全 文 ：林业科学研究摇 圆园员猿袁圆远渊源冤院源愿园 源愿苑云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员猿冤园源鄄园源愿园鄄园愿
猴头菌锰过氧化物酶 员基因在构巢曲霉的
异源转化与表达
尹立伟员袁 圆袁 池玉杰员鄢
渊员援东北林业大学林学院袁 黑龙江 哈尔滨摇 员缘园园源园曰 圆援安庆师范学院生命科学学院袁安徽 安庆摇 圆源远园员员冤
收稿日期院 圆园员猿鄄园员鄄员远
基金项目院 国家自然科学基金面上项目渊猿园远苑员苑园园冤
作者简介院 尹立伟渊员怨愿员要冤袁女袁黑龙江双鸭山人袁博士袁主要研究方向真菌生物学援 耘皂葬蚤造院 噪葬蚤曾蚤灶造蚤憎藻蚤岳 员远猿援 糟燥皂
鄢 通讯作者院博士生导师袁教授袁主要研究方向林木病理学尧真菌生物学援 耘皂葬蚤造院 糟澡蚤赠怎躁蚤藻灶藻枣怎岳 员圆远援 糟燥皂
摘要院为提高猴头菌菌株 悦月员 锰过氧化物酶渊酝灶孕冤基因的表达产量袁采用 孕耘郧 辕 悦葬悦造圆 介导的原生质体转化方法袁将
携带有 匀藻鄄皂灶责员 的重组质粒 责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 转入到构巢曲霉尿嘧啶尿苷营养缺陷菌株 栽晕园圆粤苑 的原生质体中袁获
得了转化子菌株 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员袁并在乙醇脱氢酶启动子 葬造糟粤渊责冤控制下实现了异源表达遥 将 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员尧
栽晕园圆粤苑尧构巢曲霉野生型菌株 宰允粤园员尧猴头菌菌株 悦月员 在相同的木质素环境下进行培养并检测 酝灶孕 酶活性袁结果
表明院转化子菌株 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 在 园郾 园缘 早窑蕴 原员血红素的情况下尧诱导 怨远 澡后酶活性最高为 猿愿郾 猿员 哉窑蕴 原员袁比不
添加血红素的酶活力高 愿郾 远源 倍袁但比猴头菌菌株 悦月员 的酶活力低袁而 栽晕园圆粤苑 与 宰允粤园员 始终无 酝灶孕酶活性袁说明
基因 匀藻鄄皂灶责员 已经成功地被转化到 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 中袁并在木质素环境下得到表达袁血红素是重组 酝灶孕基因异源
表达的限制性因素之一遥 本文为生产 酝灶孕和提高 酝灶孕产量提供了新的途径遥
关键词院猴头菌曰锰过氧化物酶曰构巢曲霉曰转化曰表达
中图分类号院杂苑员愿援 愿 文献标识码院粤
匀藻贼藻则燥造燥早燥怎泽 栽则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 葬灶凿 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 匀藻则蚤糟蚤怎皂 藻则蚤灶葬糟藻怎皂
酝葬灶早葬灶藻泽藻 孕藻则燥曾蚤凿葬泽藻 员 郧藻灶藻 蚤灶 粤泽责藻则早蚤造造怎泽 灶蚤凿怎造葬灶泽
再陨晕 蕴蚤鄄憎藻蚤员袁 圆袁 悦匀陨 再怎鄄躁蚤藻员
渊员郾 悦燥造造藻早藻 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 晕燥则贼澡藻葬泽贼 云燥则藻泽贼则赠 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀葬则遭蚤灶摇 员缘园园源园袁 匀藻蚤造燥灶早躁蚤葬灶早袁 悦澡蚤灶葬曰
圆郾 杂糟澡燥燥造 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻袁 粤灶择蚤灶早 栽藻葬糟澡藻则泽 悦燥造造藻早藻袁 粤灶择蚤灶早摇 圆源远园员员袁 粤灶澡怎蚤袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 憎澡蚤糟澡 糟燥灶贼葬蚤灶泽 葬 早藻灶藻 藻灶糟燥凿蚤灶早 枣燥则 皂葬灶早葬灶藻泽藻 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻
渊匀藻鄄皂灶责员冤 枣则燥皂 匀藻则蚤糟蚤怎皂 藻则蚤灶葬糟藻怎皂 悦月员 憎葬泽 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼藻凿 蚤灶贼燥 责则燥贼燥责造葬泽贼泽 燥枣 葬怎曾燥贼则燥责澡蚤糟 泽贼葬蚤灶 栽晕园圆粤苑 燥枣 粤泽责藻则鄄
早蚤造造怎泽 灶蚤凿怎造葬灶泽 遭赠 皂藻葬灶泽 燥枣 责则燥贼燥责造葬泽贼 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿 皂藻凿蚤葬贼藻凿 遭赠 孕耘郧 辕 悦葬悦造圆泽燥 葬泽 贼燥 藻灶澡葬灶糟藻 酝灶孕 责则燥凿怎糟鄄贼蚤燥灶援 粤 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼 泽贼葬蚤灶 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 燥枣 粤援 灶蚤凿怎造葬灶泽 憎葬泽 早葬蚤灶藻凿袁 贼澡藻 早藻灶藻 匀藻鄄皂灶责员 憎葬泽 藻曾责则藻泽泽藻凿 怎灶凿藻则 贼澡藻
糟燥灶贼则燥造 燥枣 葬造糟燥澡燥造 凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 葬造糟粤渊 责冤 责则燥皂燥贼藻则援 栽澡藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼 泽贼葬蚤灶 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员袁 葬怎曾燥贼则燥责澡蚤糟 泽贼葬蚤灶
栽晕园圆粤苑袁 憎蚤造凿 泽贼葬蚤灶 燥枣 粤援 灶蚤凿怎造葬灶泽 宰允粤园员袁 葬灶凿 匀援 藻则蚤灶葬糟藻怎皂 悦月员 憎藻则藻 糟怎造贼怎则藻凿 怎灶凿藻则 贼澡藻 泽葬皂藻 造蚤早灶蚤灶 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶
葬灶凿 凿藻贼藻糟贼藻凿 贼澡藻 酝灶孕 葬糟贼蚤增蚤贼赠援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 糟燥怎造凿 责则燥凿怎糟藻 酝灶孕 葬糟贼蚤增蚤贼赠 蚤灶 贼澡藻 葬遭泽藻灶糟藻
葬灶凿 责则藻泽藻灶糟藻 燥枣 澡藻皂藻袁 遭怎贼 贼澡藻 酝灶孕 葬糟贼蚤增蚤贼赠 憎葬泽 怎责 贼燥 猿愿郾 猿员 哉窑蕴 原员 燥灶 怨远澡 憎蚤贼澡 园郾 园缘 早窑蕴 原员 澡藻皂藻 憎澡蚤糟澡 憎葬泽
愿郾 远源 贼蚤皂藻泽 澡蚤早澡藻则 贼澡葬灶 贼澡葬贼 憎蚤贼澡燥怎贼 澡藻皂藻 遭怎贼 造藻泽泽 贼澡葬灶 贼澡葬贼 燥枣 匀援 藻则蚤灶葬糟藻怎皂 悦月员袁 憎澡藻则藻葬泽 栽晕园圆粤苑 葬灶凿 宰允粤园员
糟燥怎造凿 灶燥贼 责则燥凿怎糟藻 酝灶孕 葬糟贼蚤增蚤贼赠 葬贼 葬灶赠 贼蚤皂藻袁 蚤灶凿蚤糟葬贼蚤灶早 贼澡葬贼 贼澡藻 早藻灶藻 匀藻鄄皂灶责员 澡葬凿 遭藻藻灶 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 蚤灶贼燥
栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 葬灶凿 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 造蚤早灶蚤灶 藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼袁 葬灶凿 贼澡藻 澡藻皂藻 憎葬泽 燥灶藻 燥枣 贼澡藻 则藻泽贼则蚤糟贼蚤增藻 枣葬糟贼燥则泽 枣燥则 则藻泽糟燥皂遭蚤鄄
灶葬灶贼 皂灶责 早藻灶藻 贼燥 藻曾责则藻泽泽 蚤灶 粤援 灶蚤凿怎造葬灶泽援 栽澡藻 泽贼怎凿赠 责则燥增蚤凿藻泽 葬 灶藻憎 皂藻贼澡燥凿 贼燥 责则燥凿怎糟藻 酝灶孕 葬灶凿 藻灶澡葬灶糟藻 酝灶孕
第 源 期 尹立伟等院猴头菌锰过氧化物酶 员 基因在构巢曲霉的异源转化与表达
赠蚤藻造凿援
运藻赠 憎燥则凿泽院 匀藻则蚤糟蚤怎皂 藻则蚤灶葬糟藻怎皂曰 皂葬灶早葬灶藻泽藻 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻曰 粤泽责藻则早蚤造造怎泽 灶蚤凿怎造葬灶泽曰 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶曰 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
锰过氧化物酶渊酝葬灶早葬灶藻泽藻 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻泽 渊酝灶孕泽曰
耘悦 员援 员员援 员援 员猿冤冤是真菌分泌的一种糖基化含 云藻猿 垣
和血红素的胞外过氧化物酶袁分子量为 猿愿援 园 远圆援 缘
噪阅葬袁广泛存在于白腐菌中遥 大多数 酝灶孕泽 的活性依
赖于 酝灶圆 垣和 匀圆韵圆 的存在袁因是含有血红素辅基的
多种同工酶袁又称血红素过氧化物酶遥 酝灶孕泽能氧化
分解芳香环多聚体袁也可氧化木质素中的酚类和非
酚类的结构单元袁是一种高效的木质素降解酶咱员暂 遥
目前袁国内对白腐菌 酝灶孕泽 的酶学性质尧染料的脱
色尧纸浆的漂白尧有机污染物的降解等都有研究袁但
对 酝灶孕泽的基因表达调控和构建优良工程菌株等研
究相对较少遥 为了实现高效表达从而提高 酝灶孕泽 基
因的表达产量袁可进行基因转化与表达研究遥 同源
转化一般可以获得较高的表达量袁但 酝灶孕泽 的同源
转化需首先要构建载体 原受体系统遥 构建表达型载
体质粒需考虑以下表达与转化元件院适合于白腐菌
本体菌株的强基因启动子尧翻译起始区域尧信号肽的
编码序列尧报告基因的插入尧目的基因的插入尧筛选
标记尧转录终止和聚腺苷酸作用的信号序列等咱圆暂 遥
筛选标记保证筛选出阳性转化子和保持转化 阅晕粤
在宿主中的遗传稳定性袁转化时通过转入的标记基
因与受体细胞突变基因互补袁使受体菌表现出与野
生型相同的生长表型遥 如使用营养缺陷型标记要求
有特定营养缺陷型受体菌袁但大多数丝状真菌难以
获得适宜的营养缺陷型菌株袁需要耗时进行培养与
筛选袁因而限制了本体菌株的使用咱猿暂 遥 酝葬赠枣蚤藻造凿
等咱源暂和 郧藻造责噪藻等咱缘暂研究了黄孢原毛平革菌渊孕澡葬灶藻则鄄
燥糟澡葬藻贼藻 糟澡则赠泽燥泽责燥则蚤怎皂 月怎则凿泽葬造造冤的 酝灶孕基因和木质素
过氧化物酶 蕴蚤孕基因的同源表达袁然而袁同源表达不
利的因素是重组蛋白易受本体蛋白的交叉污染曰在
饥饿条件下袁重组基因会出现与本体基因同样的表
达水平咱远暂 遥
近年来袁几个研究小组探索了 酝灶孕泽 在不同宿
主菌中的异源表达袁几种 酝灶孕泽 基因异源转化与表
达的宿主细胞主要有大肠杆菌 渊 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤
渊酝蚤早怎造葬 冤冤 咱苑暂 尧 巴斯德毕赤酵母 渊 孕蚤糟澡蚤葬 责葬泽贼燥则蚤泽
渊郧怎蚤造造蚤藻则皂援 冤 孕澡葬枣枣冤 咱愿暂 尧构巢曲霉 渊 粤泽责藻则早蚤造造怎泽 灶蚤凿怎鄄
造葬灶泽 渊耘蚤凿葬皂冤 郧 宰蚤灶贼藻则冤 咱怨暂 尧米曲霉渊粤援 燥则赠扎葬藻 渊粤澡造鄄
遭怎则早冤 耘援 悦燥澡灶冤 咱员园暂 尧黑曲霉渊粤援 灶蚤早藻则 灾援 栽蚤藻早澡援 冤 咱员员暂
等遥 员怨怨员 年袁允燥澡灶泽燥灶 等咱员圆暂首先进行了黄孢原毛平
革菌 酝灶孕基因在杆状病毒中的异源表达曰随后 员怨怨缘
年袁宰澡蚤贼憎葬皂等咱员猿暂和 阅燥赠造藻 等咱员源暂发现黄孢原毛平革
菌的 皂灶责匀源 基因在大肠杆菌中的重组表达比在杆
状病毒中的表达酶活产量高袁得到了低成本高产出
的表达效果遥 圆园园猿 年袁郧怎 等咱员缘暂研究小组将黄孢原
毛平革菌的 皂灶责员 糟阅晕粤 基因在巴斯德毕赤酵中实
现了表达袁转化子菌株分泌了有活性的重组 酝灶孕
渊则酝灶孕冤袁表明巴斯德毕赤酵母能有效地完成必需的
蛋白翻译后加工修饰机制袁包括血红素的插入尧蛋白
糖基化尧空间折叠和分泌曰然而袁血红素是表达系统
最主要的限制因素咱员园袁员远暂 遥 员怨怨远 年袁杂贼藻憎葬则贼 等咱员园暂研
究小组首次实现了黄孢原毛平革菌的 酝灶孕员 基因在
米曲霉中的过表达遥 员怨怨怨 年袁砸怎蚤扎鄄凿怎藻俳葬泽 等咱员苑暂研
究了杏鲍菇渊孕造藻怎则燥贼怎泽 藻则赠灶早蚤蚤 渊阅悦援 院云则援 冤 匝怎佴造援 冤
酝灶孕蕴圆 基因在构巢曲霉的 葬造糟粤 启动子控制下成功
表达并分泌酶活性袁但重组菌的 酝灶孕 酶活比在杏鲍
菇培养液中的 酝灶孕 酶活低遥 圆园园员 年袁蕴葬则则燥灶凿燥 等咱怨暂
研究小组发现袁虫拟蜡菌渊悦藻则蚤责燥则蚤燥责泽蚤泽 泽怎遭增藻则皂蚤泽责燥则葬
渊孕蚤造佗贼冤 郧蚤造遭援 驭 砸赠增葬则凿藻灶冤的 酝灶孕员 基因未受到交叉
污染袁能在构巢曲霉中得到适合的表达袁并与黄孢原
毛平革菌的 则酝灶孕泽 匀源 基因在米曲霉中的表达作比
较袁发现构巢曲霉适合外源基因有效的表达和分泌袁
是一个理想的宿主表达菌株遥
目前袁国内对白腐菌 酝灶孕 基因在丝状真菌中表
达的研究还不多遥 本文根据笔者已克隆到的猴头菌
渊匀藻则蚤糟蚤怎皂 藻则蚤灶葬糟藻怎皂 渊月怎造造援 院云则援 冤 孕藻则泽援 冤 菌株 悦月员
锰过氧化物酶 员渊酝灶孕员冤基因的基础上袁为实现高效
表达提高猴头菌 酝灶孕员 基因的表达产量袁从而在构
巢曲霉中实现了异源转化与表达研究袁对构建优良
工程菌株及商业化生产具有重要意义和理论价值遥
员摇 材料和方法
员郾 员摇 菌株与质粒
菌株院 转化用构巢曲霉菌株 栽晕园圆粤苑 为带有
责赠则郧愿怨 突变标记的尿嘧啶尿苷营养缺陷体袁该菌株
去除了非同源重组基因 灶噪怎渊责赠则郧愿怨曰责赠则燥粤源袁灶噪怎粤院院
葬则早月圆曰则蚤遭燥月圆冤袁只有在加有尿苷和尿嘧啶的丰富培
养基中才能正常生长遥 构巢曲霉野生型菌株宰允粤园员
渊责赠则燥粤源袁 则蚤遭燥月圆冤为对照菌株遥 猴头菌渊匀援 藻则蚤灶葬糟藻鄄
怎皂冤菌株 悦月员 由东北林业大学森林保护学科森林病
虫病理实验室提供遥 栽晕园圆粤苑尧宰允粤园员 与猴头菌 悦月员
的菌种试验前分别在 再哉哉尧再粤郧尧孕阅粤 试管斜面上
员愿源
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
保存在 源 益冰箱中遥
质粒院责蕴月园员 为本试验采用的整合型表达载体
质粒袁该质粒长 远郾 园 运遭袁以 责月造怎藻泽糟则蚤责贼 杂运渊 原 冤为骨
架袁启动子 葬造糟粤渊责冤下插入报告基因 郧云孕基因袁含有
多克隆 酝悦杂 酶切位点袁加入了粗糙脉孢霉渊晕藻怎则燥泽鄄
责燥则葬 糟则葬泽泽葬 杂澡藻葬则 驭 月援 韵援 阅燥凿早藻冤的乳清酸核苷鄄缘忆鄄
磷酸脱羧酶的靶基因 责赠则源 和 粤酝孕抗性筛选标记袁可
以有效地弥补 栽晕园圆粤苑 菌株尿苷尿嘧啶的缺陷咱员愿暂 袁
试验前质粒保存在 原 愿园 益冰箱中遥 菌株 栽晕园圆粤苑尧
宰允粤园员 和质粒 责蕴月园员 由南京师范大学生命科学学
院微生物所陆玲教授惠赠渊圆园员园 年 员员 月冤遥
员援 圆摇 培养基
再粤郧培养基院酵母粉 缘 早袁葡萄糖 圆园 早袁微量元素
溶液 员 皂蕴袁固体培养基加入 圆豫琼脂粉渊憎窑增 原员 冤袁
加蒸馏水定容至 员 园园园 皂蕴遥
再哉哉培养基院在 再粤郧培养基的基础上加入 员郾 猿
早尿嘧啶和 员郾 圆 早尿苷遥
再粤郧运和 再哉哉运 培养基院分别在 再粤郧 和 再哉哉
培养基的基础上加入 源源郾 苑 早窑蕴 原员 运悦造咱员怨 原 圆园暂 袁加蒸
馏水定容至 员 园园园 皂蕴遥
酝酝孕阅砸培养基院圆园 伊 杂葬造贼泽 缘园 皂蕴袁微量元素 员
皂蕴袁葡萄糖 员园 早袁责赠则燥凿燥曾蚤灶藻 园郾 缘 皂早袁 则蚤遭燥枣造葬增蚤灶 圆郾 缘
皂早袁加蒸馏水定容至 员 园园园 皂蕴袁固体培养基需加入
圆豫琼脂粉渊憎窑增 原员冤袁调 责匀值至 远郾 缘遥
酝酝孕郧砸培养基院将 酝酝孕阅砸培养基中的 员园 早窑
蕴 原员的葡萄糖替换成 员园园豫甘油 员园 皂蕴遥
酝酝孕郧砸栽培养基院在 酝酝孕郧砸 培养基的基础上
加入 员员郾 怨 早窑蕴 原员的苏氨酸咱圆员暂 遥
员援 猿摇 重组质粒的构建与双酶切验证
根据笔者已克隆到的猴头菌 悦月员 的 酝灶孕员 完整
糟阅晕粤基因 匀藻鄄皂灶责员 设计表达用双酶切引物袁上游
引物院 缘忆鄄郧悦栽悦栽粤郧粤粤栽郧郧悦郧栽栽悦粤粤粤粤悦栽栽栽悦郧鄄猿忆袁
下 游 引 物院 缘忆鄄悦郧郧郧粤栽悦悦栽栽粤粤郧粤悦郧郧郧郧郧鄄
郧粤悦郧郧郧郧鄄猿忆袁下划线分别为 载遭葬 陨 和 月葬皂匀 陨 的酶
切位点袁酶切位点前面设置 圆 个保护碱基袁引物由上
海生工合成遥 利用真菌 砸晕粤 提取试剂盒提取猴头
菌总 砸晕粤袁利用 韵造蚤早燥 凿栽 引物和两步法 砸栽鄄孕悦砸 试
剂盒进行反转录获得 糟阅晕粤 第 员 条链袁用上述双酶
切引物扩增得到 匀藻鄄皂灶责员 全长 悦阅杂 序列遥 用凝胶
回收试剂盒回收目的基因袁将目的基因与 责酝阅员愿鄄栽
渊杂蚤皂责造藻冤 载体连接袁构建目的基因的载体质粒
责酝阅员愿鄄栽 辕 匀藻鄄皂灶责员遥 将 责酝阅员愿鄄栽 辕 匀藻鄄皂灶责员 与 责蕴月园员
分别 载遭葬 陨和 月葬皂匀 陨 双酶切袁然后用 栽源 连接酶进
行连接袁构建重组质粒 责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员遥 用 孕糟蚤则糟造藻
软件绘制表达载体 责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 的质粒图谱遥 将
重组质粒 责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 转化到大肠杆菌 栽燥孕员园 感
受态细胞中袁培养后用质粒 阅晕粤 小提试剂盒及相关
方法从过夜培养的菌液中提取重组质粒袁对其浓度
进行检测曰然后对提取的重组质粒进行 载遭葬 陨尧月葬皂匀
陨双酶切验证及用双酶切引物进行 孕悦砸 扩增验证袁
对 孕悦砸验证阳性产物进行 员郾 园豫琼脂糖凝胶电泳检
测并测序遥
员援 源摇 原生质体的制备与 孕耘郧 辕 悦葬悦造圆 方法的转化
原生质体制备时转化用的溶液 员尧圆尧猿尧源尧缘 按照
参考文献咱圆圆暂中的方法进行配制和贮存遥 构巢曲
霉菌株 栽晕园圆粤苑 待 猿园豫 缘园豫的分生孢子萌发且芽
管在 员 个孢子长度以内时袁收集孢子袁用溶壁酶尧纤
维素酶和蜗牛酶以 员 颐 员 颐 员 的比例在 猿园 益尧员缘园 则窑
皂蚤灶 原员下酶解处理 猿 澡袁以获得原生质体遥 在制备
栽晕园圆粤苑 原生质体的同时制备 宰允粤园员 原生质体做对
照遥 采用 孕耘郧 辕 悦葬悦造圆 介导的转化方法袁向 员园园 滋蕴的
原生质体中加入 员园 圆园 滋蕴 重组质粒 责蕴月园员 辕 匀藻鄄
皂灶责员渊其中袁测定 阅晕粤浓度使其至少达到 缘园园 灶早窑
滋蕴 原员以上冤袁然后加入 缘园 滋蕴 转化用溶液 源 进行转
化遥 向转化后的原生质体悬液中加入 圆缘 皂蕴 源缘 益
液化的 再粤郧运渊圆豫低熔点的琼脂粉冤袁立刻混匀倒入
无菌平板袁置于 猿园 益下过夜袁第 圆 天放置 猿苑 益下继
续培养 圆 猿 凿后袁对每个生长出来的菌落袁分别用
牙签挑出后袁点接或划线于 再粤郧 培养基上继续培养
圆 猿 凿袁筛选能在 再粤郧培养基上生长良好的转化子
并计数遥 之后袁将生长出的转化子继续在 再粤郧 培养
基上划线培养 员 圆 次袁确定其生长性状稳定袁具体
操作步骤参照参考文献咱圆猿暂中方法进行遥 将原营
养缺陷体菌株 栽晕园圆粤苑尧野生型菌株 宰允粤园员 分别接
种在 再哉哉和 再粤郧培养基上袁置于 猿苑 益培养箱内 圆
猿 凿袁二者的生长表型用作对照遥 用牙签挑取 怨 个
生长性状稳定的转化子单菌落分别点接于 酝酝孕阅砸尧
酝酝孕郧砸和 酝酝孕郧砸栽平板培养基的一侧袁而将野生
型菌株 宰允粤园员 用牙签点接于同一平板培养基的另
一侧袁观察转化子单菌落在 猿 种培养基上的生长情
况袁进行高效表达用培养基的筛选遥
员援 缘摇 转化子的 孕悦砸鉴定
收集 猿 个在 酝酝孕郧砸栽 培养基上生长性状稳定
的转化子菌丝袁提取基因组 阅晕粤袁分别利用 员援 猿 中的
双酶切引物和重组质粒的乙醇脱氢酶启动子渊葬造糟粤冤
部分作为上游引物咱圆源暂 尧双酶切的下游引物作为下游
圆愿源
第 源 期 尹立伟等院猴头菌锰过氧化物酶 员 基因在构巢曲霉的异源转化与表达
引物袁进行目的基因的 孕悦砸 扩增验证遥 乙醇脱氢酶
启 动 子 上 游 引 物 为院 缘 爷鄄郧粤郧粤郧悦悦粤鄄
悦粤粤粤悦郧粤郧悦郧猿鄄猿爷遥 孕悦砸产物经 员郾 园豫琼脂糖凝胶
电泳检测后袁用凝胶回收试剂盒回收目的片段袁将目
的片段连接到 孕酝阅员愿鄄栽 载体并转化至大肠杆菌
栽燥孕员园 感受态细胞中袁所得菌液交给上海英俊生物
技术有限公司进行双向测序遥 如双酶切引物扩增出
酝灶孕 基因片段袁 表明基因 匀藻鄄皂灶责员 已转入到
栽晕园圆粤苑 中曰如乙醇脱氢酶启动子上游引物和双酶切
下游引物扩增得到构巢曲霉 葬造糟粤院院郧云孕院院匀藻鄄皂灶责员
基因片段袁表明基因 匀藻鄄皂灶责员 已以正确的方式连接
到了 郧云孕基因上曰两对引物均能扩增出目的产物袁
表明重组菌株 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 已转化成功遥 分别
提取营养缺陷体菌株 栽晕园圆粤苑尧野生型菌株 宰允粤园员
的基因组 阅晕粤袁用上述两对引物进行 孕悦砸扩增作为
对照遥
员援 远摇 转化子酝灶孕酶活测定
在 再粤郧培养基上生长的转化子菌株 栽晕园圆粤苑鄄
匀藻鄄皂灶责员 和野生型菌株 宰允粤园员尧在 再哉哉 固体培养基
上生长的营养缺陷体菌株 栽晕园圆粤苑 培养 圆 猿 凿袁然
后用无菌水分别收集孢子并计数遥 根据高效表达用
培养基的选择结果袁在 酝酝孕郧砸栽 液体培养基上进行
以上各菌株的酶活表达培养遥 在 圆缘园 皂蕴 三角瓶中
加入 缘园 皂蕴 酝酝孕郧砸栽培养基袁加入 圆 早青杨渊孕燥责怎造怎泽
怎泽泽怎则蚤藻灶泽蚤泽 运燥皂援 冤木屑为产酶底物袁不添加血红素和
添加 园郾 园缘 早窑蕴 原员血红素袁调 责匀 值为 远郾 缘袁各取 圆 伊
员园愿 个孢子接种于培养基中袁于 猿苑 益尧圆圆园 则窑皂蚤灶 原员
下摇瓶培养遥 另外袁用营养缺陷体菌株 栽晕园圆粤苑 添
加尿苷尧尿嘧啶进行培养作对照曰同时袁用打孔器在
培养基中接种猴头菌 缘 块 愿 皂皂圆 的菌饼袁在不添加
血红素的情况下进行培养也作为对照遥 分别在培养
后 园尧圆源尧源愿尧苑圆尧怨远尧员圆园尧员源源 澡取 员 皂蕴的培养液作为
胞外酶液袁在 远 园园园 则窑皂蚤灶 原员下离心 缘 皂蚤灶袁收集上清
液进行 酝灶孕 活性测定遥 酶活测定方法见参考文献
咱圆缘暂遥 每项试验设 猿 组重复袁取平均值遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 重组质粒的鉴定
重组质粒 责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 的质粒图谱见图 员遥
利用 砸栽鄄孕悦砸 方法和使用双酶切引物进行反转录
孕悦砸扩增袁产物经测序后获得与猴头菌 酝灶孕员 完整
糟阅晕粤基因完全一致的员 园愿园 遭责 悦阅杂序列遥 由于质粒
责蕴月园员长 远 园园园 遭责袁而 匀藻鄄皂灶责员长 员 园愿园 遭责袁重组质粒
责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员长 苑 园愿园 遭责遥 载体质粒 责酝阅员愿鄄栽 辕 匀藻鄄
皂灶责员双酶切后的电泳结果渊图 圆葬中 员 圆 泳道冤曰重
组质粒 责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 进行 载遭葬 陨尧月葬皂匀 陨 双酶切
后袁产物用 员豫琼脂糖凝胶电泳检测结果渊图 圆遭 中 员
圆泳道冤袁从图 圆遭 可看出院重组质粒的酶切产物得
到了 圆个片段袁员个为 远 园园园 遭责袁员个超 员 园园园 遭责袁与预
期相符袁说明基因 匀藻鄄皂灶责员已连接到 责蕴月园员 质粒载体
上遥 将重组质粒用双酶切引物进行 孕悦砸验证的电泳
产物渊图 圆糟中 圆 苑泳道冤袁同样得到了超过 员 园园园 遭责
的片段袁该产物经测序后与目的基因的完整 糟阅晕粤序
列比对完全一致袁进一步说明基因 匀藻鄄皂灶责员 已连接到
责蕴月园员质粒载体上遥
图 员摇 猴头菌 酝灶孕员 重组表达载体 责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 的结构图
摇 摇 酝院 阅晕粤 酝葬则噪藻则 圆 园园园 遭责和 员缘 园园园 遭责曰葬中 员 圆 泳道院载体质
粒 责酝阅栽酝员愿鄄栽 辕 匀藻鄄皂灶责员 双酶切产物曰遭 中 员 圆 泳道院重组质粒
责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 双酶切产物曰 糟 中 员 泳道为对照袁圆 苑 泳道院
责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 孕悦砸验证遥
图 圆摇 重组质粒的验证
圆援 圆摇 原生质体的制备
用含有 园郾 圆豫 栽憎藻藻灶 愿园 的无菌水收集菌株
栽晕园圆粤苑 在 再哉哉固体培养基上生长 猿 凿 的新鲜分生
孢子渊图 猿葬冤袁当新鲜的 栽晕园圆粤苑 分生孢子在 再哉哉运
液体培养基中 猿园豫 缘园豫的孢子萌发且芽管在 员
个孢子长度以内时渊图 猿遭冤袁猿苑 益下摇瓶培养 苑 员园
澡袁当萌发的孢子细胞内出现空泡时表明原生质体已
经形成渊图 猿糟冤遥 与菌株 栽晕园圆粤苑 相比袁野生型菌株
宰允粤园员 产孢量多袁孢子萌发时间早尧数量多遥
猿愿源
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
葬院栽晕园圆粤苑 新鲜分生孢子曰遭院栽晕园圆粤苑 分生孢子萌发曰糟院栽晕园圆粤苑 原生质体形成
图 猿摇 菌株 栽晕园圆粤苑 原生质体的制备
圆援 猿摇 转化子的筛选
构巢曲霉菌株 栽晕园圆粤苑 转化后的原生质体悬液
混入到 再粤郧运平板培养基中袁置于 猿园 益下过夜袁之
后在 猿苑 益下培养 圆 猿 凿后生长出的菌落形态见图
源葬遥 对图 源葬中每个生长出的菌落袁分别用牙签挑出
后袁点接于 再粤郧培养基上继续培养 圆 猿 凿袁此时发
现一些菌落能在 再粤郧培养基上生长良好袁长出包括
菌丝渊图 源遭冤和孢子的绿色菌体渊图 源糟 中的 圆 个绿
色圆菌落于与榆冤袁与野生型菌株 宰允粤园员 在 再粤郧 和
再哉哉培养基上的生长形态一致渊图 源藻尧枣冤袁也与原营
养缺陷体菌株 栽晕园圆粤苑 在 再哉哉 培养基上生长的形
态一致渊图 源凿冤袁说明这样的菌落其基因组中含重组
质粒袁即为成功的转化子 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员曰而另一
些菌落用牙签挑出后点接在 再粤郧 培养基上生长受
到明显的抑制袁不能在缺乏尿苷和尿嘧啶的培养基
上生长袁这些即为携带有目的基因的重组质粒没有
被转化到原生质体中去的非转化子渊图 源糟中的其他
源 个点接点淤尧盂尧虞尧愚已停止生长袁没有菌落生长
出来冤遥 统计 猿 次重复的转化子数目袁在 圆 伊 员园愿 个
窑皂蕴 原员孢子浓度尧员园 圆园 滋早质粒 阅晕粤条件下可得
到 猿园 远园 个转化子袁对这些转化子连续传 猿 代培
养袁它们的生长特性均十分稳定遥 原营养缺陷体菌
株 栽晕园圆粤苑 在 再粤郧 培养基上生长受抑制的情况见
图 源早遥
当转化子分别与野生型菌株 宰允粤园员 对接于同
一平皿内的 酝酝孕阅砸尧酝酝孕郧砸 和 酝酝孕郧砸栽 猿 种培养
基上培养时渊图 源澡 躁袁猿 个平板的上部为 宰允粤园员袁
下部为转化子冤袁观察到 猿 个转化子在 酝酝孕郧砸栽 培
养基上生长最快尧产孢量最多尧菌落散发的最大渊图
源躁冤曰其次为酝酝孕郧砸渊图 源蚤中宰允粤园员 菌落有生长袁而
转化子菌株只生长 员 株冤曰而在 酝酝孕阅砸 上生长最
慢尧产孢量最少尧菌落散发的最小或不长渊图 源澡冤遥
表明 酝酝孕郧砸栽培养基是转化子菌株最适生长的培
养基遥
摇 摇 葬院转化后的原生质体在 再粤郧运上生长出的菌落曰遭院转化子筛选 员曰糟院转化子筛选 圆曰凿院栽晕园圆粤苑 在 再哉哉上曰藻院野生
型宰允粤园员 在 再粤郧上曰枣院野生型 宰允粤园员 在 再哉哉上曰早院栽晕园圆粤苑 在 再粤郧平皿上生长受抑制曰澡院宰允粤园员 与转化子在 酝酝孕鄄
阅砸上曰蚤院宰允粤园员 与转化子在 酝酝孕郧砸上曰躁院宰允粤园员 与转化子在 酝酝孕郧砸栽上遥
图 源摇 转化子菌株的筛选
圆援 源摇 转化子的 孕悦砸鉴定
对转化子的基因组 阅晕粤 用扩增猴头菌 酝灶孕员
完整编码序列的双酶切引物和重组质粒的乙醇脱氢
酶启动子渊葬造糟粤冤部分作上游引物尧双酶切的下游引
物作下游引物进行 孕悦砸 反应袁其中袁双酶切引物扩
增的产物经 员郾 园豫琼脂糖凝胶电泳检测后获得大于
员 园园园 遭责的 阅晕粤片段渊图 缘 中 源 远 泳道冤袁该产物
经测序得到 员 园怨远 遭责 的核苷酸序列袁序列比对结果
表明该序列与猴头菌 酝灶孕员 完整编码序列完全一
致曰乙醇脱氢酶启动子渊葬造糟粤冤部分作上游引物尧双酶
源愿源
第 源 期 尹立伟等院猴头菌锰过氧化物酶 员 基因在构巢曲霉的异源转化与表达
切的下游引物作下游引物扩增的产物经 员郾 园豫琼脂
糖凝胶电泳检测后获得大于 圆 园园园 遭责 的 阅晕粤 片段
渊图 缘 中 员 猿 泳道冤袁该产物经测序得到 圆 园员怨 遭责
的核苷酸序列袁序列比对的结果表明该序列包括了
构巢曲霉 葬造糟粤启动子区 员缘员 遭责尧绿色荧光蛋白 郧云孕
基因 苑苑圆 遭责及加有保护性碱基的目的基因完整编
码序列 员 园怨远 遭责袁表明已扩增得到构巢曲霉 葬造糟粤院院
郧云孕院院匀藻鄄皂灶责员 基因片段袁其中袁基因 匀藻鄄皂灶责员 已以
正确的方式连接到 郧云孕基因之后袁进一步证明重组
质粒已成功地转化到构巢曲霉的转化子菌株
栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 中遥 对营养缺陷体菌株 栽晕园圆粤苑尧
野生型菌株 宰允粤园员 的基因组 阅晕粤 用双酶切引物进
行 孕悦砸袁没有扩增出任何 阅晕粤 片段袁表明 圆 个菌株
基因组中不含有编码 酝灶孕 的基因渊图 缘 中 苑 愿 泳
道冤遥
摇 摇 酝院 阅晕粤 酝葬则噪藻则 圆 园园园 遭责曰员 猿 泳道院葬造糟粤部分作上游引物
的 孕悦砸 结果曰源 远 泳道院 双酶切引物的 孕悦砸 结果曰苑 泳道院
栽晕园圆粤苑 双酶切引物的 孕悦砸 结果曰愿院 宰允粤园员 双酶切引物的 孕悦砸
结果
图 缘摇 转化子的 孕悦砸验证结果
圆援 缘摇 转化子酝灶孕酶活性测定
在 员源源 澡的培养过程中袁 构巢曲霉野生型菌株
宰允粤园员 与营养缺陷体菌株 栽晕园圆粤苑 在各种培养条件
下袁提取的胞外上清液始终未检测到 酝灶孕 酶活性袁
表明菌株 宰允粤园员 与 栽晕园圆粤苑 没有 酝灶孕 基因的转录
与表达遥 转化子菌株 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 在不添加血
红素和添加血红素的 酝酝孕郧砸栽液体培养基中袁培养
苑圆 澡 后提取的胞外酶液都检测到 酝灶孕 酶活性袁其
中袁培养 怨远 澡 时袁无血红素和添加血红素的酶活性
均达最高袁分别为 源郾 源源尧猿愿郾 猿员 哉窑蕴 原员袁后者比前者
的酶活力高 愿郾 远源 倍袁但比猴头菌菌株 悦月员 的酶活力
低曰培养 怨远 澡 后袁圆 种培养方式的酶活性都开始下
降袁表明基因 匀藻鄄皂灶责员 已经被转化到 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄
皂灶责员 中袁并在木质素环境下得到表达遥 对比 圆 种培
养方式的检测结果表明院血红素是重组 酝灶孕 基因异
源表达的限制性因素之一袁在重组 酝灶孕 表达的过程
中起关键性的调节作用遥 在培养 员源源 澡 时袁猴头菌
菌株 悦月员 的 酝灶孕酶活性已达 苑愿郾 远 哉窑蕴 原员袁仍继续
上升渊图 远冤遥
图 远摇 酝灶孕酶活性随时间的变化
猿摇 结论与讨论
白腐菌木质素降解酶基因在丝状真菌中的表达
研究旨在揭示其内在表达调控机制和提高酶的表达
产量遥 本研究采用 孕耘郧 辕 悦葬悦造圆 介导的原生质体转化
方法袁首次将猴头菌菌株 悦月员 的 酝灶孕员 基因 匀藻鄄
皂灶责员 转入到构巢曲霉尿嘧啶尿苷营养缺陷体菌株
栽晕园圆粤苑 的原生质体中袁获得转化子菌株 栽晕园圆粤苑鄄
匀藻鄄皂灶责员袁并使该基因在构巢曲霉的乙醇脱氢酶启动
子 葬造糟粤渊责冤控制下实现了异源表达遥 本研究利用 猿
种细胞壁裂解酶袁即溶壁酶尧纤维素酶和蜗牛酶以员颐
员颐 员 的比例混合袁在 猿园 益尧员缘园 则窑皂蚤灶 原员下袁对构巢
曲霉菌株 栽晕园圆粤苑 的新鲜分生孢子进行酶解脱壁处
理 猿 澡袁在试验手法准确得当时袁获得高达 怨园郾 苑愿豫的
原生质化率袁较高的原生质化率为后续的高原生质
体转化率奠定了基础遥 在原生质体转化过程中袁
孕耘郧是促融剂也是渗透压稳定剂袁孕耘郧 与 匀圆韵 分子
之间以 匀 键结合袁使原生质体脱水袁孕耘郧 也作为多
聚物和 悦葬圆 垣等二价阳离子及外源 阅晕粤 在原生质体
表面形成沉淀颗粒袁协助外源基因转移袁促使原生质
体通过内吸作用使外源基因进入到细胞体内遥 本试
验在多次重复进行原生质转化的过程中袁也证明
圆缘豫的质量分数是 孕耘郧远园园园 较适宜的浓度遥 孟祥
锋等咱圆远暂将瑞氏木霉的纤维二糖水解酶渊悦月匀 陨冤转化
到黑曲霉中时袁使用 远园豫 孕耘郧源园园园 也获得了较高的
原生质体转化率遥 质粒 阅晕粤 的浓度也会影响原生
缘愿源
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
质体的转化效率袁员园 滋早 以上的质粒 阅晕粤 浓度可保
证获得较高的转化效率遥 本试验在 圆 伊 员园愿 个窑
皂蕴 原员孢子浓度尧员园 滋早 质粒 阅晕粤 条件下得到 猿园 个
以上的转化子袁从而建立了构巢曲霉高效转化体系遥
由于构巢曲霉的乙醇脱氢酶启动子系统渊葬造糟粤
责则燥皂燥贼藻则冤已经建立咱圆苑暂 袁该启动子克隆自构巢曲霉的
乙醇脱氢酶基因起始密码子上游约 源猿园 遭责 的片段袁
能在曲霉属和一些高等植物体内行使正常功能袁可
以在含有不同碳源的培养基上控制其后面连接的外
源基因的表达袁如在含有葡萄糖的 酝酝孕阅砸 培养基尧
含甘油的 酝酝孕郧砸 培养基及含甘油和苏氨酸的
酝酝孕郧砸栽培养基上外源基因分别表现为受抑制尧不
受抑制和强诱导袁并且这种不同的表达调节与菌株
的无性生长量相一致袁可以直接通过菌株的生长表
型表现出来遥 在本试验中袁由于目的基因 匀藻鄄皂灶责员
已被插入到重组质粒 责蕴月园员 辕 匀藻鄄皂灶责员 中的 郧云孕 基
因之后尧乳清酸核苷鄄缘忆鄄磷酸脱羧酶的靶基因 责赠则源
和 粤酝孕抗性筛选标记的前面袁上述 猿 个基因都在
葬造糟粤启动子之后袁受其转录调控遥 由于转化子菌株
携带有重组质粒袁当转化子单菌落被分别点接于
酝酝孕阅砸尧 酝酝孕郧砸 和 酝酝孕郧砸栽 培养基上时袁 在
酝酝孕阅砸上 葬造糟粤控制的基因表达与菌落生长都受到
葡萄糖的抑制袁只有野生型 宰允粤园员 的菌体生长曰在
酝酝孕郧砸上 葬造糟粤控制的基因则能以接近于该基因正
常情况下的表达水平进行表达袁菌落生长也接近正
常袁与野生型菌株的生长表型相一致曰在同时含有甘
油和苏氨酸的 酝酝孕郧砸栽上袁葬造糟粤 控制的基因表现出
受强诱导而过表达袁无性生长最快袁产孢量最多袁菌
落最大遥 作为检测转化子菌株的 酝酝孕郧砸栽 培养液袁
与 郧葬燥等咱圆愿暂研究的转化子菌株在构巢曲霉中实现
的过表达培养基结果相一致遥 构巢曲霉的乙醇脱氢
酶启动子后插入了绿色荧光蛋白渊郧云孕冤基因袁为获
得绿色荧光标记的构巢曲霉转化子奠定了基础袁而
插入的 郧云孕 基因作为标记基因不会影响转化子
栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 的酶活产量遥
重组 酝灶孕在受体菌株中的酶活袁受特异性强启
动子尧信号肽尧基因拷贝数尧血红素含量尧诱导培养条
件的优化等诸多因素的影响遥 本研究将构巢曲霉的
转化子菌株 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员尧尿嘧啶尿苷营养缺陷
体菌株 栽晕园圆粤苑尧野生型菌株 宰允粤园员 及猴头菌菌株
悦月员 在相同 酝酝孕郧砸栽 培养基的木质素环境下进行
培养并检测 酝灶孕 酶活性袁结果 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 在
含有 园郾 园缘 早窑蕴 原员血红素的情况下尧诱导 怨远 澡 后酶
活性最高为 猿愿郾 猿员 哉窑蕴 原员袁比不加血红素的酶活力
高 愿郾 远源 倍袁但比猴头菌菌株 悦月员 的酶活力低袁而营
养缺陷体菌株 栽晕园圆粤苑 与野生型菌株 宰允粤园员 始终
无 酝灶孕酶活性袁表明基因 匀藻鄄皂灶责员 已被成功地转化
到 栽晕园圆粤苑鄄匀藻鄄皂灶责员 中袁并在木质素环境下得到表
达遥 与猴头菌菌株 悦月员 相比袁转化子的酶活低袁推
测原因之一是其 酝灶孕基因为单基因袁而猴头菌菌株
悦月员 笔者已经克隆到 圆 个 酝灶孕 基因袁因此袁猴头菌
菌株的 酝灶孕泽 基因有 圆 个拷贝数比转化子菌株中
酝灶孕员 的基因拷贝数多遥 血红素是重组血红蛋白基
因在不同表达体系中异源表达的限制性因素咱圆怨暂 袁在
重组 酝灶孕基因的表达过程中也起关键性的调节作
用袁虽然血红素在一定的浓度范围内可以促进重组
酝灶孕的酶活产量袁但缺少或较低的血红素也可能是
转化子菌株 酝灶孕 酶活性较低的限制性因素之一遥
砸怎蚤扎鄄凿怎藻俳葬泽等咱员苑暂将杏鲍菇 酝灶孕蕴圆 基因转化到构巢
曲霉中袁在 葬造糟粤 启动子控制下袁菌丝在由苏氨酸替
代葡萄糖的诱导培养基中生长袁在添加 园郾 缘 早窑蕴 原员
血红素的情况下渊是本试验中血红素含量的 员园 倍冤袁
酝灶孕在 怨远 澡时酶活达到最高袁为 员缘园 哉窑蕴 原员遥 本研
究中的转化子菌株受不同浓度血红素调控的曲线还
有待进一步测试搞清袁通过对血红素浓度的优化袁以
期使 酝灶孕活性达到更高遥 培养环境也影响着酶的
产量袁允蚤葬灶早 等咱圆怨暂将毕赤酵母 杂酝阅员员远愿匀 作为宿主
表达菌袁将黄孢原毛平革菌的 葬酝灶孕员鄄员 转入袁在不添
加血红素的情况下酶活仅为 远 哉窑蕴 原员袁在添加 员 早窑
蕴 原员血红素时袁重组 酝灶孕酶活增加到 员愿缘 哉窑蕴 原员袁而
在生物反应器中添加 园郾 缘 早窑蕴 原员的血红素时袁酝灶孕
的产量急剧增加到 圆 源怨园 哉窑蕴 原员曰而有些异源表达
的结果没有产生酶活或产量非常低袁悦燥灶藻泽葬 等咱员远暂发
现黄孢原毛平革菌的 酝灶孕 在黑曲霉中表达时并不
能提高该蛋白的产量遥
丝状真菌表达系统作为一种生产重组蛋白质产
品的工具袁不仅具有很高的蛋白质分泌能力袁还具备
完善的蛋白翻译后加工修饰机制渊包括肽链剪切尧糖
基化方式尧空间折叠等都与高等真核生物的类似冤袁
能得到大量胞外活性蛋白袁其发酵及下游加工技术
也很成熟遥 构巢曲霉与米曲霉等又是确认的安全生
产菌株袁因此袁是很有潜能的异源基因表达系统袁通
过优化可以用来实现白腐菌锰过氧化物酶基因的异
源表达袁以获得重组 酝灶孕基因较高的转化效率遥 由
于构巢曲霉的转化系统近年来已得到很大的发
展咱猿园暂 袁并且其基因组测序工作已分别被 悦藻则藻燥灶 和
远愿源
第 源 期 尹立伟等院猴头菌锰过氧化物酶 员 基因在构巢曲霉的异源转化与表达
栽陨郧砸完成袁这更有益于利用构巢曲霉进行任意基因
功能的研究咱猿员暂 遥 选择构巢曲霉作为白腐菌 酝灶孕 的
宿主菌是提高该蛋白表达效率的重要手段之一袁为
生产 酝灶孕和提高 酝灶孕产量提供了新途径遥
参考文献院
咱员暂 匀燥枣则蚤糟澡贼藻则 酝援 砸藻增蚤藻憎院 造蚤早灶蚤灶 糟燥灶增藻则泽蚤燥灶 遭赠 皂葬灶早葬灶藻泽藻 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻
渊酝灶孕冤 咱允暂 援 耘灶扎赠皂藻 葬灶凿 酝蚤糟则燥遭蚤葬造 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁圆园园圆袁猿园渊源冤院源缘源
原 源远远
咱圆暂 吴其威援 异源基因在丝状真菌系统中的克隆表达咱 允暂 援 生命科
学袁员怨怨猿袁缘渊圆冤院员怨 原 圆员
咱猿暂 闫培生袁 罗信昌袁 周摇 启援 丝状真菌基因工程研究进展咱 允暂 援 生
物工程进展袁员怨怨怨袁员怨渊员冤院猿远 原 源员
咱源暂 酝葬赠枣蚤藻造凿 酝 月袁 运蚤泽澡蚤 运袁 粤造蚤糟 酝袁 藻贼 葬造援 匀燥皂燥造燥早燥怎泽 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 则藻鄄
糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 皂葬灶早葬灶藻泽藻 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻 蚤灶 孕澡葬灶藻则燥糟澡葬藻贼藻 糟澡则赠泽燥泽责燥则蚤怎皂
咱允暂 援 粤责责造 耘灶增蚤则燥灶 酝蚤糟则燥遭蚤燥造袁员怨怨源袁远园渊员圆冤院源猿园猿 原 源猿园怨
咱缘暂 郧藻造责噪藻 酝 阅 杂袁 郧葬皂遭蚤造造 酝 酝袁 悦藻则藻早澡蚤灶燥 郧 孕 蕴袁 藻贼 葬造援 匀燥皂燥造燥早燥怎泽
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 造蚤早灶蚤灶 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻 蚤灶 孕澡葬灶藻则燥糟澡葬藻贼藻 糟澡则赠鄄
泽燥泽责燥则蚤怎皂咱允暂 援 粤责责造 耘灶增蚤则燥灶 酝蚤糟则燥遭蚤燥造袁员怨怨怨袁远缘 渊源冤院员远苑园 原 员远苑源
咱远暂 杂蚤灶早澡 阅袁 悦澡藻灶 杂援 栽澡藻 憎澡蚤贼藻鄄则燥贼 枣怎灶早怎泽 孕澡葬灶藻则燥糟澡葬藻贼藻 糟澡则赠泽燥泽责燥则蚤鄄
怎皂院 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 枣燥则 贼澡藻 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 造蚤早灶蚤灶鄄凿藻早则葬凿蚤灶早 藻灶扎赠皂藻泽咱 允暂 援
粤责责造 酝蚤糟则燥遭蚤燥造 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造袁圆园园愿袁愿员渊猿冤院猿怨怨 原 源员苑
咱苑暂 宰澡蚤贼憎葬皂 砸袁 栽蚤藻灶 酝援 匀藻贼藻则燥造燥早燥怎泽 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿 则藻糟燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤燥灶 燥枣
枣怎灶早葬造 酝灶 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻咱允暂 援 粤则糟澡 月蚤燥糟澡藻皂 月蚤燥责澡赠泽袁员怨怨远袁猿猿猿 渊圆冤院
源猿怨 原 源源远
咱愿暂 路福平援 木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因的克隆及在甲
醇毕赤酵母中的表达咱阅暂援天津院天津科技大学袁 圆园园源
咱怨暂 蕴葬则则燥灶凿燥 蕴 云袁 蕴燥遭燥泽 杂袁 杂贼藻憎葬则贼 孕 允袁 藻贼 葬造援 陨泽燥藻灶扎赠皂藻 酝怎造贼蚤责造蚤糟蚤贼赠
葬灶凿 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 酝葬灶早葬灶藻泽藻 孕藻则燥曾蚤凿葬泽藻泽 枣则燥皂
悦藻则蚤责燥则蚤燥责泽蚤泽 泽怎遭增藻则皂蚤泽责燥则葬 葬灶凿 孕澡葬灶藻则燥糟澡葬藻贼藻 糟澡则赠泽燥泽责燥则蚤怎皂 咱 允暂 援
粤责责造蚤藻凿 葬灶凿 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼葬造 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠袁圆园园员袁远苑渊缘冤院圆园苑园 原 圆园苑缘
咱员园暂 杂贼藻憎葬则贼 孕袁 宰澡蚤贼憎葬皂 砸 耘袁 运藻则泽贼藻灶 孕 允袁 藻贼 葬造援 耘枣枣蚤糟蚤藻灶贼 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶
燥枣 葬 孕澡葬灶藻则燥糟澡葬藻贼藻 糟澡则赠泽燥泽责燥则蚤怎皂 酝葬灶早葬灶藻泽藻 孕藻则燥曾蚤凿葬泽藻 郧藻灶藻 蚤灶 粤泽鄄
责藻则早蚤造造怎泽 燥则赠扎葬藻 咱 允 暂 援 粤责责造蚤藻凿 葬灶凿 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼葬造 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠袁
员怨怨远袁远圆渊猿冤院愿远园 原 愿远源
咱员员暂 悦燥则贼佴泽鄄耘泽责蚤灶燥泽葬 阅 灾袁粤遭泽葬造佼灶 譧 耘袁 杂葬灶糟澡藻扎 晕袁 藻贼 葬造援 匀藻贼藻则燥造燥早燥怎泽
耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 酝葬灶早葬灶藻泽藻 孕藻则燥曾蚤凿葬泽藻 蚤灶 粤泽责藻则早蚤造造怎泽 灶蚤早藻则 葬灶凿 陨贼泽
耘枣枣藻糟贼 燥灶 孕澡藻灶葬灶贼澡则藻灶藻 砸藻皂燥增葬造 枣则燥皂 杂燥蚤造咱允暂 援 允 酝燥造 酝蚤糟则燥遭蚤燥造 月蚤燥鄄
贼藻糟澡灶燥造袁圆园员员袁圆员渊猿 原 源冤院员圆园 原 员圆怨
咱员圆暂 允燥澡灶泽燥灶 栽 酝袁 蕴蚤 允 运援 匀藻贼藻则燥造燥早燥怎泽 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶
燥枣 葬灶 葬糟贼蚤增藻 造蚤早灶蚤灶 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻 枣则燥皂 孕澡葬灶藻则燥糟澡葬藻贼藻 糟澡则赠泽燥泽责燥则蚤怎皂 怎鄄
泽蚤灶早 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 遭葬糟怎造燥增蚤则怎泽咱允暂 援 粤则糟澡 月蚤燥糟澡藻皂 月蚤燥责澡赠泽袁员怨怨员袁圆怨员
渊圆冤院猿苑员 原 猿苑愿
咱员猿暂 宰澡蚤贼憎葬皂 砸 耘袁 郧葬扎葬则蚤葬灶 陨袁 栽蚤藻灶 酝援 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 枣怎灶早葬造 酝灶 责藻则燥曾鄄
蚤凿葬泽藻 蚤灶 耘援 糟燥造蚤 葬灶凿 则藻枣燥造凿蚤灶早 贼燥 赠蚤藻造凿 葬糟贼蚤增藻 藻灶扎赠皂藻咱允暂 援 月蚤燥糟澡藻皂
月蚤燥责澡赠泽 砸藻泽 悦燥皂皂怎灶袁员怨怨缘袁圆员远渊猿冤院员园员猿 原 员园员苑
咱员源暂 阅燥赠造藻 宰 粤袁 杂皂蚤贼澡 粤 栽援 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 造蚤早灶蚤灶 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻 匀愿 蚤灶
耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤院 枣燥造凿蚤灶早 葬灶凿 葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 藻灶扎赠皂藻
憎蚤贼澡 悦葬圆 垣 葬灶凿 澡葬藻皂咱允暂 援 月蚤燥糟澡藻皂 允袁员怨怨远袁 猿员缘院员缘 原 员怨
咱员缘暂 郧怎 蕴袁 蕴葬躁燥蚤藻 悦袁 运藻造造赠 悦援 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 葬 孕澡葬灶藻则燥糟澡葬藻贼藻 糟澡则赠泽燥泽责燥则蚤鄄
怎皂 酝葬灶早葬灶藻泽藻 孕藻则燥曾蚤凿葬泽藻 郧藻灶藻 蚤灶 贼澡藻 再藻葬泽贼 孕蚤糟澡蚤葬 责葬泽贼燥则蚤泽咱 允暂 援
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造 孕则燥早袁圆园园猿袁员怨渊缘冤院员源园猿 原 员源园怨
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