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Molecular characterization of the flanking gene of T-DNA insertional, pathogenicity-defective Colletotrichum gloeosporioides mutant strain 1869

柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的



全 文 :书犇犗犐:10.11686/犮狔狓犫2015094 犺狋狋狆://犮狔狓犫.犾狕狌.犲犱狌.犮狀
许沛冬,郑肖兰,赵艳,李秋洁,吴伟怀,贺春萍,习金根,梁艳琼,郑金龙,戚山江,张晓波,易克贤.柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的TDNA
插入位点侧翼序列的克隆.草业学报,2015,24(8):142149.
XuPD,ZhengXL,ZhaoY,LiQJ,WuW H,HeCP,XiJG,LiangYQ,ZhengJL,QiSJ,ZhangXB,YiKX.Molecularcharacterization
oftheflankinggeneofTDNAinsertional,pathogenicitydefective犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊mutantstrain1869.ActaPrataculturaeSinica,
2015,24(8):142149.
柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的
犜犇犖犃插入位点侧翼序列的克隆
许沛冬1,2,郑肖兰2,赵艳1,李秋洁2,吴伟怀2,贺春萍2,习金根2,
梁艳琼2,郑金龙2,戚山江1,张晓波4,5,易克贤2,3
(1.海南大学农学院,海南 海口570228;2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南 海口571101;3.中国热带农业科学院
热带生物技术研究所,海南 海口571101;4.热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室(海南大学),
海南 海口570228;5.海南大学旅游学院,海南 海口570228)
摘要:通过对实验室已构建的柱花草炭疽菌TDNA突变体库中各转化子致病力的测定,获得致病力丧失突变菌株
1869。对其进行PCR检测以验证TDNA在1869基因组中插入情况,并测定观察其菌落直径、菌落形态及产孢量
等生物学特性,利用TAILPCR克隆标记基因侧翼序列,采用生物信息学方法比对基因信息。结果表明,与柱花草
炭疽菌野生型菌株CH008相比,突变菌株1869表现致病力丧失,菌落生长速率也显著低于野生型;然而,在分生
孢子形态、产孢能力、孢子萌发率等方面与野生型并无明显差异。TAILPCR扩增得到TDNA插入位点RB端序
列467bp,LB端侧翼序列388bp,经两侧序列拼接比对,所得序列与犘犪犮1同源性达到92%~96%,推测可能由于
基因表达产物调节菌株对pH值的敏感性,从而影响了其致病过程。
关键词:柱花草;炭疽菌;TDNA;致病力;基因克隆  
犕狅犾犲犮狌犾犪狉犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狕犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犳犾犪狀犽犻狀犵犵犲狀犲狅犳犜犇犖犃犻狀狊犲狉狋犻狅狀犪犾,狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犻狋狔
犱犲犳犲犮狋犻狏犲犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀1869
XUPeiDong1,2,ZHENGXiaoLan2,ZHAOYan1,LIQiuJie2,WU WeiHuai2,HEChunPing2,XIJin
Gen2,LIANGYanQiong2,ZHENGJinLong2,QIShanJiang1,ZHANGXiaoBo4,5,YIKeXian2,3
1.犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲,犎犪犻狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔,犎犪犻犽狅狌570228,犆犺犻狀犪;2.犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犪狀犱犘犾犪狀狋犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀犐狀狊狋犻狋狌狋犲,犆犃犜犃犛,
犎犪犻犽狅狌571101,犆犺犻狀犪;3.犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犜狉狅狆犻犮犪犾犅犻狅狊犮犻犲狀犮犲犪狀犱犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔,犆犃犜犃犛,犎犪犻犽狅狌571101,犆犺犻狀犪;4.犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅
狉狔狅犳犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犇犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犝狋犻犾犻狕犪狋犻狅狀狅犳犜狉狅狆犻犮犪犾犆狉狅狆犌犲狉犿狆犾犪狊犿犚犲狊狅狌狉犮犲狊(犎犪犻狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔),犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犈犱狌犮犪
狋犻狅狀,犎犪犻犽狅狌570228,犆犺犻狀犪;5.犆狅犾犾犲犵犲狅犳犜狅狌狉犻狊犿,犎犪犻狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔,犎犪犻犽狅狌570228,犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋:犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊isafungalpathogenof犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊causinganthracnose
disease.Pathogenicitydefectivemutantstrainsof犆.犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊werescreenedinthelaboratoryandstrain
1869selectedforstudy.ThemutantstrainwascomparedwithwildtypestrainCH008forphenotypiccharac
teristics,includingcolonydiameter,colonymorphology,sporulationabilityandsporegerminationrate.Colo
第24卷 第8期
Vol.24,No.8
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA
2015年8月
Aug,2015
收稿日期:20150220;改回日期:20150330
基金项目:国家自然科学基金(31072076,31101408),公益性行业科研专项(201303057)和中央级公益性科研院所基本科研业务专项
(2015hzs1J002)资助。
作者简介:许沛冬(1990),男,内蒙古集宁人,在读硕士。Email:xuridongshengxpd@163.com
通讯作者Correspondingauthor.Email:yikexian@126.com,angiaoo@126.com
nydiameterofCH008andstrain1869differed,buttheothertraitsdidnot.DNAofthemutantstrainwasex
tracted,andusingthermalasymmetricinterlacedPCR(TAIL-PCR)aT-DNAinsertionmutationsitebe
lievedresponsibleforlossofpathogenicitywasidentified.TheRBandLBflankingsequencesattheinsertion
sitewerecloned,alsousingTAIL-PCR.TheRBflankingsequencewas467bpinlength,whiletheLBflan
kingsequencewas388bp.TheBLASTresultshowedthatthesequencehad92%-96% homologytogene
犘犪犮1.Bypredictingthefunctionofaproteincodedbytheflankingsequence,weinferredthatthegeneinques
tionregulatedthesensitivitytopH,andinthiswayaffectedthepathogenicpotentialof犆.犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻犪狊;犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊;TDNA;pathogenicity;geneclone
柱花草(犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊)是广泛种植于热带、亚热带地区的优质豆科牧草,在我国有“北有苜蓿
(犕犲犱犻犮犪犵狅),南有柱花草”的美誉,被称为“热带牧草之王”[12]。柱花草炭疽病是影响柱花草产量的重要病害,其
主要由病原真菌胶孢炭疽菌(犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊)引起,病原菌可侵染柱花草叶片、叶柄、茎秆乃至花
序等各个部位,且存在高度的遗传变异性及生物多样性[34]。炭疽菌危害的植物种类繁多,包括各类木本、草本植
物,直到近年来,仍有炭疽菌感染新的植物的报道,如当归(犃狀犵犲犾犻犮犪狊犻狀犲狀狊犻狊)[5]等。对于炭疽病的防治而言,在
化学防治及抗病品种的选育遭遇巨大的瓶颈后,众多的学者将目光投向于对病原菌致病相关基因的分离与研究,
以期望了解病原菌的侵染及致病机制,而根癌农杆菌介导遗传转化(犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊mediatedtrans
formation,ATMT)的TDNA插入突变技术即成为了研究致病相关基因的有效手段[68]。自1995年,Bundock
等[9]首次利用根癌农杆菌成功介导酵母菌遗传转化以来,ATMT法已经在构建真菌的突变体库中取得了巨大的
进展。在炭疽菌方面,有关专家学者先后对黄瓜(犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊)[10]、香蕉(犕狌狊犪狀犪狀犪)[11]、芒果(犕犪狀犵犻犳犲狉犪
犻狀犱犻犮犪)[12]等遗传转化体系进行研究,本实验室胡彩平等[13]对柱花草炭疽菌进行了遗传转化体系的优化。利用
ATMT,国内外学者纷纷筛选得到了部分炭疽菌致病相关基因,如Stephenson等[14]获得了犆犵犇犖3基因,该基
因在侵染寄主的活体营养阶段表达;Thon等[15]获得了犆犘犚1基因,其为编码信号肽基因。但柱花草炭疽菌的致
病相关基因尚未有报道。
本试验对筛选得到的柱花草炭疽菌致病力丧失菌株1869进行了生物学性状的分析,用分子生物学手段分析
1869菌株TDNA的序列插入位点,通过TAILPCR技术克隆侧翼序列,对该序列在炭疽病菌致病过程的作用
进行分析,希望能够为柱花草炭疽病致病相关基因的克隆和研究提供一定的理论基础,为柱花草炭疽病的致病机
理以及防治策略提供一定的分子参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株  参试菌株包括野生型菌株CH008以及突变菌株1869。其中CH008为实验室分离获得的强致
病力炭疽菌株[16],突变菌株1869则是由柱花草炭疽菌野生型菌株CH008通过农杆菌介导遗传转化(ATMT)的
TDNA插入获得的致病力丧失突变体。所用根癌农杆菌菌株为AGL1,该菌内含pSULF.gfp质粒,以pCAM
BIAl300为骨架,含有氯嘧磺隆抗性标记基因ILV1以及报告基因GFP的二元载体[17]。菌株均保存于实验室
-70℃冰箱。
1.1.2 培养基及主要仪器  LuriaBertani培养基(LB):蛋白胨10.0g,酵母膏5.0g,NaCl8.0g,Agar20g,
补充ddH2O至1000mL,pH值7.0。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potatodextroseagar,PDA):马铃薯200g,葡萄糖15~20g,琼脂15~20g,补
充ddH2O至1000mL。其对应液体培养基则不加琼脂。
主要仪器:HZOF160型全温振荡培养箱,Eppendorf5333型梯度PCR仪,LDZX75KB高压蒸汽灭菌锅,
OLYMPUSURFLT型荧光数码生物显微镜,721型分光光度计,便携式CP401型pH计。
1.1.3 引物与主要试剂  试验所用引物名称及序列见表1。引物合成由上海英潍捷基及英骏生物技术公司
341第8期 许沛冬 等:柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的TDNA插入位点侧翼序列的克隆
完成,测序工作由上海立菲生物技术有限公司完成。
DNA Maker、TaqDNA 聚合酶购自 TaKaRa公司。
FunglegDNAKit购于Biomiga公司;PlasmidMini
KitI购于 Omega公司;pEASYT1Cloningvector、
犈.犮狅犾犻transT1,购自于北京全式金生物技术有限公
司。
1.1.4 试验时间  2014年8月至12月于中国热
带农业科学院环境与植物保护研究所完成全部试验内
容。
1.2 试验方法
1.2.1 突变菌株致病力分析  突变体菌株致病力
测定采用菌饼反接离体叶片法。柱花草选用炭疽病易
感病品种格拉姆,于2014年8月,柱花草生长旺盛时
期选取叶龄7d左右的柱花草三出复叶,针刺叶片,将
菌饼接种在叶片上(菌丝面紧贴伤口),设置2个对照,
野生型CH008及空白PDA培养基饼块。将叶片放置
在培养盘中,设3个重复,盘内进行保湿处理,保鲜膜
封口,28℃恒温培养5d,观察叶片发病情况。
1.2.2 TDNA插入稳定性PCR检测  2014年8
月,将菌株于PDA培养基上活化,28℃恒温培养6d,
收集孢子及菌丝,于PDA液体培养基中,28℃180
表1 试验所用引物
犜犪犫犾犲1 犘狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犻狀狋犺犲狉犲狊犲犪狉犮犺
引物名称Primername 引物序列Sequence(5′→3′)
GFP1 TACTGCAGATGGTGAGCAAGGGCGAG
GFP2 CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATG
LB1 GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG
LB2 CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT
LB3 GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT
RB1 GGCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
RB2 AACGTCGTGATGGGAAAACCCT
RB3 CCCTTCCCAACAGTTGCGCA
AD1 AGWGNAGWANCAWAGG
AD2 WAGTGNAGWANCANAGA
AD3 WAGTGNAGWANCANGTT
AD4 TGWGNAGWANCASAGA
AD8 STTGNTASTNCTNTGC
AD9 WCAGNTGWTNGTNCTG
M13F ACTGGCCGTCGTTTTAC
M13R GTCATAGCTGTTTCCTG
 注:W=A或T,S=G或C,N=A、T、G或C。
 Note:W=AorT;S=GorC;N=A,T,GorC.
r/min振荡培养4d,灭菌纱布过滤收集菌丝,冷冻干燥过夜。使用FunglegDNAKit提取DNA,方法参照说明
书进行。根据TDNA含有氯嘧磺隆抗性标记基因ILV1以及报告基因GFP的二元载体设计引物GFP1、GFP2
(表1)。以GFP1、GFP2 为引物,CH008、1869的DNA为模板进行PCR检测。反应体系为2.0μL10×Buffer,
1.2μLdNTPs,引物(20μmol/μL)各0.5μL,0.2μLTaq酶,1μLDNA模板,灭菌去离子水补齐体系20μL。
反应程序为94℃预变性4min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,35次循环;72℃延伸5min。PCR
产物通过琼脂糖凝胶电泳检测,于凝胶成像系统中拍照。
1.2.3 突变菌株生物学性状分析  挑取保存的野生型菌株CH008及突变菌株1869于PDA培养基上划线活
化,28℃恒温培养6d。在菌落边缘用打孔器打取菌饼(直径为0.5cm),用以完成突变体生物学性状的分析测
定。所有试验于2014年9月完成,以下每个处理设置3个重复,所得数据用Excel整理,采用DPS(7.05)统计软
件进行分析,用Tukey法进行多重比较。
1)菌落形态的观察及生长速率的测定。将上述菌饼接种于直径为9cm培养皿的PDA平板中央,28℃恒温
培养6d后测量菌落直径并观察菌落形态。
2)孢子形态的观察及产孢能力的测定。取5块菌饼接种至150mL的PDA液体培养基中,在28℃下180
r/min振荡培养6d,用灭菌纱布过滤获得孢子悬浮液。用血球计数板计算产孢量并观察孢子形态及大小。
3)孢子萌发的测定。调节孢子悬浮液浓度为1.0×105个/mL,取30μL滴于干净的载玻片上,将载玻片放
置在吸水饱和的滤纸上做保湿处理,6~8h后观察孢子萌发,24h观察附着胞的形成。
1.2.4 突变菌株侧翼序列的克隆  利用交错式热不对称PCR方法(thermalasymmetricinterlacedPCR,
TAILPCR)克隆1869插入位点的侧翼序列。随机引物、特异性嵌套引物设计参考 Mulins等[18]、Combier等[19]
的相关方法,详见表1。其中随机引物包括 AD1、AD2、AD3、AD4、AD8、AD9;特异性嵌套引物RB1/RB2/RB3
扩增插入TDNA片段RB端侧翼序列,LB1/LB2/LB3扩增插入TDNA片段LB端侧翼序列。TAILPCR共
包含3轮反应,第1轮反应以DNA为模板进行,用量1μL;第2轮及第3轮反应以前一轮PCR产物稀释100倍
441 草 业 学 报 第24卷
为模板,用量2μL,反应体系及程序参考 Mulins等
[18]的方法进行。
1.2.5 扩增产物的克隆及目的片段的测序与分析  利用pEASYT1CloningKit对PCR产物进行克隆,按照
说明书将PCR产物连接到pEASYT1载体上,加连接产物于感受态细胞中。在含有IPTG 和 Xgal的LB
(Amp+)平板上,根据蓝白斑筛选方法挑取白色菌落。利用PCR方法检测阳性克隆。使用PlasmidMiniKitI
对克隆产物提取质粒,将质粒送上海立菲生物技术有限公司测序。根据测序结果,分析TDNA插入位点侧翼序
列,采用NCBI网站BLAST程序完成序列相似性的比对和分析。
2 结果与分析
图1 突变菌株1869的致病力检测
犉犻犵.1 犜犺犲狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀1869
 
图2 突变菌株1869的分子检测
犉犻犵.2 犜犺犲犿狅犾犲犮狌犾犪狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀1869
 
2.1 突变菌株的致病力分析
将突变菌株1869、野生型菌株CH008菌饼以及
空白PDA培养基饼块反接离体叶片。28℃恒温培养
5d。结果显示(图1),野生型菌株CH008反接的离体
柱花草叶片有明显褐色病斑,且病斑范围从叶片延伸
到叶柄;突变菌株1869及空白PDA培养基反接的离
体柱花草叶片无病斑产生。重复试验,且多代培养突
变菌株1869进行试验,结果相同。即突变菌株1869
致病力丧失。
2.2 TDNA插入稳定性PCR检测
提取突变菌株1869、野生型菌株CH008的基因
组DNA,以GFP1、GFP2 为引物,进行PCR检测,结
果显示(图2),以突变菌株1869的DNA为模板,扩增
得到约750bp的 TDNA 特异条带;以野生型菌株
CH008的基因组 DNA为模板未得到条带。即说明
TDNA稳定插入到1869的基因组中。
2.3 突变菌株生物学性状分析
测定观察突变菌株1869的菌落直径、菌落形态及
产孢量等生物学特性,以野生型CH008为对照,并利
用数据分析统计软件进行差异显著性分析。结果表
明,与野生型CH008菌株相比,突变菌株1869生长速
率及菌落直径存在显著性差异(图3A、表2),CH008
菌丝生长稠密,生长速率较快,在PDA平板培养6d,菌落直径可达(7.18±0.11)cm,且可以观察到菌丝下有大
量分生孢子产生;突变菌株1869在菌落形态上无明显差异,但生长速率较慢,培养6d,菌落直径为(5.53±0.18)
cm,也可观察到分生孢子产生。
将突变菌株1869和野生型菌株CH008接种至PDA液体培养基中,28℃、180r/min振荡培养6d,以获得孢
子悬浮液。用血球计数板计算产孢量并观察孢子形态及大小。结果表明,1869与CH008的孢子形态均表现为
长柱形或短棒形,无显著性差异;在产孢量方面,无显著性差异(图3B、表2),PDA液体培养基培养6d,均有分生
孢子产生,CH008产孢量为(6.13±2.52)×106 个/mL,1869产孢量为(3.43±0.85)×106 个/mL。由此推测,
TDNA插入突变菌株1869的位点并不能导致分生孢子的变化,无论野生型菌株还是突变体菌株均表现为产生
大量分生孢子,以有利于病原菌对寄主的迅速侵染、致病。
在对1869与CH008的孢子悬浮液进行孢子萌发的观察发现(图3C、表2),8h后CH008孢子萌发率为
(89.79±1.40)%,1869的孢子萌发率为(93.30±0.68)%,二者无显著性差异,24h观察附着胞的形成,1869与
CH008均未产生附着胞。即TDNA插入突变菌株1869的位点并不是通过影响孢子萌发来导致致病力的丧失。
541第8期 许沛冬 等:柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的TDNA插入位点侧翼序列的克隆
图3 致病力丧失突变体菌株1869的生物学性状
犉犻犵.3 犜犺犲狆犺犲狀狅狋狔狆犲狊狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犻狋狔犱犲犳犲犮狋犻狏犲犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀1869
 A:菌株在PDA培养基上的形态PhenotypicanalysisdiametersonPDAmedium;B:菌株的产孢量Statisticalanalysisofconidiaproduction;C:菌株
的孢子萌发情况Sporegerminationofpathogenicmutants.左:野生型菌株CH008;右:突变体菌株1869。Left:mutantstrain1869;Right:wildtype
strainCH008.
2.4 突变菌株侧翼序列的克隆
利用TAILPCR方法克隆1869插入位点的侧翼
序列。通过对随机引物的筛选,得知扩增1869T
DNA 插入位点的有效随机引物左翼和右翼均为
AD9,以随机引物 AD9、特异性嵌套引物 RB1/RB2/
RB3扩增插入TDNA片段RB端侧翼序列,得到长
度约500bp的特异序列(图4);以随机引物 AD9、特
异性嵌套引物LB1/LB2/LB3扩增插入TDNA片段
LB端侧翼序列,得到长度约400bp的特异序列(图
4)。
2.5 扩增产物的克隆及目的片段的测序与分析
对TAILPCR扩增产物进行克隆,在含有IPTG
表2 菌株1869与犆犎008的生物学性状差异显著性
犜犪犫犾犲2 犜犺犲狊犻犵狀犻犳犻犮犪狀狋犱犻犳犳犲狉犲狀犮犲狅犳狆犺犲狀狅狋狔狆犲狊
犫犲狋狑犲犲狀1869狋狅犆犎008
菌株
Strain
菌落直径
Colonydiameter
(cm)
产孢量
Sporulation
(×106No./mL)
孢子萌发率
Sporegermination
(%)
CH008 7.18±0.11aA 6.13±2.52aA 89.79±1.40aA
1869 5.53±0.18bB 3.43±0.85aA 93.30±0.68aA
 注:小写字母表示菌株在0.05水平上的差异显著性;大写字母表示
菌株在0.01水平上的差异显著性。
 Note:Smallettersrepresentthestatisticdifferenceat0.05level;
capitallettersindicatethestatisticdifferenceat0.01level.
和Xgal的LB(Amp+)平板上,根据蓝白斑筛选方法挑取白色菌落,经PCR方法检测,所得菌落为阳性克隆。
641 草 业 学 报 第24卷
对克隆产物提取质粒,将质粒送上海立菲生物技术有
图4 突变菌株1869犜犃犐犔犘犆犚扩增结果
犉犻犵.4 犜犺犲犜犃犐犔犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳
犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀1869
   M:Maker;L2/R2:第2轮左翼/右翼序列 TheLBorRBflanking
sequenceofNo.2;L3/R3:第3轮左翼/右翼序列TheLBorRBflan
kingsequenceofNo.3.
限公司测序,测序结果显示,克隆得到RB端侧翼序列
467bp,LB端侧翼序列388bp。对序列进行拼接(图
5),采用 NCBI网站BLAST程序完成序列相似性的
比对,结果显示,所得序列与炭疽菌环境pH应答转录
调控因子基因犘犪犮1同源性达到92%~96%。
3 结论与讨论
真菌对植物的侵染方式各不相同,而对于炭疽菌
属真菌侵染初期主要为分生孢子附着在寄主的表面,
以及分生孢子萌发产生芽管,而后分化成为形态各异
的附着胞[20];当其穿透寄主表皮后,则主要包括细胞
内半活体营养型、角质层内死体营养型[21]。也就说
明,生物学性状方面的变异,可能直接导致炭疽菌对于
寄主的侵染[22];另一方面,致病力丧失突变体的致病
图5 突变菌株1869犜犇犖犃插入位点侧翼序列的克隆与分析
犉犻犵.5 犜犺犲犿狅犾犲犮狌犾犪狉犮犾狅狀犲犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犜犇犖犃犳犾犪狀犽犻狀犵狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犿狌狋犪狀狋狊狋狉犪犻狀1869
力变化也可能导致某些生物学特性的差异。在本研究中,与野生型菌株CH008相比,突变菌株1869表现致病力
丧失,其菌落在生长速率及菌落直径上具有显著性差异;在形态、产孢能力、孢子萌发与野生型无明显差异。由此
说明,突变菌株1869TDNA插入位点可能引起了菌株生长速率的变化,但未插入影响其产孢量、孢子萌发率、
附着胞产生的关键基因中。
利用农杆菌介导遗传转化法(ATMT)获得突变体菌株,以鉴定突变菌株的变异情况,分析其基因变化,目前
在国内外都取得了极大的进展,通过TDNA插入位点标记基因的分析,各国学者已经成功获得了炭疽菌致病相
关基因犆犵犇犖3[14]、犆犘犚1[15]、犆犘犚1[23]、犘犓犛犐[24]等,但尚未在柱花草炭疽菌中获得任何相关基因。本研究利用
ATMT法获得的突变体菌株1869通过PCR检测,可知TDNA稳定插入到1869相关基因中。TAILPCR方法
被广泛应用于未知侧翼序列的扩增与克隆,而利用最适的随机引物是扩增成功的关键[25]。在本研究中,扩增
1869TDNA插入位点的有效随机引物左翼和右翼均为AD9,并且成功克隆得到RB端侧翼序列467bp,LB端
侧翼序列388bp。
在本研究中,对克隆得到的侧翼序列进行拼接,采用NCBI网站BLAST程序完成序列相似性的比对,结果
显示,所得序列与炭疽菌环境pH应答转录调控因子基因犘犪犮1同源性达到92%~96%。犘犪犮1基因最早由 Mi
yara等[26]在鳄梨胶孢炭疽菌中发现,并且经研究,敲除犘犪犮1基因可下调狆犲犾犅 基因,而狆犲犾犅基因表达裂解酶直
741第8期 许沛冬 等:柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的TDNA插入位点侧翼序列的克隆
接影响到菌株的毒力作用;此外犘犪犮1基因可编码狆犪犮犆转录因子,可调节菌株对pH的敏感性。有关学者[2728]
曾对pH值对柱花草炭疽菌的生长影响进行测定,研究发现柱花草炭疽菌可生长的pH值为3.0~14.0,最适生
长pH值为6.4~7.2,在一定的范围内,随pH值的升高,炭疽菌产孢量减少,但菌丝生长量增加。说明pH值确
定对柱花草炭疽菌的生长具有一定的影响,且可以通过对犘犪犮1基因的研究达到炭疽菌致病力减弱或丧失的效
果。后续,将深入展开柱花草炭疽菌中犘犪犮1基因的研究,分析其基因功能,为柱花草炭疽病的防治,奠定一定的
分子理论依据。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊:
[1] LiuFM,CuiXD,WuKR,犲狋犪犾.Biologicalcharacteristicsof犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊Penz.causinganthracnoseof
犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊.GuangdongAgriculturalScience,2012,16:6568.
[2] YiKX.DevelopmentandprospectsandcountermeasuresontropicalforageindustrialproductioninChina.ChineseJournalof
TropicalAgriculture,2001,4:3034.
[3] JiangCS,ZhouDM,ZhangZY.Styloanthracnoseandtheprogressofitsbreedingforresistancetodisease.JournalofSi
chuanGrassland,2002,(1):2227.
[4] ChakrabortyS,PerrottR,CharcharMJD,犲狋犪犾.Biodiversity,epidemiologyandvirulenceof犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊.
Ⅱ.Geneticandpathogenicdiversityinisolatesof犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊fromeightspeciesofstylosanthes.Tropical
Grasslands,1997,31:393401.
[5] BianJ,ChenTX,ChenXR.Pathogenidentificationandoccurrenceregularityofanoveldisease———犃狀犵犲犾犻犮犪anthracnose.
ActaPratacultureSinica,2014,23(6):266273.
[6] ChenXL,YangJ,PengYL.Largescaleinsertionalmutagenesisin犕犪犵狀犪狆狅狉狋犺犲狅狉狔狕犪犲by犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊me
diatedtransformation.MethodsinMolecularBiology,2011,722:213224.
[7] LiuPJ,WangZY,WangQH,犲狋犪犾.犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊mediatedtransformationof犕犪犵狀犪狆狅狉狋犺犲犵狉犻狊犲犪andiden
tificationofpathogenicitydefectivemutant.ChineseJournalofRiceScience,2006,20(3):231237.
[8] YuM N,HuJK,HuangL,犲狋犪犾.MolecularcharacterizationofTDNAintegrationofthe犝狊狋犻犾犪犵犻狀狅犻犱犲犪狏犻狉犲狀狊 Mutant
5062.ScientiaAgriculturaSinica,2013,46(9):17901798.
[9] BundockPaul,DulkRasAmkeden,BeijersbergenAliceGM,犲狋犪犾.TranskingdomTDNAtransferfrom犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌
犿犲犳犪犮犻犲狀狊tosaccharomycescerevisiae.TheEMBOJournal,1995,14(3):32063214.
[10] FangL,LiuHQ,SongFM,犲狋犪犾.犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊mediatedtransformationof犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犾犪犵犲狀犪狉犻狌犿the
causalagentofcucumberanthracnose.JournalofZhejiangUniversity(AgricultureandLifeSciences),2006,32(4):360366.
[11] ZhenDX,LiM H,JiangZD.犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊mediatedtransformationof犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犿狌狊犪犲.Journalof
ZhongkaiAgrotechnicalColege,2005,18(4):4244.
[12] LiW,ZhengXL,HeCP,犲狋犪犾.Establishmentof犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿mediatedtransformationsystemsfor犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿
犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊.PlantProtection,2008,34(1):7681.
[13] HuCP,ZhengJL,GaoJM,犲狋犪犾.OptimizationofgenetictransformationsystemofStylo犃狀狋犺狉犪犮狀狅狊犲犿犲犱犻犪狋犲犱by
犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊.ChineseJournalofTropicalCrops,2013,34(6):10071012.
[14] StephensonSA,HatfieldJ,RusuAG,犲狋犪犾.犆犵犇犖3:Anessentialpathogenieitygeneof犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊
necessarytoavertahypersensitivelikeresponseinthehost犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊.MolecularPlantMicrobeInteractions,
2000,13:929941.
[15] ThonMR,NueklesEM,TakaehJE,犲狋犪犾.CPR1:Ageneencodingaputativesignalpeptidasethatfunctionsinpathoge
nicityof犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵狉犪犿犻狀犻犮狅犾犪tomaize.MolecularPlantMicrobeInteractions,2002,15:120128.
[16] YiKX,HuangJS,LiuGD.GeneticdiversityanalysisofChineseStyloanthracnosepathogensusingrandomamplifiedpoly
morphicDNA.ActaMicrobiologicaSinica,2003,43(3):379387.
[17] GaoJM,HuCP,ZhengJL,犲狋犪犾.ConstructionandanalysisofaTDNAinsertionalmutantlibraryfor犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿
犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊.GuangdongAgriculturalScience,2014,19(10):142145.
[18] MulinsED,ChenPX,RomaineP,犲狋犪犾.犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿mediatedtransformationof犉狌狊犪狉犻狌犿oxysporum:Anefficient
toolforinserlionalmutagenesisandgenetransfer.Phytopathology,2001,91:173180.
[19] CombierJP,MelayahD,RaffierC,犲狋犪犾.犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊mediatedtransformationasatoolforinsertionalmu
tagenesisinthesymbioticectomycorrhizalfungusHebelomaCylindrosporum.FEMSMicrobiologyLetters,2003,220(1):
141148.
[20] LiuM,ZhangW,ZhouY,犲狋犪犾.Researchprogressongrapeanthracnose.ChinaPlantProtection,2014,34(1):2933.
841 草 业 学 报 第24卷
[21] WhartonPS,JulianAM.Acytologicalstudyofcompatibleandincompatibleinteractionsbetween犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉and犆狅犾
犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿狊狌犫犾犻狀犲狅犾狌犿.NewPhytologist,1996,134(1):2534.
[22] KimYK,WangYH,LiuZM,犲狋犪犾.Identificationofahardsurfacecontactinducedgenein犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻狅犻犱犲狊
conidiaasasterolglycosyltransferase,anovelfungalvirulencefactor.ThePlantJournal,2002,30:177187.
[23] ThonMR,NucklesEM,TakachJE,犲狋犪犾.CPRl:Ageneencodingaputativesignalpeptidasethatfunctionsinpathogenic
ityof犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵狉犪犿犻狀犻犮狅犾犪tomaize.MolecularPlantMicrobeInteractions,2002,15:120128.
[24] TsujiG,FujiS,TsugeS,犲狋犪犾.The犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犾犪犵犲狀犪狉犻狌犿Ste12LikegeneCSTlisessentialforappressoriumpenetra
tion.MolecularPlantMicrobeInteractions,2003,16:315325.
[25] SunBY,PiaoHL,ParkSH,犲狋犪犾.SelectionofoptimalprimersforTAILPCRinidentifyingDsflankingsequencesfrom
Ac/Dsinsertionricelines.ChineseJournalofBiotechnology,2004,20(6):821826.
[26] MiyaraI,ShafranH,HaimovichHK,犲狋犪犾.Multifactorregulationofpectatelyasesecretionby犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犵犾狅犲狅狊狆狅狉犻
狅犻犱犲狊pathogeniconavocadofruits.MolecularPlantPathology,2008,9(3):281291.
[27] ZhangCC,LiangYC,MengJR,犲狋犪犾.Identificationandbiologicalcharacterresearchonanthracnoseof犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊spp.
JournalofGuangxiAgriculturalUniversity,1998,17(1):8791.
[28] FengSF,LiFE,HeCZ,犲狋犪犾.Bionomicsandepidemiologyofanthracnoseon犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊spp.ChineseJournalofTropi
calCrops,1994,15(1):9093.
参考文献:
[1] 刘凤民,崔晓东,伍康荣,等.柱花草炭疽菌生物学特性的研究.广东农业科学,2012,16:6568.
[2] 易克贤.我国热带牧草产业化的发展现状、前景与对策.热带农业科学,2001,4:3034.
[3] 蒋昌顺,邹冬梅,张正义.柱花草炭疽病及其抗病育种研究进展.四川草原,2002,(1):2227.
[5] 卞静,陈泰祥,陈秀蓉.当归新病害———炭疽病病原鉴定及发病规律研究.草业学报,2014,23(6):266273.
[7] 刘朋娟,王政逸,王秋华,等.农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选.中国水稻科学,2006,20(3):231237.
[8] 俞咪娜,胡建坤,黄磊,等.稻曲病菌TDNA插入突变体5062的插入位点分析.中国农业科学,2013,46(9):17901798.
[10] 方丽,刘海青,宋凤鸣,等.农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化.浙江大学学报(农业与生命科学版),2006,32(4):360
366.
[11] 曾大兴,李敏慧,姜子德.根癌农杆菌介导的香蕉炭疽菌转化.仲恺农业技术学院学报,2005,18(4):4244.
[12] 李伟,郑肖兰,贺春萍,等.根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立.植物保护,2008,34(1):7681.
[13] 胡彩平,郑金龙,高建明,等.根癌农杆菌介导柱花草炭疽菌遗传转化体系的优化.热带作物学报,2013,34(6):1007
1012.
[16] 易克贤,黄俊生,刘国道.中国柱花草炭疽病原菌遗传多态性的RAPD分析.微生物学报,2003,43(3):379387.
[17] 高建明,胡彩平,郑金龙,等.柱花草炭疽病菌TDNA插入突变体库的构建与分析.广东农业科学,2014,19(10):142
145.
[20] 刘梅,张玮,周莹,等.葡萄炭疽病研究进展.中国植保导刊,2014,34(1):2933.
[27] 张超冲,梁英彩,蒙绞荣,等.柱花草炭疽病菌的鉴定及生物学特性研究.广西农业大学学报,1998,17(1):8791.
[28] 冯淑芬,李凤娥,何朝族,等.笔花豆炭疽病菌生物学特性和流行条件研究.热带作物学报,1994,15(1):9093.
941第8期 许沛冬 等:柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的TDNA插入位点侧翼序列的克隆