全 文 ：林业科学研究　2006, 19 (6) : 725～728
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2006) 0620725204
基于 CTAB法提取毛竹基因组 DNA的探讨
高志民 1 , 范少辉 1 , 高　健 1 , 李雪平 1 , 蔡春菊 1 , 彭镇华 23
(1. 国际竹藤网络中心 ,国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室 ,北京　100102;
2. 中国林业科学研究院林业研究所 ,北京　100091)
摘要 :应用 CTAB法、改良 CTAB法、改良 CTAB2高盐沉淀法对毛竹基因组 DNA进行了提取 ,并用紫外分光光度计
(UV3300)、琼脂糖凝胶电泳和 PCR分析对提取的 DNA进行了检测 ,对 DNA的产量、质量、PCR效果等方面进行了
综合比较。结果表明 :改良 CTAB2高盐沉淀法是提取高质量毛竹基因组 DNA的较好方法。
关键词 :毛竹 ;基因组 DNA; CTAB法
中图分类号 : S795 文献标识码 : A
收稿日期 : 2005209221
基金项目 : 国际竹藤网络中心青年基金“花雄性不育突变体的鉴定及其调控基因的初步定位研究”、国家林业局 948项目 (200524238)
作者简介 : 高志民 (1971—) ,男 ,河北唐山人 ,博士 13 通讯作者
Extract Genom ic D NA from Phyllostachys edu lis by CTAB2Ba sed M ethod
GAO Zhi2m in1 , FAN Shao2hui, GAO jian1 , L I Xue2ping1 , CA I Chun2ju1 , PENG Zhen2hua2
(1. International Center for Bamboo and Rattan, SFA Key Laboratory on Bamboo and Rattan Science and Technology, Beijing　100102, China;
2. Research Institute of Forestry, CAF, Beijing　100091, China)
Abstract: CTAB method, imp roved CTAB method, imp roved CTAB 2high salt p recip itation method were used to ex2
tract genom ic DNA from the leaves of Ph. edu lis. The DNA samp les obtained were tested by UV spectrophotometer
3 300, agarose gel electrophoresis and PCR method. The differences in yield, quality and PCR result of the ob2
tained DNA were compared. The results revealed that imp roved CTAB 2high salt p recip itation method was an inex2
pensive and reliable method for the genom ic DNA extraction of Ph. edu lis.
Key words: Phy llostachys edu lis; Genom ic DNA; CTAB method
毛竹 ( Phyllostachys edu lis (Caar. ) H. de Lehaie)
隶属禾本科 ( Poaceae)、竹亚科 (Bambusoideae)、刚
竹属 ,是我国分布最广、面积最大、经济价值最高的
竹种之一 ,有着广泛的开发前景 ,急需对毛竹进行系
统的生物学研究。制备毛竹基因组 DNA是对毛竹
进行基因结构、功能研究、性状改良的重要步骤 ,然
而竹类植物材料中的蛋白质、多糖以及酚、脂类等次
生代谢物质给 DNA的提取和纯化造成很大的困难 ,
毛燕等 [ 1 ]对毛竹等 9种竹叶片的研究结果表明 ,竹
叶中蛋白质、多糖的含量较高 ,其中蛋白质的平均含
量为 131. 6 g·kg- 1 ,多糖的平均含量为 148. 9 g·
kg- 1。另外竹叶中还含有黄酮、多酚等次生物质 ,这
些物质都影响 DNA的提取质量 ,从而影响分子生物
学研究的进一步开展。
目前 , 植物基因组 DNA 的提取方法主要有
CTAB法和 SDS法。CTAB法最大的优点是能除去
多糖 ,主要用于草本植物和不含或少含酚类的植物
DNA的提取 [ 2 ] , SDS法可获得分子量较高的 DNA ,
但多糖类含量较多 [ 3 ]。用这些方法提取毛竹基因组
DNA比较难取得良好的效果。本研究通过对 CTAB
法及其改进方法提取基因组 DNA的比较 ,获得了毛
竹基因组 DNA的有效提取方法 ,为进一步开展毛竹
的分子生物学研究打下基础。
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
1　材料与方法
1. 1 D NA提取方法
1. 1. 1　CTAB沉淀法 [ 4 ] 　取 0. 1 g毛竹 (取自北京植
物园竹种园 )幼嫩叶片 ,将提取的 DNA溶解于 40μL
M illi - Q超纯水 (MQW )中 ,存于 - 20 ℃冰箱中备用。
1. 1. 2 改良 CTAB法 　提取液配制 : DNA提取液
( Tris2HCl pH8. 2)、细胞裂解液 (1 mol·L - 1 Tris2HCl
pH 7. 5, 0. 25 mol·L - 1 EDTA pH 8. 0, 5 mol·L - 1
NaCl, 2% CTAB )与 5% Sarkosyl按 5∶5∶2混合 ,在使
用前加入 Na2 S2O4至终浓度 0. 02 mol·L - 1。
①取 0. 1 g毛竹幼嫩叶片 ,于液氮中迅速研磨
成粉末 ,然后快速转移至 1. 5 mL离心管中 ,置于冰
中 ; ②加入 65 ℃预热的 DNA 提取液 650 μL,在
65 ℃水浴中保温 40～60 m in, 5 m in后轻摇 1次 ,之
后每隔 20 m in轻摇 1次 ; ③加入 650μL的氯仿 /异
戊醇 (24∶1) ,充分混匀 ,在室温下轻摇混均 ,然后以
13 000 r·m in - 1 ,离心 10 m in; ④吸出上清液放入新
的 1. 5 mL离心管中 ,重复步骤 ③,吸出上清液放入
新的 1. 5 mL 离心管中 ,加入 0. 6～110倍体积的
- 20 ℃预冷的异丙醇 ,轻轻摇匀并于 - 20 ℃冰箱中
放置 30 m in使 DNA充分沉淀 ; ⑤用离心机 ( Eppen2
dorf 5417C) 12 000 r·m in - 1离心 10 m in,弃上清液 ,
收集沉淀 ; ⑥用 1 mL 70%乙醇洗涤沉淀 , 12 000 r·
m in - 1离心 5 m in,弃上清液 ,在超净工作台风干 ,用
40μL MQW溶解 DNA,存于 - 20 ℃备用。
1. 1. 3 改良 CTAB2高盐沉淀法 　①～⑤同 1. 1. 2;
⑥用 1 mL 70%乙醇洗涤沉淀 , 12 000 r·m in - 1离心
5 m in,弃上清液 ,在超净工作台内风干 ,用 MQW 200
μL溶解 DNA; ⑦加入 200 μL 的 5 mol·L - 1的
NaCl,混均后加入 2倍体积的无水乙醇 , - 20 ℃冰
箱中沉淀 20 m in; ⑧13 000 r·m in - 1离心 10 m in,弃
上清液 ;加入 70%乙醇 1 mL洗涤沉淀 , 13 000 r·
m in - 1离心 5 m in,弃上清液 ,在超净工作台内风干 ,
用 40μL MQW溶解 DNA,存于 - 20 ℃备用。
1. 2　D NA的检测方法
11211　DNA浓度和纯度检测 　取 4μL DNA样品
用 MQW稀释 500倍 ,用紫外分光光度计 (UV3300)
测定波长在 230、260、280 nm 处的光吸收值 ,根据
260 nm 处的光吸收值计算 DNA 浓度 ,根据 260 /
280、260 /230值确定 DNA的纯度。
11212　DNA凝胶电泳检测　以λ噬菌体 DNA为标
记 ,取 DNA溶液 4μL,上样缓冲液 (含 0. 25%溴酚
蓝 , 40%蔗糖 ) 4μL,混匀 ,点入含 0. 5μg·mL - 1溴化
乙锭的 0. 8%琼脂糖凝胶中 ,用 1 ×TAE缓冲液电泳 ,
于凝胶成像系统 (A lpha2200)下观察 ,获取图象。
11213　PCR检测 　取 3种方法提取的总 DNA 1μg
作为模板 ,用拟南芥 (A rabidopsis tha liana L. )的 SNP
引物进行 PCR 扩增反应 ,正向引物 F24C202F: 5’2
GATTGATGCTCTTTGTCGTCC23’,反向引物 F24C202
R: 5’2CCAATTCTTCTTCTTCTCAGCC23’,预期大小
为 0. 6 kb左右。反应体系为 20μL,其中包括 : 10 ×
PCR Buffer 2μL, 10 mmol ·L - 1 dNTP 2μL, 5μmol
·L - 1正、反向引物各 2μL,模板 1μL, Taq酶 1μL,
用 MQW 补足体积至 20μL。 PCR反应在 PTC2200
型扩增仪中进行。反应程序为 95 ℃ 4 m in,然后 94
℃ 1 m in, 57 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 40个循环 , 72 ℃
10 m in。反应结束后 ,取 10μL扩增产物电泳检测。
2　结果与分析
2. 1　D NA的波长扫描结果
DNA在 260 nm处有特异的紫外吸收峰 ,且吸
收强度与系统中的 DNA浓度成正比 [ 5 ]。图 1显示
图 1　3种方法提取的毛竹基因组 DNA的波长扫描图
627
第 6期 高志民等 :基于 CTAB法提取毛竹基因组 DNA的探讨
用 3种方法提取的基因组 DNA都在紫外 257～260
nm处出现最高峰值 ,在 280 nm处光密度曲线呈下
降趋势 ,说明试验样品的最大吸收峰位于 260 nm处
附近 ,这也与核酸扫描曲线的要求相吻合 ; 但是
CTAB法和改良 CTAB法的最大吸光值的出现都略
微早于 260 nm,分别在 257、258 nm,说明了可能有
其它杂质的存在 ,而改良 CTAB 2高盐沉淀法的最大
吸光值恰好在 260 nm出现 ,从一定程度上说明了
DNA的纯度较高。
212　D NA的纯度与产量
DNA的纯度常用 OD260与 OD280的比值来判定。
当 OD260 /OD280 > 2. 0时表示有 RNA 污染 , OD260 /
OD280 < 1. 6 时表示有蛋白质污染 , OD260 /OD280为
116～2. 0时 ,表示提取的 DNA纯度较高 [ 6 ]。
从表 1可以看出 , CTAB法提取 DNA的 OD260 /
OD280的值为 1. 378 5～1. 657 1,表明提取的样品
DNA中蛋白质未除尽 ,且盐离子含量较高 ; OD260 /
OD230为 0. 856 1～1. 705 9,说明 DNA样品中所含的
酚类物质也比较多 ;每 0. 1 g毛竹幼嫩叶片可提取
200μg左右的 DNA。改良 CTAB 法提取 DNA 的
OD260 /OD280的值为 1. 603 4 ～1. 692 3,且 OD260 /
OD230为 1. 823 5～2. 315 8,表明提取的 DNA样品中
蛋白质和酚类的污染较少 ;每 0. 1 g毛竹幼嫩叶片
可提取约 100μgDNA。改良 CTAB 2高盐沉淀法提取
DNA的 OD260 /OD280的值一般为 1. 8～2. 0,表明提取
的样品 DNA中蛋白质和盐离子含量都较低 ; OD260 /
OD230 > 2,说明 DNA 样品中基本无酚类物质的污
染 ;每 0. 1 g毛竹幼嫩叶片可提取约 55μgDNA。
从表 1的数据来看 , DNA的产量以 CTAB法的
最高 ,改良 CTAB法次之 ,而改良 CTAB - 高盐沉淀
法则由于增加沉淀步骤而降低 ,但其 OD260 /OD280、
OD260 /OD230的值比较理想 ,因此 ,综合考虑 3种提取
方法的质量优劣顺序为 :改良 CTAB2高盐沉淀法 >
改良 CTAB法 > CTAB法。
表 1　3种方法提取的毛竹基因组 D NA紫外检测分析结果 (3次平均值 )
方法 样品号 OD230 OD260 OD280 OD260 /OD230 OD260 /OD280 DNA产量 / (μg·μL - 1 )
CTAB法 1 0. 135 0. 158 0. 105 1. 170 4 1. 504 8 3. 950
2 0. 102 0. 174 0. 105 1. 705 9 1. 657 1 4. 350
3 0. 285 0. 244 0. 177 0. 856 1 1. 378 5 6. 100
4 0. 199 0. 221 0. 148 1. 110 6 1. 493 2 5. 525
改良 CTAB法 1 0. 038 0. 088 0. 052 2. 315 8 1. 692 3 2. 200
2 0. 057 0. 108 0. 066 1. 894 7 1. 636 4 2. 700
3 0. 049 0. 098 0. 059 2. 000 0 1. 661 0 2. 450
4 0. 051 0. 093 0. 058 1. 823 5 1. 603 4 2. 325
改良 CTAB2高 1 0. 015 0. 050 0. 024 3. 333 3 2. 083 3 1. 250
盐沉淀法 2 0. 021 0. 054 0. 029 2. 571 4 1. 862 1 1. 350
3 0. 028 0. 071 0. 038 2. 535 7 1. 868 4 1. 775
4 0. 029 0. 057 0. 032 1. 965 5 1. 781 3 1. 425
2. 3 分子量检测
一般认为 , 10 kb以上的 DNA片段作为模板 ,基
本上就可符合 RAPD分析的要求 [ 7 ]。在图 2中可以
看出 3种提取方法所得到的毛竹基因组 DNA的大
小在 50 kb左右 ,但不同方法的电泳效果差异比较
明显。CTAB法提取的毛竹基因组 DNA的带型明显
不整齐 ,前后都有拖尾现象 ,点样孔颜色较深 ,且
RNA含量比较高 ,说明样品中蛋白、多糖等杂质的
含量比较高 ,从而影响电泳效果 ;而改良 CTAB法的
样品的点样孔较暗 ,而且带型也比较整齐 ,说明样品
中杂质较少。在改良 CTAB法的基础上再用高盐沉
图 2　3种方法提取的毛竹基因组 DNA的电泳图
1、2 CTAB法 ; 3、4改良 CTAB法 ;
5、6改良 CTAB2高盐沉淀法 ;M为λDNA
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
淀法沉淀 ,对提取毛竹基因组 DNA的效果较好 ,这
与前面紫外检测结果一致。
2. 4　PCR检测
把 3种方法提取的 DNA作为模板进行 PCR检
测 ,结果见图 3。CTAB法所得 DNA的 PCR反应与
改良 CTAB法和改良 CTAB2高盐沉淀法相比 ,效果
明显较差 ,而且在重复实验时发现 CTAB 法所得
DNA作为模板进行 PCR反应的稳定性也较差 ,这与
毛竹中的复杂内含物有关。正如其它研究报道所
述 ,影响 PCR扩增的 DNA杂质往往不是 RNA或蛋
白质这些大分子物质 ,而是多糖和酚类等小分子
物质 [ 8 ]。
图 3　用 3种方法提取的毛竹 DNA的扩增结果
1水对照　2、3 CTAB法　4、5改良 CTAB2高盐沉淀法 ;
6、7改良 CTAB法 ;M 分子量标记
3 讨论与小结
(1) 在毛竹基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳检
测中 ,本研究选用了λ噬菌体 DNA标记 ( TaKaRa产
品 ,货号为 D3010)为 48 502 bp,所以估计实验所得
毛竹基因组 DNA约为 50 kb,这与报道的采用 CTAB
法提取植物基因组 DNA约为 23 kb[ 9, 10 ]有较大的差
异。因此 ,采用 CTAB法提取毛竹基因组 DNA的大
小问题有待于进一步验证。
(2) 对 CTAB法、改良 CTAB法和改良 CTAB 2高
盐沉淀法提取的毛竹基因组 DNA产量、质量及 PCR
效果的比较结果表明 ,与 CTAB法相比 ,改良 CTAB
法和改良 CTAB 2高盐沉淀法均能够获得较高质量的
DNA ,同时具有比 CTAB法优越之处 :
1)在保证高质量的前提下 ,操作简单易行 ,可以
节省时间。常规的 CTAB 法中需要使用 β2巯基
乙醇 ,需要在通风橱中进行 ,不仅操作不便费时 ,而且
挥发气味不利于人体健康 ,而改良 CTAB法和改良
CTAB -高盐沉淀法避免了使用β2巯基乙醇 ,代之以
Na2 S2 O4、Na2 S2 O4溶解后形成 NaHSO3 ,作为还原剂
起到防止酚类氧化的作用 ,这有利于减少有害试剂
的污染。
2)试验成本降低。苯酚是很强的蛋白质变性
剂 ,而且具有很强的腐蚀性 ,在操作过程中需要戴手
套操作 ,而改良 CTAB法和改良 CTAB 2高盐沉淀法
中用氯仿 /异戊醇 (24∶1)来抽提 2次同样取得了良
好的效果 ,从一定程度上可以降低提取成本。
3)多糖常与 DNA同时沉淀并使沉淀物呈胶冻
状。CTAB 2高盐沉淀法是在 CTAB法的基础上 ,加入
NaCl使终浓度达到 2. 5 mol·L - 1 ,从而使 CTAB未
能去除的多糖保留在溶液中 ,达到去除多糖的目的。
总之 ,针对毛竹试验材料中富含蛋白、多糖、多
酚等物质的特殊性 ,其基因组 DNA的提取采用改良
CTAB法和改良 CTAB 2高盐沉淀法都能取得良好的
效果 ,在一般的 PCR反应中用改良 CTAB法提取的
DNA就可以满足要求 ,若需要高质量的 DNA 则可
以采用改良 CTAB法再加高盐沉淀法进行提取。
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