全 文 ：林业科学研究　2008, 21 (2) : 194～199
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2008) 0220194206
油桐 ISSR2PCR最佳反应体系的建立
李 鹏 1, 2 , 汪阳东 2 , 陈益存 2 , 张小平 13
(1. 安徽师范大学生命科学学院 ,安徽 芜湖 241000; 2. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳 311400)
摘要 :在油桐遗传多样性研究中 ,为了获得清晰可靠、重复性强的 ISSR扩增结果 ,综合采用单因子试验和正交设计两
种方法对影响油桐 ISSR2PCR反应结果的 4个因素 ( Taq酶、Mg2 +、dNTP、引物 )进行优化试验。单因子试验分别研究
各因素对 ISSR2PCR反应的影响 ,找出最佳反应水平。正交设计选用 L9 (34 )方案 ,采用直观分析获得影响因素最佳反
应水平。通过综合比较分析 ,最终建立了油桐 ISSR2PCR反应的最佳反应体系 ,即在 20μL反应体系中 , Taq DNA聚合
酶 1. 0 U,Mg2 + 2. 0 mmol·L - 1 , dNTP 0. 20 mmol·L - 1 ,引物 0. 4μmol·L - 1 , 1 ×PCR缓冲液 , 40 ng模板 DNA。
关键词 :油桐 ; ISSR2PCR;单因子试验 ;正交设计
中图分类号 : S794. 3 文献标识码 : A
收稿日期 : 2007208206
基金项目 : 浙江省重大科技攻关项目“油茶油桐乌桕三种木本油料能源树种新品种选育及中试”(2006C12016)
作者简介 : 李鹏 (1983—) ,男 ,安徽淮北人 ,在读硕士 ,主要从事植物生物技术研究.3 通讯作者.
Establishm en t of O ptim um ISSR2PCR Reaction System
in Tung O il Tree( V ern ic ia fordii)
L I Peng1, 2 , WANG Yang2dong2 , CHEN Yi2cun2 , ZHANG X iao2ping1
(1. College of L ife Science, Anhui Normal University, W uhu 241000, Anhui, China;
2. Research Institute of Subtrop ical Forestry, CAF, Fuyang 311400, Zhejiang, China)
Abstract: To app ly ISSR to genetic breeding of tung oil tree (V ern icia ford ii) , both the single factor test and the
orthogonal diagram were used to op tim ize the ISSR amp lification system of tung in four factors ( Taq DNA
polymerase,Mg2 + , dNTP, p rimer) at three levels respectively. There were some differences between the results of
the two methods. Through comp rehensive analysis, a suitable ISSR2PCR reaction system was established: 20μL
reaction system containing 1. 0 U Taq DNA polymerase, 2. 0 mmol·L - 1 Mg2 + , 0. 20 mmol·L - 1 dNTP, 0. 4μmol
·L - 1 p rimer, 1 ×PCR buffer, 40 ng temp late.
Key words:V ern icia ford ii; ISSR2PCR; single factor tests; orthogonal design
油桐 (V ern icia ford ii ( Hem sl. ) A iry2Shaw)是我
国特有的木本油料树种 ,榨取桐籽获得的桐油是环
保型新型化工原料 ,具有重要的经济价值 [ 1 ]。我国
油桐分布广泛、品种种植分散 ,相互间的亲缘关系也
不甚清楚 ,给油桐种质资源鉴定以及良种选育工作
带来较多困难 ,且目前油桐育种仍主要以传统方式
为主 [ 2 ] ,育种周期较长 ,费时耗力 ,信息量少 ,严重阻
碍了油桐良种选育的进程。分子标记辅助育种克服
了传统育种的缺点 ,并且不受环境和时空限制 ,逐渐
成为油桐良种选育的重要手段之一。
分子标记种类很多 ,不同的标记类型各有优缺
点 ,其中 ISSR ( inter2simp le sequence repeat )分子标
记技术 ,即简单重复间序列标记 ,是近几年在微卫星
(m icrosatellite)或简单序列重复 ( simp le sequence re2
peat, SSR ) 技术上发展起来的一种新的分子标
第 2期 李 　鹏等 :油桐 ISSR2PCR最佳反应体系的建立
记 [ 4 - 5 ]。与 RFLP ( Restriction Fragment Length Poly2
morphism )、RAPD ( random amp lified polymorphism
DNA )、SSR 相比 , ISSR 技术可以揭示更多的多态
性 ,但比 SSR技术简单 ,并具有更高的稳定性和重复
性 ,现已在遗传图谱构建 [ 5 - 6 ]、基因定位 [ 7 ]、遗传多
样性分析 [ 8 ]、种质资源鉴定 [ 9 ]等方面广泛应用。在
油桐分子辅助育种方面 ,曾有报道采用了 RAPD技
术 ,对 3个类型 6个品种家系进行了检测 [ 10 ] ,但未
见 ISSR技术用于油桐相关研究的报道。
鉴于 ISSR是一种基于聚合酶链式反应 ( poly2
merase chain reaction, PCR )的分子标记 ,扩增反应
易受到组分浓度的影响 ,需通过试验反应对 PCR扩
增体系中的主要组分如引物、Mg2 + 、dNTP及 Taq酶
等试剂浓度进行摸索 ,建立 ISSR技术的最佳反应体
系 ,以提高该技术的扩增效率和稳定性。目前 ,对
ISSR2PCR反应体系进行优化主要采用单因子试验
或正交设计两种方法。单因子试验分别研究各因素
对 PCR扩增反应的影响 ,已广泛应用于 PCR反应体
系的建立和优化。正交试验设计具有均衡分散、综
合可比及可伸可缩、效应明确的特性 ,可了解各因素
之间的内在规律 ,较快地找到最优的水平组合 [ 11 ]。
本研究分别采用上述两种方法综合分析不同因素对
油桐 ISSR2PCR反应的影响 ,建立油桐 ISSR2PCR反
应的最佳反应体系 ,为油桐分子标记辅助育种提供
良好的技术平台。
1　材料与方法
1. 1 试验材料
2007年 4月中旬于浙江省金华市婺城区东方
红林场国家级油桐基因库采集油桐幼嫩叶片 ,置于
- 20 ℃保存备用。
1. 2 主要试剂及仪器
用于 ISSR2PCR反应的 Taq DNA聚合酶、dNTP、
Mg2 +购自宝生物工程 (大连 )有限公司 ,引物序列由
加拿大哥伦比亚大学 (UBC)提供 ,上海生工生物工
程技术服务有限公司合成。DNA浓度检测使用 UV2
3100PC紫外可见分光光度计 , PCR反应在 GeneAmp
PCR System 9600 PCR仪上进行。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 油桐基因组 DNA 提取 根据 Doyle等 [ 12 ]
的 CTAB法 ,稍做改进 ,提取基因组 DNA,利用紫外
分光光度计检测 DNA浓度及纯度 , 0. 8%的琼脂糖
凝胶电泳检测 DNA质量。
1. 3. 2 单因子试验 根据前期试验结果 ,设计 Taq
酶、Mg2 + 、dNTP、引物 4个因素 3个水平 (表 1)对 IS2
SR2PCR反应体系的影响 , 3次重复 ,反应总体积 20
μL。模板 DNA浓度均为 40 ng,引物为 855 (AC) 8
YT。反应程序 : 94 ℃预变性 5 m in, 94 ℃变性 45 s,
56 ℃退火 75 s, 72 ℃延伸 1. 5 m in,循环 45次 , 72 ℃
延伸 8 m in, 4 ℃保存。PCR产物用 1. 5%琼脂糖凝
胶电泳检测 , EB染色 ,紫外成像。对结果进行直观
评价 ,初步确立各个因素的最佳反应浓度。
表 1 油桐 ISSR2PCR反应中的各因素水平
影响因素
因素水平 (体系终浓度 )
1 2 3
Taq酶 / (U· (20μL) - 1 ) 1. 0 1. 5 2. 0
Mg2 + / (mmol·L - 1 ) 1. 5 2. 0 2. 5
dNTP / (mmol·L - 1 ) 0. 20 0. 25 0. 30
引物 / (μmol·L - 1 ) 0. 3 0. 4 0. 5
1. 3. 3 ISSR2PCR反应因素水平的正交设计 针对影
响 PCR反应的 Taq酶、Mg2 + 、dNTP、引物 4个因素 ,选
用 L9 (34 )正交表在 3个水平上试验 [13 ] (表 2) ,重复 3
次。参加 PCR反应的因素水平同单因子试验。
ISSR2PCR扩增程序、PCR产物检测与单因子试
验相同。在正交试验结果进行直观分析的基础上 ,
结合单因子试验结果进行综合分析 ,建立油桐 ISSR2
PCR反应的最佳反应体系。
表 2 PCR正交设计表
处理号
影响因素
Taq酶 /
(U·(20μL) - 1 )
Mg2 + /
(mmol·L - 1 )
dNTP/
(mmol·L - 1 )
引物 /
(μmol·L - 1 )
1 1. 0 1. 5 0. 20 0. 3
2 1. 0 2. 0 0. 25 0. 4
3 1. 0 2. 5 0. 30 0. 5
4 1. 5 1. 5 0. 25 0. 5
5 1. 5 2. 0 0. 30 0. 3
6 1. 5 2. 5 0. 20 0. 4
7 2. 0 1. 5 0. 30 0. 4
8 2. 0 2. 0 0. 20 0. 5
9 2. 0 2. 5 0. 25 0. 3
2 结果与分析
2. 1 D NA提取
高质量的油桐 DNA是进行 ISSR2PCR的基础。
采用改良后的 CTAB法提取的 DNA呈无色絮状沉
淀 ,电泳结果显示 DNA 完整 ,无明显降解 ,无 RNA
污染 ,点样孔较干净 (图 1)。DNA的 OD260 /OD280为
1. 82,表明改良后的 CTAB法提取的高质量油桐
591
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
1～16: 样品号 ; M: 标准分子量 DNA
图 1 16个油桐样品基因组 DNA
基因组 DNA可以满足将要进行的分子标记的需要。
2. 2 单因子试验结果分析
2. 2. 1 Taq酶用量对 ISSR2PCR 的影响 在 PCR
反应体系中 , Taq酶用量直接关系扩增的质量 ,浓度
过高会产生非特异性扩增 ,过低则不能扩增。本试
验在 20μL的反应体系中对 Taq酶设置了 1. 0、1. 5、
2. 0 U 3个梯度进行扩增 ,结果表明随着酶浓度的增
加 ,非特异性扩增增加 ,产生拖尾现象 (图 2)。酶用
量为 1. 0 U· ( 20μL ) - 1时的扩增效果明显好于其
他两个水平 ,初步确定 1. 0 U · ( 20μL ) - 1为油桐
ISSR2PCR反应体系中 Taq酶的最佳浓度。
1 - 1～1 - 3、2 - 1～2 - 3、3 - 1～3 - 3: Taq酶用量分别为
1. 0 、1. 5 、2. 0 U;M:标准分子量 DNA
图 2 不同 Taq酶用量的 ISSR2PCR电泳结果
2. 2. 2 dNTP浓度对 ISSR2PCR的影响 　dNTP浓
度直接影响扩增反应的效率。从图 3可以看出 ,当
dNTP浓度为 0. 20 mmol·L - 1时的效果最好 ,条带清
晰度高 ,多态性好 ,初步确定为油桐 ISSR2PCR反应
体系中 dNTP的最佳浓度。
2. 2. 3 Mg2 + 浓度对 ISSR2PCR 的影响 　Mg2 + 在
PCR中的作用是激活 Taq酶 ,通过影响 Taq酶活性
而间接影响 PCR扩增 [ 14 ] ,还能与反应液中的 dNTP、
模板 DNA及引物结合 ,影响引物与模板的结合效
1 - 1～1 - 3、2 - 1～2 - 3、3 - 1～3 - 3: dNTP浓度分别为
0. 20、0. 25、0. 30 mmol·L - 1 ;M: 标准分子量 DNA
图 3 不同 dNTP用量的 ISSR2PCR电泳结果
率、模板与 PCR产物的解链温度以及产物的特异性
和引物二聚体的形成 [ 15 ]。从图 4可以看出 ,Mg2 +浓
度在 2. 0 mmol·L - 1和 2. 5 mmol·L - 1时扩增效果
较好 ,但两者之间无显著差异 ,结合节省试剂等因
素 ,初步将 2. 0 mmol·L - 1确定为 Mg2 +反应浓度。
1 - 1～1 - 3、2 - 1～2 - 3、3 - 1～3 - 3: Mg2 +浓度分别为 1. 5、
2. 0、2. 5 mmol·L - 1 ;M: 标准分子量 DNA
图 4 不同 Mg2 +用量的 ISSR2PCR电泳结果
691
第 2期 李 　鹏等 :油桐 ISSR2PCR最佳反应体系的建立
2. 2. 4　引物浓度对 ISSR2PCR的影响 引物浓度也
是影响 PCR反应的重要因素之一 ,浓度过低不能产
生扩增 ,过高会增加引物二聚体的形成 ,导致条带不
清晰或者产生新的特异性位点。在引物浓度为 0. 4
μmol·L - 1时条带虽然比其他两水平弱 ,但在 200 bp
附近多出一条带 (图 5) ,所以初步将 0. 4μmol·L - 1
作为油桐 ISSR2PCR反应体系中引物的最佳浓度。
1 - 1～1 - 3、2 - 1～2 - 3、3 - 1～3 - 3:引物浓度分别为 0. 3、
0. 4、0. 5μmol·L - 1 ; M: 标准分子量 DNA
图 5 不同引物用量的 ISSR2PCR电泳结果
2. 3 PCR正交设计直观分析
根据 PCR产物条带的强弱和杂带的多少对正交
试验结果 (图 6)进行直观分析 ,最好的记为 9分 ,最差
的记为 1分。9个组合的分数依次为 4、7、9、2、5、6、3、
8、1。根据分数求出每个因素同一水平下的试验值之
和 Ki以及每一因素水平下的数据平均值 ki ,并求出同
一因素不同水平间平均值的极差 R (表 3)。
表 3 正交设计直观分析
结果
影响因素
Taq酶 Mg2 + dNTP 引物
K1 20 9 18 10
K2 13 20 10 16
K3 12 16 17 19
k1 20 /3 3 6 10 /3
k2 13 /3 20 /3 10 /3 16 /3
k3 4 16 /3 17 /3 19 /3
R 8 /3 11 /3 8 /3 3
　　注 : Ki:每个因素同一水平下的试验值之和 ; k i:每一因素水平下
的数据平均值 ; R:同一因素不同水平间平均值的极差。
极差 R反映了各因素对反应体系的影响情况 ,
极差越大 ,表明影响越显著。由表 3可知各因素对
PCR反应影响最大的是 Mg2 + ,其次是引物 , Taq酶
和 dNTP的影响相当。
每一因素水平下的数据平均值 ki反映了影响因
素各水平对反应体系的影响情况 , ki值越大 ,反应水
平越好。由表 3可知 ,由正交设计所得出的 ISSR2
PCR反应中 4个因素的最佳反应水平分别为 : Taq
DNA聚合酶 1. 0 U · ( 20μL ) - 1 , Mg2 + 2. 0 mmol·
L - 1 , dNTP 0. 30 mmol·L - 1 ,引物 0. 5μmol·L - 1。
Taq酶、Mg2 +最佳浓度单因子试验和正交试验结果
均一致 ,因此分别将 1. 0 U· (20μL) - 1和 2. 0 mmol
·L - 1确定为 Taq酶和 Mg2 +最佳浓度 ; dNTP在单因
子试验中最佳浓度为 0. 20 mmol·L - 1 ,与正交试验
结果存在差异 ,由于 dNTP浓度过高时会与 Mg2 +螯
合而对扩增反应起抑制作用 [ 14 ] ,因此选择 0. 20
mmol·L - 1作为油桐 ISSR2PCR反应体系中 dNTP的
最佳浓度 ;单因子试验中引物最佳浓度为 0. 4μmol
·L - 1 ,正交试验结果中最佳浓度为 0. 5μmol·L - 1 ,
为减少非特异性扩增 ,加强重复性 ,本试验将 0. 4
μmol·L - 1作为油桐 ISSR2PCR反应体系中引物的
最佳浓度。
由于所得 Taq酶与 dNTP最佳浓度都是试验中
浓度范围的最低值 ,为确保结果的可靠 ,又以低于上
述浓度重新设定 ,分别将 Taq酶、dNTP在 0. 4、0. 6、
0. 8、1. 0 U · ( 20μL ) - 1和 0. 14、0. 16、0. 18、0. 20
mmol·L - 1浓度范围内做进一步的验证。由图 7看
出 , Taq酶、dNTP仍然在浓度分别为 1. 0 U · ( 20
μL) - 1和 0. 20 mmol·L - 1时扩增效果最好 ,与上述
结果一致。
综合分析结果 ,确定油桐 ISSR2PCR反应的最佳
反应体系为 : Taq DNA聚合酶 1. 0 U· ( 20μL ) - 1 ,
Mg2 + 2. 0 mmol·L - 1 , dNTP 0. 20 mmol·L - 1 ,引物
0. 4μmol·L - 1 , 1 ×PCR缓冲液 , 40 ng模板 DNA。
用其对 16个油桐品种模板 DNA进行扩增 ,取得了
较好的效果 (图 7)。
3 小结与讨论
油桐组织中含有大量的蛋白、多糖以及酚、单宁
等次生代谢物质 ,采用改进后的 CTAB法可有效地
去除这些物质对 DNA提取的影响 ,得到高质量的油
桐基因组 DNA。
模板浓度也是 PCR反应体系的一个因素。在进
行单因子试验和正交试验之前 ,已经对 20μL的 IS2
SR2PCR反应体系的模板浓度进行了 5、10、20、40、60、
80、100 ng的梯度试验 ,结果显示 40 ng的浓度最佳 ,
因此将 40 ng· (20μL) - 1确定为本试验的模板浓度。
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
1～9:处理号 (同表 2) ; M: 标准分子量 DNA
图 6 ISSR2PCR正交试验结果
1 - 1、1 - 2, 2 - 1、2 - 2, 3 - 1、3 - 2, 4 - 1、4 - 2: dNTP浓度分别为 0. 20、0. 18、0. 16、0. 14 mmol·L - 1 ;
5 - 1、5 - 2, 6 - 1、6 - 2, 7 - 1、7 - 2, 8 - 1、8 - 2: Taq酶浓度分别为 0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 U· (20μL) - 1 ;M: 标准分子量 DNA
图 7 不同 dNTP和 Taq酶用量的 ISSR2PCR电泳结果
1～16: 样品号 ; M:标准分子量 DNA
图 8 16个油桐品种的 ISSR2PCR最佳反应体系扩增结果
　　在各影响因素反应浓度范围的选择上 ,本试验
参考了夏腊梅 ( S inoca lycan thus ch inensis ( Cheng et
S. Y. Chang) ) [ 16 ]、桑树 (M orus spp. ) [ 17 ]、银叶树
(Heritiera littora lis D ryand) [ 18 ]、杯萼海桑 (Sonnera tia
a lba J. Sm ith. ) [ 19 ]等 ISSR的反应体系。 Taq酶是
PCR反应的重要因素 ,浓度过高会产生弥散现象 ,过
低则降低扩增效率。资料显示 , ISSR扩增体系中 ,
酶的用量在 1. 0 U · ( 20 μL ) - 1 ～1. 0 U · ( 10
μL) - 1之间均能扩增 ,物种之间差异较大 ,可能也与
不同厂家酶的活性不尽相同有关。本试验所得 Taq
酶最佳浓度为 1. 0 U· (20μL ) - 1 ,既能保证实验结
果的可靠 ,又能节省实验成本。反应体系中 , Mg2 +
能定量地与 dNTP分子中的磷酸基团结合 ,所以两
者有效浓度相互影响。在本试验中 , Mg2 +与 dNTP
最佳浓度分别确定为 2. 0 mmol ·L - 1 和 0. 20
mmol·L - 1。过高的引物浓度易导致碱基错配、引
物二聚体的形成 ,过低扩增产量会下降。本试验确
定 0. 5μmol·L - 1为引物最佳浓度。
利用正交设计对 PCR反应体系能迅速得到最
佳的试验条件的组合 ,但也存在局限性 ,不能很好地
估计实验误差 ,对结果的评价带有一定的主观成分 ,
使各因素最佳反应水平的确定缺乏可靠性。虽然已
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第 2期 李 　鹏等 :油桐 ISSR2PCR最佳反应体系的建立
有研究 [ 20 - 21 ]也对正交试验的结果做了统计学的方
差分析 ,但仍不可避免主观因素造成的影响。采用
单因素 PCR优化设计对各个影响因素逐一进行研
究 ,对最佳水平的确定更直观 ,缺点是过程繁琐 ,且
不能兼顾各成分之间的交互作用。本试验分别用两
种方法分析影响油桐 ISSR2PCR体系的因素 ,并综合
分析优化反应体系 ,可在一定程度上有效克服两种
方法各自的局限性 ,所得到的 Taq酶、Mg2 +最佳浓度
是一致的 ,表明了试验的可信度 ;在另外两种成分
dNTP和引物最佳浓度的确定上 ,两种方法的结果存
在差异 ,这可能与 PCR反应的不稳定性有关 ,也可
能是由于两者各自局限性所造成 ,所以在最佳因素
水平的确定上 ,结合实验实际 ,综合了两种方法的结
果 ,以尽可能地减少实验误差。最后采用最佳因素
水平组合进行的 ISSR2PCR扩增结果也较好 ,说明两
种方法相结合能有效地保证试验的可靠性。本试验
所构建的油桐 ISSR2PCR反应体系 ,为油桐品种 IS2
SR指纹图谱建立、品种鉴定、新品种选育、数量性状
基因定位等工作奠定了良好的技术基础。
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