要病害，其
主要由病原真菌胶孢炭疽菌（犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊）引起，病原菌可侵染柱花草叶片、叶柄、茎秆乃至花
序等各个部位，且存在高度的遗传变异性及生物多样性［３４］。炭疽菌危害的植物种类繁多，包括各类木本、草本植
物，直到近年来，仍有炭疽菌感染新的植物的报道，如当归（犃狀犵犲犾犻犮犪狊犻狀犲狀狊犻狊）［５］等。对于炭疽病的防治而言，在
化学防治及抗病品种的选育遭遇巨大的瓶颈后，众多的学者将目光投向于对病原菌致病相关基因的分离与研究，
以期望了解病原菌的侵染及致病机制，而根癌农杆菌介导遗传转化（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＡＴＭＴ）的ＴＤＮＡ插入突变技术即成为了研究致病相关基因的有效手段［６８］。自１９９５年，Ｂｕｎｄｏｃｋ
等［９］首次利用根癌农杆菌成功介导酵母菌遗传转化以来，ＡＴＭＴ法已经在构建真菌的突变体库中取得了巨大的
进展。在炭疽菌方面，有关专家学者先后对黄瓜（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）［１０］、香蕉（犕狌狊犪狀犪狀犪）［１１］、芒果（犕犪狀犵犻犳犲狉犪
犻狀犱犻犮犪）［１２］等遗传转化体系进行研究，本实验室胡彩平等［１３］对柱花草炭疽菌进行了遗传转化体系的优化。利用
ＡＴＭＴ，国内外学者纷纷筛选得到了部分炭疽菌致病相关基因，如Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ等［１４］获得了犆犵犇犖３基因，该基
因在侵染寄主的活体营养阶段表达；Ｔｈｏｎ等［１５］获得了犆犘犚１基因，其为编码信号肽基因。但柱花草炭疽菌的致
病相关基因尚未有报道。
本试验对筛选得到的柱花草炭疽菌致病力丧失菌株１８６９进行了生物学性状的分析，用分子生物学手段分析
１８６９菌株ＴＤＮＡ的序列插入位点，通过ＴＡＩＬＰＣＲ技术克隆侧翼序列，对该序列在炭疽病菌致病过程的作用
进行分析，希望能够为柱花草炭疽病致病相关基因的克隆和研究提供一定的理论基础，为柱花草炭疽病的致病机
理以及防治策略提供一定的分子参考依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌株 参试菌株包括野生型菌株ＣＨ００８以及突变菌株１８６９。其中ＣＨ００８为实验室分离获得的强致
病力炭疽菌株［１６］，突变菌株１８６９则是由柱花草炭疽菌野生型菌株ＣＨ００８通过农杆菌介导遗传转化（ＡＴＭＴ）的
ＴＤＮＡ插入获得的致病力丧失突变体。所用根癌农杆菌菌株为ＡＧＬ１，该菌内含ｐＳＵＬＦ．ｇｆｐ质粒，以ｐＣＡＭ
ＢＩＡｌ３００为骨架，含有氯嘧磺隆抗性标记基因ＩＬＶ１以及报告基因ＧＦＰ的二元载体［１７］。菌株均保存于实验室
－７０℃冰箱。
１．１．２ 培养基及主要仪器 ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ培养基（ＬＢ）：蛋白胨１０．０ｇ，酵母膏５．０ｇ，ＮａＣｌ８．０ｇ，Ａｇａｒ２０ｇ，
补充ｄｄＨ２Ｏ至１０００ｍＬ，ｐＨ值７．０。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅａｇａｒ，ＰＤＡ）：马铃薯２００ｇ，葡萄糖１５～２０ｇ，琼脂１５～２０ｇ，补
充ｄｄＨ２Ｏ至１０００ｍＬ。其对应液体培养基则不加琼脂。
主要仪器：ＨＺＯＦ１６０型全温振荡培养箱，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５３３３型梯度ＰＣＲ仪，ＬＤＺＸ７５ＫＢ高压蒸汽灭菌锅，
ＯＬＹＭＰＵＳＵＲＦＬＴ型荧光数码生物显微镜，７２１型分光光度计，便携式ＣＰ４０１型ｐＨ计。
１．１．３ 引物与主要试剂 试验所用引物名称及序列见表１。引物合成由上海英潍捷基及英骏生物技术公司
３４１第８期 许沛冬 等：柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株１８６９的ＴＤＮＡ插入位点侧翼序列的克隆
完成，测序工作由上海立菲生物技术有限公司完成。
ＤＮＡ Ｍａｋｅｒ、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶购自 ＴａＫａＲａ公司。
ＦｕｎｇｌｅｇＤＮＡＫｉｔ购于Ｂｉｏｍｉｇａ公司；ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉ
ＫｉｔＩ购于 Ｏｍｅｇａ公司；ｐＥＡＳＹＴ１Ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒ、
犈．犮狅犾犻ｔｒａｎｓＴ１，购自于北京全式金生物技术有限公
司。
１．１．４ 试验时间 ２０１４年８月至１２月于中国热
带农业科学院环境与植物保护研究所完成全部试验内
容。
１．２ 试验方法
１．２．１ 突变菌株致病力分析 突变体菌株致病力
测定采用菌饼反接离体叶片法。柱花草选用炭疽病易
感病品种格拉姆，于２０１４年８月，柱花草生长旺盛时
期选取叶龄７ｄ左右的柱花草三出复叶，针刺叶片，将
菌饼接种在叶片上（菌丝面紧贴伤口），设置２个对照，
野生型ＣＨ００８及空白ＰＤＡ培养基饼块。将叶片放置
在培养盘中，设３个重复，盘内进行保湿处理，保鲜膜
封口，２８℃恒温培养５ｄ，观察叶片发病情况。
１．２．２ ＴＤＮＡ插入稳定性ＰＣＲ检测 ２０１４年８
月，将菌株于ＰＤＡ培养基上活化，２８℃恒温培养６ｄ，
收集孢子及菌丝，于ＰＤＡ液体培养基中，２８℃１８０
表１ 试验所用引物
犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犻狀狋犺犲狉犲狊犲犪狉犮犺
引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ 引物序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
ＧＦＰ１ ＴＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ
ＧＦＰ２ ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧ
ＬＢ１ ＧＧＧＴＴＣＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＧ
ＬＢ２ ＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＡＧＡＡＡＣＣＣＴ
ＬＢ３ ＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＧＧＣＧＴＴＡＡＴＴＣＡＧＴ
ＲＢ１ ＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ
ＲＢ２ ＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴ
ＲＢ３ ＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡ
ＡＤ１ ＡＧＷＧＮＡＧＷＡＮＣＡＷＡＧＧ
ＡＤ２ ＷＡＧＴＧＮＡＧＷＡＮＣＡＮＡＧＡ
ＡＤ３ ＷＡＧＴＧＮＡＧＷＡＮＣＡＮＧＴＴ
ＡＤ４ ＴＧＷＧＮＡＧＷＡＮＣＡＳＡＧＡ
ＡＤ８ ＳＴＴＧＮＴＡＳＴＮＣＴＮＴＧＣ
ＡＤ９ ＷＣＡＧＮＴＧＷＴＮＧＴＮＣＴＧ
Ｍ１３Ｆ ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ
Ｍ１３Ｒ ＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ
注：Ｗ＝Ａ或Ｔ，Ｓ＝Ｇ或Ｃ，Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ或Ｃ。
Ｎｏｔｅ：Ｗ＝ＡｏｒＴ；Ｓ＝ＧｏｒＣ；Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＧｏｒＣ．
ｒ／ｍｉｎ振荡培养４ｄ，灭菌纱布过滤收集菌丝，冷冻干燥过夜。使用ＦｕｎｇｌｅｇＤＮＡＫｉｔ提取ＤＮＡ，方法参照说明
书进行。根据ＴＤＮＡ含有氯嘧磺隆抗性标记基因ＩＬＶ１以及报告基因ＧＦＰ的二元载体设计引物ＧＦＰ１、ＧＦＰ２
（表１）。以ＧＦＰ１、ＧＦＰ２ 为引物，ＣＨ００８、１８６９的ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ检测。反应体系为２．０μＬ１０×Ｂｕｆｆｅｒ，
１．２μＬｄＮＴＰｓ，引物（２０μｍｏｌ／μＬ）各０．５μＬ，０．２μＬＴａｑ酶，１μＬＤＮＡ模板，灭菌去离子水补齐体系２０μＬ。
反应程序为９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，３５次循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ
产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，于凝胶成像系统中拍照。
１．２．３ 突变菌株生物学性状分析 挑取保存的野生型菌株ＣＨ００８及突变菌株１８６９于ＰＤＡ培养基上划线活
化，２８℃恒温培养６ｄ。在菌落边缘用打孔器打取菌饼（直径为０．５ｃｍ），用以完成突变体生物学性状的分析测
定。所有试验于２０１４年９月完成，以下每个处理设置３个重复，所得数据用Ｅｘｃｅｌ整理，采用ＤＰＳ（７．０５）统计软
件进行分析，用Ｔｕｋｅｙ法进行多重比较。
１）菌落形态的观察及生长速率的测定。将上述菌饼接种于直径为９ｃｍ培养皿的ＰＤＡ平板中央，２８℃恒温
培养６ｄ后测量菌落直径并观察菌落形态。
２）孢子形态的观察及产孢能力的测定。取５块菌饼接种至１５０ｍＬ的ＰＤＡ液体培养基中，在２８℃下１８０
ｒ／ｍｉｎ振荡培养６ｄ，用灭菌纱布过滤获得孢子悬浮液。用血球计数板计算产孢量并观察孢子形态及大小。
３）孢子萌发的测定。调节孢子悬浮液浓度为１．０×１０５个／ｍＬ，取３０μＬ滴于干净的载玻片上，将载玻片放
置在吸水饱和的滤纸上做保湿处理，６～８ｈ后观察孢子萌发，２４ｈ观察附着胞的形成。
１．２．４ 突变菌株侧翼序列的克隆 利用交错式热不对称ＰＣＲ方法（ｔｈｅｒｍａｌａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｉｎｔｅｒｌａｃｅｄＰＣＲ，
ＴＡＩＬＰＣＲ）克隆１８６９插入位点的侧翼序列。随机引物、特异性嵌套引物设计参考 Ｍｕｌｉｎｓ等［１８］、Ｃｏｍｂｉｅｒ等［１９］
的相关方法，详见表１。其中随机引物包括 ＡＤ１、ＡＤ２、ＡＤ３、ＡＤ４、ＡＤ８、ＡＤ９；特异性嵌套引物ＲＢ１／ＲＢ２／ＲＢ３
扩增插入ＴＤＮＡ片段ＲＢ端侧翼序列，ＬＢ１／ＬＢ２／ＬＢ３扩增插入ＴＤＮＡ片段ＬＢ端侧翼序列。ＴＡＩＬＰＣＲ共
包含３轮反应，第１轮反应以ＤＮＡ为模板进行，用量１μＬ；第２轮及第３轮反应以前一轮ＰＣＲ产物稀释１００倍
４４１ 草 业 学 报 第２４卷
为模板，用量２μＬ，反应体系及程序参考 Ｍｕｌｉｎｓ等
［１８］的方法进行。
１．２．５ 扩增产物的克隆及目的片段的测序与分析 利用ｐＥＡＳＹＴ１ＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ对ＰＣＲ产物进行克隆，按照
说明书将ＰＣＲ产物连接到ｐＥＡＳＹＴ１载体上，加连接产物于感受态细胞中。在含有ＩＰＴＧ 和 Ｘｇａｌ的ＬＢ
（Ａｍｐ＋）平板上，根据蓝白斑筛选方法挑取白色菌落。利用ＰＣＲ方法检测阳性克隆。使用ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＫｉｔＩ
对克隆产物提取质粒，将质粒送上海立菲生物技术有限公司测序。根据测序结果，分析ＴＤＮＡ插入位点侧翼序
列，采用ＮＣＢＩ网站ＢＬＡＳＴ程序完成序列相似性的比对和分析。
２ 结果与分析
图１ 突变菌株１８６９的致病力检测
犉犻犵．１ 犜犺犲狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀１８６９
图２ 突变菌株１８６９的分子检测
犉犻犵．２ 犜犺犲犿狅犾犲犮狌犾犪狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀１８６９
２．１ 突变菌株的致病力分析
将突变菌株１８６９、野生型菌株ＣＨ００８菌饼以及
空白ＰＤＡ培养基饼块反接离体叶片。２８℃恒温培养
５ｄ。结果显示（图１），野生型菌株ＣＨ００８反接的离体
柱花草叶片有明显褐色病斑，且病斑范围从叶片延伸
到叶柄；突变菌株１８６９及空白ＰＤＡ培养基反接的离
体柱花草叶片无病斑产生。重复试验，且多代培养突
变菌株１８６９进行试验，结果相同。即突变菌株１８６９
致病力丧失。
２．２ ＴＤＮＡ插入稳定性ＰＣＲ检测
提取突变菌株１８６９、野生型菌株ＣＨ００８的基因
组ＤＮＡ，以ＧＦＰ１、ＧＦＰ２ 为引物，进行ＰＣＲ检测，结
果显示（图２），以突变菌株１８６９的ＤＮＡ为模板，扩增
得到约７５０ｂｐ的 ＴＤＮＡ 特异条带；以野生型菌株
ＣＨ００８的基因组 ＤＮＡ为模板未得到条带。即说明
ＴＤＮＡ稳定插入到１８６９的基因组中。
２．３ 突变菌株生物学性状分析
测定观察突变菌株１８６９的菌落直径、菌落形态及
产孢量等生物学特性，以野生型ＣＨ００８为对照，并利
用数据分析统计软件进行差异显著性分析。结果表
明，与野生型ＣＨ００８菌株相比，突变菌株１８６９生长速
率及菌落直径存在显著性差异（图３Ａ、表２），ＣＨ００８
菌丝生长稠密，生长速率较快，在ＰＤＡ平板培养６ｄ，菌落直径可达（７．１８±０．１１）ｃｍ，且可以观察到菌丝下有大
量分生孢子产生；突变菌株１８６９在菌落形态上无明显差异，但生长速率较慢，培养６ｄ，菌落直径为（５．５３±０．１８）
ｃｍ，也可观察到分生孢子产生。
将突变菌株１８６９和野生型菌株ＣＨ００８接种至ＰＤＡ液体培养基中，２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ振荡培养６ｄ，以获得孢
子悬浮液。用血球计数板计算产孢量并观察孢子形态及大小。结果表明，１８６９与ＣＨ００８的孢子形态均表现为
长柱形或短棒形，无显著性差异；在产孢量方面，无显著性差异（图３Ｂ、表２），ＰＤＡ液体培养基培养６ｄ，均有分生
孢子产生，ＣＨ００８产孢量为（６．１３±２．５２）×１０６ 个／ｍＬ，１８６９产孢量为（３．４３±０．８５）×１０６ 个／ｍＬ。由此推测，
ＴＤＮＡ插入突变菌株１８６９的位点并不能导致分生孢子的变化，无论野生型菌株还是突变体菌株均表现为产生
大量分生孢子，以有利于病原菌对寄主的迅速侵染、致病。
在对１８６９与ＣＨ００８的孢子悬浮液进行孢子萌发的观察发现（图３Ｃ、表２），８ｈ后ＣＨ００８孢子萌发率为
（８９．７９±１．４０）％，１８６９的孢子萌发率为（９３．３０±０．６８）％，二者无显著性差异，２４ｈ观察附着胞的形成，１８６９与
ＣＨ００８均未产生附着胞。即ＴＤＮＡ插入突变菌株１８６９的位点并不是通过影响孢子萌发来导致致病力的丧失。
５４１第８期 许沛冬 等：柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株１８６９的ＴＤＮＡ插入位点侧翼序列的克隆
图３ 致病力丧失突变体菌株１８６９的生物学性状
犉犻犵．３ 犜犺犲狆犺犲狀狅狋狔狆犲狊狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犻狋狔犱犲犳犲犮狋犻狏犲犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀１８６９
Ａ：菌株在ＰＤＡ培养基上的形态ＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓｄｉａｍｅｔｅｒｓｏｎＰＤＡｍｅｄｉｕｍ；Ｂ：菌株的产孢量Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｎｉｄｉａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ；Ｃ：菌株
的孢子萌发情况Ｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｎｔｓ．左：野生型菌株ＣＨ００８；右：突变体菌株１８６９。Ｌｅｆｔ：ｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎ１８６９；Ｒｉｇｈｔ：ｗｉｌｄｔｙｐｅ
ｓｔｒａｉｎＣＨ００８．
２．４ 突变菌株侧翼序列的克隆
利用ＴＡＩＬＰＣＲ方法克隆１８６９插入位点的侧翼
序列。通过对随机引物的筛选，得知扩增１８６９Ｔ
ＤＮＡ 插入位点的有效随机引物左翼和右翼均为
ＡＤ９，以随机引物 ＡＤ９、特异性嵌套引物 ＲＢ１／ＲＢ２／
ＲＢ３扩增插入ＴＤＮＡ片段ＲＢ端侧翼序列，得到长
度约５００ｂｐ的特异序列（图４）；以随机引物 ＡＤ９、特
异性嵌套引物ＬＢ１／ＬＢ２／ＬＢ３扩增插入ＴＤＮＡ片段
ＬＢ端侧翼序列，得到长度约４００ｂｐ的特异序列（图
４）。
２．５ 扩增产物的克隆及目的片段的测序与分析
对ＴＡＩＬＰＣＲ扩增产物进行克隆，在含有ＩＰＴＧ
表２ 菌株１８６９与犆犎００８的生物学性状差异显著性
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲狊犻犵狀犻犳犻犮犪狀狋犱犻犳犳犲狉犲狀犮犲狅犳狆犺犲狀狅狋狔狆犲狊
犫犲狋狑犲犲狀１８６９狋狅犆犎００８
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
菌落直径
Ｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ
（ｃｍ）
产孢量
Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ
（×１０６Ｎｏ．／ｍＬ）
孢子萌发率
Ｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
（％）
ＣＨ００８ ７．１８±０．１１ａＡ ６．１３±２．５２ａＡ ８９．７９±１．４０ａＡ
１８６９ ５．５３±０．１８ｂＢ ３．４３±０．８５ａＡ ９３．３０±０．６８ａＡ
注：小写字母表示菌株在０．０５水平上的差异显著性；大写字母表示
菌株在０．０１水平上的差异显著性。
Ｎｏｔｅ：Ｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０５ｌｅｖｅｌ；
ｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０１ｌｅｖｅｌ．
和Ｘｇａｌ的ＬＢ（Ａｍｐ＋）平板上，根据蓝白斑筛选方法挑取白色菌落，经ＰＣＲ方法检测，所得菌落为阳性克隆。
６４１ 草 业 学 报 第２４卷
对克隆产物提取质粒，将质粒送上海立菲生物技术有
图４ 突变菌株１８６９犜犃犐犔犘犆犚扩增结果
犉犻犵．４ 犜犺犲犜犃犐犔犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳
犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀１８６９
Ｍ：Ｍａｋｅｒ；Ｌ２／Ｒ２：第２轮左翼／右翼序列 ＴｈｅＬＢｏｒＲＢｆｌａｎｋｉｎｇ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＮｏ．２；Ｌ３／Ｒ３：第３轮左翼／右翼序列ＴｈｅＬＢｏｒＲＢｆｌａｎ
ｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＮｏ．３．
限公司测序，测序结果显示，克隆得到ＲＢ端侧翼序列
４６７ｂｐ，ＬＢ端侧翼序列３８８ｂｐ。对序列进行拼接（图
５），采用 ＮＣＢＩ网站ＢＬＡＳＴ程序完成序列相似性的
比对，结果显示，所得序列与炭疽菌环境ｐＨ应答转录
调控因子基因犘犪犮１同源性达到９２％～９６％。
３ 结论与讨论
真菌对植物的侵染方式各不相同，而对于炭疽菌
属真菌侵染初期主要为分生孢子附着在寄主的表面，
以及分生孢子萌发产生芽管，而后分化成为形态各异
的附着胞［２０］；当其穿透寄主表皮后，则主要包括细胞
内半活体营养型、角质层内死体营养型［２１］。也就说
明，生物学性状方面的变异，可能直接导致炭疽菌对于
寄主的侵染［２２］；另一方面，致病力丧失突变体的致病
图５ 突变菌株１８６９犜犇犖犃插入位点侧翼序列的克隆与分析
犉犻犵．５ 犜犺犲犿狅犾犲犮狌犾犪狉犮犾狅狀犲犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犜犇犖犃犳犾犪狀犽犻狀犵狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀１８６９
力变化也可能导致某些生物学特性的差异。在本研究中，与野生型菌株ＣＨ００８相比，突变菌株１８６９表现致病力
丧失，其菌落在生长速率及菌落直径上具有显著性差异；在形态、产孢能力、孢子萌发与野生型无明显差异。由此
说明，突变菌株１８６９ＴＤＮＡ插入位点可能引起了菌株生长速率的变化，但未插入影响其产孢量、孢子萌发率、
附着胞产生的关键基因中。
利用农杆菌介导遗传转化法（ＡＴＭＴ）获得突变体菌株，以鉴定突变菌株的变异情况，分析其基因变化，目前
在国内外都取得了极大的进展，通过ＴＤＮＡ插入位点标记基因的分析，各国学者已经成功获得了炭疽菌致病相
关基因犆犵犇犖３［１４］、犆犘犚１［１５］、犆犘犚１［２３］、犘犓犛犐［２４］等，但尚未在柱花草炭疽菌中获得任何相关基因。本研究利用
ＡＴＭＴ法获得的突变体菌株１８６９通过ＰＣＲ检测，可知ＴＤＮＡ稳定插入到１８６９相关基因中。ＴＡＩＬＰＣＲ方法
被广泛应用于未知侧翼序列的扩增与克隆，而利用最适的随机引物是扩增成功的关键［２５］。在本研究中，扩增
１８６９ＴＤＮＡ插入位点的有效随机引物左翼和右翼均为ＡＤ９，并且成功克隆得到ＲＢ端侧翼序列４６７ｂｐ，ＬＢ端
侧翼序列３８８ｂｐ。
在本研究中，对克隆得到的侧翼序列进行拼接，采用ＮＣＢＩ网站ＢＬＡＳＴ程序完成序列相似性的比对，结果
显示，所得序列与炭疽菌环境ｐＨ应答转录调控因子基因犘犪犮１同源性达到９２％～９６％。犘犪犮１基因最早由 Ｍｉ
ｙａｒａ等［２６］在鳄梨胶孢炭疽菌中发现，并且经研究，敲除犘犪犮１基因可下调狆犲犾犅 基因，而狆犲犾犅基因表达裂解酶直
７４１第８期 许沛冬 等：柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株１８６９的ＴＤＮＡ插入位点侧翼序列的克隆
接影响到菌株的毒力作用；此外犘犪犮１基因可编码狆犪犮犆转录因子，可调节菌株对ｐＨ的敏感性。有关学者［２７２８］
曾对ｐＨ值对柱花草炭疽菌的生长影响进行测定，研究发现柱花草炭疽菌可生长的ｐＨ值为３．０～１４．０，最适生
长ｐＨ值为６．４～７．２，在一定的范围内，随ｐＨ值的升高，炭疽菌产孢量减少，但菌丝生长量增加。说明ｐＨ值确
定对柱花草炭疽菌的生长具有一定的影响，且可以通过对犘犪犮１基因的研究达到炭疽菌致病力减弱或丧失的效
果。后续，将深入展开柱花草炭疽菌中犘犪犮１基因的研究，分析其基因功能，为柱花草炭疽病的防治，奠定一定的
分子理论依据。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］ ＬｉｕＦＭ，ＣｕｉＸＤ，ＷｕＫＲ，犲狋犪犾．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊Ｐｅｎｚ．ｃａｕｓｉｎｇａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｏｆ
犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１２，１６：６５６８．
［２］ ＹｉＫＸ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓａｎｄｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｓｏｎｔｒｏｐｉｃａｌｆｏｒａｇｅｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎａ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆ
ＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２００１，４：３０３４．
［３］ ＪｉａｎｇＣＳ，ＺｈｏｕＤＭ，ＺｈａｎｇＺＹ．Ｓｔｙｌｏａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅａｎｄｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｉｔｓｂｒｅｅｄｉｎｇｆｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｄｉｓｅａｓｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｉ
ｃｈｕａｎＧｒａｓｓｌａｎｄ，２００２，（１）：２２２７．
［４］ ＣｈａｋｒａｂｏｒｔｙＳ，ＰｅｒｒｏｔｔＲ，ＣｈａｒｃｈａｒＭＪＤ，犲狋犪犾．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊．
Ⅱ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｉｓｏｌａｔｅｓｏｆ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊ｆｒｏｍｅｉｇｈｔｓｐｅｃｉｅｓｏｆｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｅｓ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ
Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ，１９９７，３１：３９３４０１．
［５］ ＢｉａｎＪ，ＣｈｅｎＴＸ，ＣｈｅｎＸＲ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｒｅｇｕｌａｒｉｔｙｏｆａｎｏｖｅｌｄｉｓｅａｓｅ———犃狀犵犲犾犻犮犪ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ．
ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒｅＳｉｎｉｃａ，２０１４，２３（６）：２６６２７３．
［６］ ＣｈｅｎＸＬ，ＹａｎｇＪ，ＰｅｎｇＹＬ．Ｌａｒｇｅｓｃａｌｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎ犕犪犵狀犪狆狅狉狋犺犲狅狉狔狕犪犲ｂｙ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅ
ｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２０１１，７２２：２１３２２４．
［７］ ＬｉｕＰＪ，ＷａｎｇＺＹ，ＷａｎｇＱＨ，犲狋犪犾．犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ犕犪犵狀犪狆狅狉狋犺犲犵狉犻狊犲犪ａｎｄｉｄｅｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｄｅｆｅｃｔｉｖｅｍｕｔａｎｔ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＲｉｃｅＳｃｉｅｎｃｅ，２００６，２０（３）：２３１２３７．
［８］ ＹｕＭ Ｎ，ＨｕＪＫ，ＨｕａｎｇＬ，犲狋犪犾．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴＤＮＡｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ犝狊狋犻犾犪犵犻狀狅犻犱犲犪狏犻狉犲狀狊 Ｍｕｔａｎｔ
５０６２．ＳｃｉｅｎｔｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａＳｉｎｉｃａ，２０１３，４６（９）：１７９０１７９８．
［９］ ＢｕｎｄｏｃｋＰａｕｌ，ＤｕｌｋＲａｓＡｍｋｅｄｅｎ，ＢｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎＡｌｉｃｅＧＭ，犲狋犪犾．ＴｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍＴＤＮＡｔｒａｎｓｆｅｒｆｒｏｍ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌
犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｔｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，１９９５，１４（３）：３２０６３２１４．
［１０］ ＦａｎｇＬ，ＬｉｕＨＱ，ＳｏｎｇＦＭ，犲狋犪犾．犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犾犪犵犲狀犪狉犻狌犿ｔｈｅ
ｃａｕｓａｌａｇｅｎｔｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ），２００６，３２（４）：３６０３６６．
［１１］ ＺｈｅｎＤＸ，ＬｉＭ Ｈ，ＪｉａｎｇＺＤ．犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犿狌狊犪犲．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
ＺｈｏｎｇｋａｉＡｇｒｏｔｅｃｈｎｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，２００５，１８（４）：４２４４．
［１２］ ＬｉＷ，ＺｈｅｎｇＸＬ，ＨｅＣＰ，犲狋犪犾．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿
犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊．ＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２００８，３４（１）：７６８１．
［１３］ ＨｕＣＰ，ＺｈｅｎｇＪＬ，ＧａｏＪＭ，犲狋犪犾．ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＳｔｙｌｏ犃狀狋犺狉犪犮狀狅狊犲犿犲犱犻犪狋犲犱ｂｙ
犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ，２０１３，３４（６）：１００７１０１２．
［１４］ ＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎＳＡ，ＨａｔｆｉｅｌｄＪ，ＲｕｓｕＡＧ，犲狋犪犾．犆犵犇犖３：Ａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｉｅｉｔｙｇｅｎｅｏｆ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊
ｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏａｖｅｒｔａｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｉｋｅｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｔｈｅｈｏｓｔ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，
２０００，１３：９２９９４１．
［１５］ ＴｈｏｎＭＲ，ＮｕｅｋｌｅｓＥＭ，ＴａｋａｅｈＪＥ，犲狋犪犾．ＣＰＲ１：Ａｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｕｔａｔｉｖｅｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄａｓｅｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｐａｔｈｏｇｅ
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