全 文 ：收稿日期 : 2003201210
基金项目 : 浙江省“十五”科技重点项目“重要阔叶树种资源培育技术研究”(011102198)部分内容
作者简介 : 孟现东 (1977 —) ,男 ,山东陵县人 ,硕士.
林业科学研究　2004 ,17 (1) :42 ～ 46
Forest Research
　　文章编号 :100121498 (2004) 0120042205
枫香 DNA 提取方法与 PCR扩增程序的优化
孟现东 , 陈益泰
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400)
摘要 :从 SDS、CTAB、高盐低 pH值 3 种方法中选择了 CTAB 法作为枫香适合的 DNA 提取方法 ,同时构
建了枫香 DNA 的 PCR 扩增程序 ,并从 Mg + + 浓度、Taq 酶用量、dNTP浓度、引物浓度、DNA 模板用量等
方面优化了 PCR 扩增程序。
关键词 :枫香 ;DNA 提取 ;PCR 扩增程序
中图分类号 :S792114 　　　文献标识码 :A
枫香 (Liquidambar formosana Hance) 为金缕梅科 ( Hamamelidaceae) 落叶乔木 ,广泛分布于我
国南方大部分省区 ,是优良的用材、生态树种。目前对该树种的研究主要集中在优树及子代选
择方面 ,在分子群体遗传方面的研究尚未见报道。用 RAPD 等分子标记方法研究林木的群体
遗传结构与遗传分化已经成为比较常见的方法 ,由于各树种的内含物差异较大 ,其中 DNA 含
量差异也很大 ,故针对不同树种需要采用不同的 DNA 提取方法。本实验的目的是确定最佳的
枫香DNA 提取方法和优化 PCR 扩增程序 ,为进一步开展枫香的分子群体遗传研究作好前期的
基础工作。
1 　材料与方法
111 　实验材料
用 2001 年 11 月从浙江富阳采集的枫香种子 ,于次年 3 月在中国林业科学研究院亚热带
林业研究所苗圃播种 ,育成 1 年生幼苗 ,7 月份采顶端嫩叶作为实验材料。
112 　实验方法
11211 　DNA 提取 　取新鲜枫香嫩叶 5 g ,采用 SDS、CTAB、高盐低 pH值法 3 种方法对枫香进行
DNA 提取[1～3 ] :
(1) SDS 提取法 　参照一般植物基因组 DNA 提取方法中的 SDS 提取液成分 (100 mmol·L - 1
Tris2HCl、50 mmol·L - 1 EDTA、50 mmol·L - 1 NaCl、115 % SDS、2 % PVP、015 %β2巯基乙醇 ,pH
810) ,对其中 NaCl 设 0、50、100、150、200、250 mmol·L - 1 6 个浓度梯度 ,对 pH 值设 710、715、810、
815、910、915 6 个梯度 ,进行实验比较。
(2) CTAB 提取法 　参照一般植物基因组 DNA 提取方法中 CTAB 提取液的成分 (3 %
CTAB 、25 mmol·L - 1 EDTA、114 mol·L - 1NaCl、2 % PVP、115 %β2巯基乙醇 ,pH 810) ,对其中NaCl
设 0、0125、015、0175、110、114 mol·L - 16 个浓度梯度 ,对 pH 值设 710、715、810、814、818、915 6 个
梯度 ,进行实验比较。
(3)高盐低 pH值法[4 ] 　提取液的成分 (100 mmol·L - 1 NaAc、50 mmol·L - 1 EDTA、500 mmol·
L - 1 NaCl、114 % SDS、2 % PVP、015 %β2巯基乙醇 ,pH 515) ,对其中NaCl 设 0、011、012、015、017、1
mmol·L - 16 个浓度梯度 ,对 pH值设 410、415、510、515、610、710 6 个梯度 ,进行实验比较。
对提取的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度计检测 OD 值 (DNA 在波长 260 nm
与 280 nm 处吸收值的比值) 。对提取符合要求 ( OD 值在 116 ～ 210 之间) 的 DNA 进行 PCR 扩
增。
11212 　PCR 扩增程序的构建　参照一般 PCR 扩增方法 ,20μL 反应系统成分 :PCR 反应缓冲液
(500 mmol·L - 1 KCl、100 mmol·L - 1 Tris2HCl、110 % Triton X2100、pH 910) 2μL、Mg + + 210 mmol·
L - 1、Taq 酶 (上海华美公司 100 U·支 - 1) 1 U、dNTP(上海华美公司) 215 mmol·L - 1、引物 (上海生
工公司 10 bp 引物) 017 mmol·L - 1、DNA 模板 50 ng ;用 PE29600 型 PCR 基因扩增仪扩增 ,反应程
序 :先 94 ℃预变性 4 min ,然后进行 40 个循环 (94 ℃变性 1 min ,36 ℃退火 1 min , 72 ℃延伸 115
min) ,最后 72 ℃延伸 8 min 后 ,降至 10 ℃后取出琼脂糖凝胶电泳分析 ,并从 Mg+ + 的浓度、Taq
酶的用量、dNTP 浓度、引物浓度、DNA 模板用量等方面进行优化[5 ] 。
2 　结果与分析
211 　DNA提取方法的优化
21111 　SDS 提取法　在提取过程中 ,pH 值为 810 ～ 910 时都能获得白色絮状沉淀 ,随着 NaCl
浓度的增加白色絮状沉淀粘稠度降低 ,但沉淀量减少 ,在 NaCl 浓度为 250 mmol·L - 1时 ,沉淀消
失。经 UV22401 紫外分光光度计检测 ,在 pH 值 810 ,NaCl 浓度为 150 mmol·L - 1时 ,获得最高
OD 值 (1136) ,电泳检测为一条粘在点样孔处的条带 ,说明存在较为严重的糖污染。
21112 　CTAB 提取法　在 pH值为 715 ～ 910 时都能获得白色絮状沉淀 ,随着NaCl 浓度的增加
白色絮状沉淀粘稠度降低 ,沉淀量减少 ,在 NaCl 浓度为 114 mol·L - 1时 ,沉淀消失。经 UV22401
紫外分光光度计检测 ,在 pH值 814 ,NaCl 浓度为 110 mol·L - 1时 ,获得最佳 OD 值 (11806) ,琼脂
糖凝胶电泳检测 DNA 片断显示为一条带 ,大小在 48 kb 左右 ,可用于 PCR 扩增。
21113 　高盐低 pH值法　在 pH值为 415 ～ 610 时都能获得白色絮状沉淀 ,随着NaCl 浓度的增
加白色絮状沉淀粘稠度降低 ,沉淀量减少。经UV22401 紫外分光光度计检测 ,在 pH值 515 ,Na2
Cl 浓度为 110 mol·L - 1时 ,获得最佳 OD 值 (1147) ,且提取的 DNA 量较少 ;电泳检测同样为一条
粘在点样孔处的条带 ,说明也存在较为严重的糖污染。
通过采用 SDS、CTAB、高盐低 pH值法 3 种方法对枫香进行DNA 提取 ,从实验结果看出 ,用
SDS方法和高盐低 pH值法提取的 DNA 的 OD 值均小于 116 ,主要原因是糖污染 ;只有用 CTAB
方法提取的 DNA 量较多 ,且 OD 值在 116 ～ 210 之间 ,符合 PCR 扩增要求 ,故认为枫香 DNA 适
合的提取方法为 CTAB 法 ,主要步骤如下 :
(1)取新鲜枫香嫩叶 5 g ,液氮研磨成粉末 ,加入 20 mL 65 ℃预热的提取液 (提取液的成分
为 3 % CTAB、25 mmol·L - 1 EDTA、110 mol·L - 1 NaCl、115 %β2巯基乙醇 , pH 814) 。
(2) 65 ℃水浴 20 min ,其间摇匀 2 ～ 3 次 ,取出冷却至室温后 ,加入等体积氯仿∶异戊醇 (体
积比 24∶1) ,摇匀 30 min。
34第 1 期 孟现东等 :枫香 DNA 提取方法与 PCR 扩增程序的优化
(3) 4 000 r·min - 1离心 10 min ,取上清液 ,加入 2 倍体积无水乙醇 ,4 ℃放置 4 h。
(4)挑出白色的絮状物或 3 000 r·min - 1离心 10 min 沉淀絮状物 ,70 %乙醇冲洗絮状物 2 ～
3 次 ,滤纸吸干 ,加入 2 mL TE溶解。
(5)在溶解的 DNA 溶液中加入 2/ 3 倍体积氯仿∶异戊醇 (体积比 24∶1) ,摇匀 30 min ,重复
步骤 (3) 、(4) 。
(6)将提取的DNA 琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度计检测 OD 值。将 OD 值在 116 ～ 210
之间的合格 DNA 稀释至 50 ng·μL - 1 ,用于 PCR 扩增。
212 　PCR扩增程序的优化
参照一般 PCR 扩增方法 ,20μL 反应体系成分 : PCR 反应缓冲液 (500 mmol·L - 1 KCl、100
mmol·L - 1 Tris2HCl、110 % Triton X2100、pH 910) 2μL、Taq 酶 1 U、dNTP 2 mmol·L - 1、引物 1 mmol·
L - 1、DNA 模板 50 ng ;用 PE29600 型 PCR 基因扩增仪扩增 ,反应程序 :先 94 ℃预变性 4 min ,然
后进行 40 个循环 (94 ℃变性 1 min ,36 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 115 min) ,最后 72 ℃延伸 8 min
后 ,降至 10 ℃取出 115 %琼脂糖凝胶电泳分析。扩增结果为有条带扩出 ,但谱带不很清晰 ,决
定从 Mg + + 的浓度、Taq 酶的用量、dNTP 浓度、引物浓度、DNA 模板用量方面进行优化 ,研究各
因子对枫香 PCR 扩增结果的影响。
　图 1 　不同 Mg + +浓度对 PCR 扩增结果的影响
21211 　Mg + +的浓度 　一般认为 PCR 反应的Mg + +浓度
在 115 ～ 410 mmol·L - 1之间 ,所以在 20μL 反应体系中 ,
反应体系中的其他成分不变 ,做 Mg + + 的 6 个不同浓度
梯度 (115、210、215、310、315、410 mmol·L - 1) ,扩增电泳结
果 (图 1)看出 ,随 Mg + +浓度的增加 ,扩增条带数和扩增
产物的量也增加 ,但在高浓度时谱带不是特别清晰 ,考
虑以上两方面因素 ,反应体系中 Mg + + 浓度选定 310
mmol·L - 1是较为合适的。Mg + +浓度对 PCR 反应的特异
性和扩增效率有很大影响 ,Mg + + 浓度降低 ,使扩增效率
降低 ,扩增产物减少 ;Mg + + 浓度过高 ,会使非特异性产
物增加 ,使扩增谱带变宽。
　图 2 　不同 dNTP 浓度对 PCR 扩增结果的影响
21212 　dNTP 浓度　dNTP 浓度对 PCR 反应的扩增效率
有很大影响 ,在反应体系中提供足够浓度 dNTP 是非常
重要的 ,一般认为 210 mmol·L - 1的 dNTP 浓度可满足
PCR 反应的要求。在 20μL 反应体系中 (Mg + + 310 mmol
·L - 1、Taq 酶 1 U、引物 110 mmol·L - 1、DNA 模板 50 ng) ,
对 dNTP 浓度做 6 个不同浓度梯度 (110、115、210、215、
310、315 mmol·L - 1) ,扩增电泳结果看出 (图 2) ,随 dNTP
浓度的增加 ,扩增条带数和扩增产物的量也增加 ,在
dNTP 浓度为 215 mmol·L - 1时 ,扩增结果较为理想 ,故在
反应体系中选用此浓度。由于 dNTP 能与 Mg+ + 结合 ,
dNTP 浓度对 Mg + +浓度有所影响 ,但本实验提供了足够浓度的 Mg+ + ,所以 Mg + + 浓度并未因
dNTP 浓度变化而受影响。在 dNTP 浓度大于 215 mmol·L - 1时 ,扩增结果变化不大 ,但实验成本
44 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 17 卷
增加。
　　图 3 　不同引物浓度对 PCR 扩增结果的影响
21213 　引物浓度 　一般认为 ,引物浓度在 014 ～ 110
mmol·L - 1能满足 PCR 反应的要求。在 20μL 反应体系
中 (Mg + + 310 mmol ·L - 1、dNTP 215 mmol ·L - 1、Taq 酶
1U、、DNA 模板 50 ng) ,引物选用 6 个浓度梯度 (014、015、
016、017、018、110 mmol·L - 1) 进行扩增电泳 ,结果 (图 3)
看出 ,随着引物浓度的加大 ,扩增条带数增加 ,引物浓度
在 015 mmol·L - 1以上时条带数稳定 ,但扩增产物的量增
加 ,为了获得条带清晰特异性好的谱带 ,在反应体系中
选择引物浓度为 017 mmol·L - 1是比较适宜的。在引物
浓度较低时 ,扩增产物效率较低 ;在引物浓度过高时 ,会
影响扩增产物的特异性 ,使谱带变模糊。
　　图 4 　不同 Taq 酶用量对 PCR
　　扩增结果的影响
21214 　Taq 酶的用量　一般认为在 20μL 反应体系中酶
用量在 015 ～ 115 U。在 20μL 反应体系中 (Mg + + 310
mmol·L - 1、引物 017 mmol·L - 1、dNTP 215 mmol·L - 1、DNA
模板 50 ng) ,Taq 酶做 6 个不同用量梯度 (014、016、018、
110、112、114 U) ,扩增电泳结果看出 (图 4) ,随 Taq 用量
的增加 ,扩增条带数和扩增产物的量也增加 ,Taq 酶用量
在 1 U 以上时 ,扩增情况变化不大 ,所以反应体系中 Taq
酶用量选择 1U 较为合适。
21215 　DNA 模板用量　在 20μL 反应体系中 (Mg + + 310
mmol·L - 1、Taq 酶 1 U、dNTP 215 mmol ·L - 1、引物 017
mmol·L - 1) ,选用 10 个 DNA 模板用量梯度 (10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ng) 进行扩增电
泳 ,结果 (图 5)看出 ,模板用量从 10 ～ 100 ng 都能扩出较为清晰的谱带 ,可见 PCR 反应适宜的
DNA 模板浓度有一个较宽的范围。但在 DNA 模板用量为 50 ～ 70 ng 时 ,弱带扩增较其它用量
清晰 ,所以在反应体系中选择 DNA 模板的用量为 60 ng。DNA 模板在浓度过低时 ,产物的量减
少 ,弱带变得不清晰 ;浓度过高会增加非特异性产物 ,使扩增谱带变宽。
图 5 　不同 DNA 模板用量对 PCR 扩增结果的影响
经过对以上几个主要因子的比较 ,确定了 PCR 的扩增程序 :20μL 反应体系中的成分为 ,
54第 1 期 孟现东等 :枫香 DNA 提取方法与 PCR 扩增程序的优化
PCR 反应缓冲液 (500 mmol·L - 1 KCl、100 mmol·L - 1 Tris2HCl、110 %Triton X2100、pH 910) 2μL、
Mg + + 310 mmol·L - 1、Taq 酶 1U、dNTP 215 mmol·L - 1、引物 017 mmol·L - 1、DNA 60 ng ;反应程序
为 ,先 94 ℃预变性 4 min ,然后进行 40 个循环 (94 ℃变性 1 min ,36 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 115
min) ,最后 72 ℃延伸 8 min 后 ,降至 10 ℃后取出 115 %琼脂糖凝胶电泳分析。
3 　小结与讨论
在枫香 DNA 提取中 ,影响其纯度的主要是糖类物质[1 ,6 ] ,除糖的主要方法是使用 CTAB 裂
解 ,能减少糖和蛋白质的污染 ;合适的 NaCl 浓度也是获得足够高纯度的 DNA 的重要影响因
子 ,在裂解液中的 NaCl 浓度越大 ,提取的 DNA 纯度越高 ,但 DNA 的量却越来越少。对于 DNA
含量较少且杂质较多的物种 ,需选择合适的 NaCl 浓度。pH 值也与 NaCl 浓度的影响相似 ,高
pH值可减少糖和蛋白质的污染 ,在枫香DNA 提取中选择 pH值 718 ～ 910 都是可行的 ,但最适
pH值为 814。在 PCR 扩增程序的优化过程中 ,发现各成分的优化有累加效应。在枫香的 PCR
扩增反应中 ,起主要作用的是 Mg + + ,与大部分木本植物相似 ,都需要较高的浓度。在枫香
PCR 扩增反应中选用较低的引物浓度 ,有利于扩增的特异性 ,使电泳谱带清晰 ,在扩增条带数
目多时 ,便于电泳分析。在退火温度上 ,参照一般 PCR 的退火温度 (36 ℃) ,在枫香 PCR 扩增
中能取得较好的效果。
参考文献 :
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The Method for Liquidambar formosana DNA Extracting and
the Optimization of PCR Procedure
MENG Xian2dong , CHEN Yi2tai
(Research Institute of Subtropical Forestry ,CAF , Fuyang 　311400 ,Zhejang ,China)
Abstract :Three methods(SDS method , CTAB method and high salt low pH method) for DNA extracting were
compared. The CTAB method was the best method for Liquidambar formosana DNA extracting. And PCR proce2
dure was optimized about the factors Mg+ + , DNA density etc. It’s proved that the optimum PCR procedure was
as follows :pre2denaturating under 94 ℃for 4 minutes , denaturating under 94 ℃for 1 minutes , annealing under
36 ℃for 1 minutes and extending under 72 ℃for 115 minutes. After 40 cycles , the sample was reacted for 8
minutes under 72 ℃. PCR system includes buffer 2μL ,Mg + + 3. 0 mmol·L - 1 , Taq enzyme 1 U , dNTP 215
mmol·L - 1 , primer 0. 7 mmol·L - 1 ,DNA 60 ng.
Key words :Liquidambar formosana ;DNA extracting ;PCR procedure
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