全 文 ：第 51 卷 第 5 期
2 0 1 5 年 5 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 5
May，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150508
收稿日期: 2014 － 09 － 06; 修回日期: 2014 － 11 － 13。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30671700) ; 安徽省教育厅自然科学研究一般项目(AQKJ2014B008) ; 安庆师范学院科研启动项目
(044 － K05000130030)。
* 池玉杰为通讯作者。
猴头菌 MnP1基因全长 cDNA克隆及生物信息学分析*
尹立伟1，2 池玉杰2
(1．安庆师范学院生命科学学院 安庆 246011; 2．东北林业大学林学院 哈尔滨 150040)
摘 要: 【目的】克隆猴头菌 CB1 锰过氧化物酶(MnP)基因，用于分析 He-mnp1 基因及蛋白序列、基因的结构与
功能，为研究猴头菌 MnPs 基因功能、转录调控和构建优良工程菌株提供参考。【方法】根据 GenBank 中已报道的
白腐菌 MnPs 基因 cDNA 序列的保守区域设计引物，采用简并 PCＲ、逆转录 ＲT-PCＲ、cDNA 末端的快速扩增(ＲACE)
等方法扩增出全长 cDNA 基因序列，命名为 He-mnp1(GenBank 登录号为 HM116841. 3)，并对其猴头菌 He-mnp1 基
因进行生物信息学的分析。通过 NCBI 数据库进行 BLAST 同源搜索; OＲF Finder 查找该基因的完整开放阅读框
(OＲF); 利用 Expasy 数据库和 BioEdit 软件预测 He-mnp1 蛋白质的理化特性及氨基酸的组成; 同时进行亲 /疏水性
及跨膜区的分析; 采用 SignalP 4. 1 软件进行蛋白信号肽的预测; 并利用 Clustal W 和 MEGA 5. 1 软件对 He-mnp1
蛋白序列同源性比对和构建白腐菌 MnPs 系统发育树; 利用数据库 Conserved Domain Database(CDD)蛋白保守结构
域的预测，查看 He-mnp1 血红素、基质及锰、钙等结合位点; 采用 PredictProtein 软件和 SWISS-MODEL 软件进行
He-mnp1蛋白二级结构的预测和同源三维建模。【结果】该基因 He-mnp1 的 cDNA 全长 1 279 bp，完整开放阅读框
1 080 bp，起始密码子 ATG，终止密码子 TAA，5端非翻译区有 68 个核苷酸，3端非翻译区有 131 个核苷酸，编码蛋
白 359 aa; 生物信息学分析表明，猴头菌 He-mnp1 氨基酸组成中丙氨酸含量最高，无酪氨酸，分子量为 38. 18 kDa，
等电点为 4. 35，He-mnp1 的蛋白有明显的亲水区，存在 81 － 105、121 － 141间有 2 处疏水区域，此蛋白为亲水蛋白。
He-mnp1 蛋白质多肽前体包含 1 个 18 aa 的信号肽及 1 个 5 aa 的中间前导短肽。【结论】蛋白系统进化分析表明
He-mnp1 分布在第 2 组群，与平菇侧耳、冬生多孔菌、变色栓菌的 MnPs 亲缘关系最为接近。He-mnp1 基因存在 1 个
保守结构域，分析显示为 Class Ⅱ类的真菌血红素过氧化物酶蛋白家族。He-mnp1 蛋白二级结构预测 α － 螺旋占
30. 99%，β －折叠占 3. 38%，无规则卷曲占 65. 63%，属于稳定蛋白。He-mnp1 蛋白三维建模，结果得到 1 个 Fe 血
红素，2 个 Ca2 +、1 个 Mn2 +的结合位点及组氨酸残基等。
关键词: 猴头菌; 锰过氧化物酶; 基因克隆; 生物信息学; 序列分析
中图分类号: S718. 81 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)05 － 0068 － 10
Cloning and Bioinformatics Analysis of MnP1 cDNA Gene from Hericium erinaceum
Yin Liwei1，2 Chi Yujie 2
(1 ． School of Life Science，Anqing Normal University Anqing 246011; 2 ． School of Forestry，Northeast Forestry University Harbin 150040)
Abstract: 【Objective】The cDNA gene sequences of Manganese peroxidase (MnP) were isolated from H． erinaceum
CB1，and used for analyzing structure and function of the He-mnp1 ．【Method】Degenerate primers were designed according
to conservative domain of white-rot fungi MnPs gene cDNA sequences reported in GenBank，the full-length cDNA gene
sequence was obtained by using the methods of PCＲ，Ｒeverse transcription-PCＲ and Ｒapid Amplification of cDNA Ends
(ＲACE) and named as He-mnp1(GenBank No． HM116841． 3)，and the bioinformatics of He-mnp1 gene were analyzed．
BLAST homology search was conducted through the NCBI database; OＲF Finder was used to look up the complete open
reading frame of the gene; The Expasy database and BioEdit software were used to predict physicochemical properties and
amino acid composition of He-mnp1 protein，and analyze the hydrophilicity / hydrophobicity and transmembrane region;
The SignalP 4． 1 software was used to predict protein signal peptide; The clustal W with MEGA 5． 1 software was adopted
to complete the He-mnp1 protein sequence homology alignment and to construct the phylogenetic trees of white rot fungi
MnPs，respectively． The CDD database was used to predict protein conserved domains，and check the He-mnp1 heme，
第 5 期 尹立伟等: 猴头菌 MnP1 基因全长 cDNA 克隆及生物信息学分析
substrate and manganese，calcium binding site etc． The PredictProtein software and SWISS-MODEL software were used to
complete the He-mnp1 protein secondary structure prediction and to construct homologous 3D modeling，respectively．
【Ｒesult】The full-length cDNA of He-mnp1 was 1 279 bp，the OＲF of 1 080 bp with starting codon of ATG and stopping
codon of TAA，including 5UTＲ of 68 bps and 3UTＲ of 131 bps and encoded 359 amino acids． Bioinformatics analysis
showed that the He-mnp1 protein has the highest content of Ala，without Tyr，and the Mw 38． 18 is kDa，with the pI of
4. 35． The He-nmp1 protein has an obvious hydrophilic region and two hydrophobic regions in the area of 81 － 105 and
121 － 141，and belongs to hydrophilic protein． He-mnp1 protein precursor polypeptides consists of a 18 aa signal peptide
and a 5 aa the intermediate leader peptide．【Conclusion】Protein phylogenetic analysis revealed that He-mnp1 is distributed
in Group II，and has closely evolutionary relationship to MnPs of Pleurotus ostreatus，Polyporus brumalis，and Trametes
versicolor． He-mnp1 has a conserved domain，and belongs to Class II fungal heme-dependent peroxidase superfamily，
predicting that the protein secondary structure accounts for α-helix of 30． 99%，β-sheet of 3． 38% and random coil of
65. 63%，and it is a stable protein． He-mnp1 protein 3D modeling showed that there are 1 Fe heme，2 Ca2 +，1 Mn2 +
binding sites and the histidine residues．
Key words: Hericium erinaceum; manganese peroxidase; genomic clone; bioinformatics analysis; sequence analysis
木质素降解酶在分解木质素的过程中，能够产
生一系列胞外氧化酶参与对木素大分子聚合物的最
初裂 解 反 应，其 中 锰 过 氧 化 物 酶 ( manganese
peroxidases /MnPs)、漆酶( laccases)和木质素过氧化
物酶( lignin peroxidases /LiPs)构成了木质素主要的
降解酶系统(Morgenstern et al．，2008)。这 3 种酶集
中分布在白腐菌中，木质素降解酶具有生物降解、纸
浆漂白、染料脱色(Muhammad et al．，2013)及污水
处理等功能，在日常生活中广泛开发和应用在化工
和造纸等工业生产中。木质素的降解主要依靠真菌
中分泌的木质素降解酶来完成，其中的锰过氧化物
酶(MnPs; EC1. 11. 1. 13)是一种依赖 H2O2 的亚铁
血红素糖蛋白酶，其分子由 10 条长的蛋白质单链和
1 条短的单链构成，含有一系列 Fe ( s) － 卟啉环
( IX)血红素辅基的同功酶，能够氧化分解芳香环多
聚体、断裂酚和非酚的木质素内部单元结构的 Cα －
Cβ键和醚键(Pribnow et al．，1989; Orth et al．，1994;
Phil et al．，2007)。GenBank 中有近 2 000 多条与
MnPs 相关的基因序列，多数来自真菌中的高等担子
菌，其中包括担子菌亚门层菌纲非褶菌目中的多孔
菌科( Polyporaceae)、猴头菌科(Hericiaceae)、灵芝
菌科(Ganodermataceae)、革菌科( Thelephoraceae)、
刺 革 菌 科 ( Hymenochaetaceae )、韧 革 菌 科
(Stereaceae)、伏革菌科(Corticiaceae)、粉孢革菌科
(Coniophoraceae)、齿菌科 (Hydnaceae)、珊瑚菌科
(Clavariaceae)和裂褶菌科( Schizophyllaceae)，还有
银耳目( Tremellales)、木耳目(Auriculariales)、花耳
目(Dacrymycetales)中的大部分种，伞菌目中的口蘑
科(Tricholomataceae)以及子囊菌亚门核菌纲球壳菌
目中的团炭角菌科 ( Xylariaceae ) 等 (池玉杰等，
2007)。国外已开展对 MnPs 基因的酶活特性、基因
结构(朱刚等，2013; Nagai et al．，2007)、转录表达
(Yeo et al．，2007; Janusza et al．，2012; Hirofumi et
al．，2013)、生物学功能与作用机制 ( Kum et al．，
2011)等研究，已日益受到木质素研究者的关注。
猴头菌(Hericium erinaceum)属于木材白腐菌，
多选择栎属(Quercus)树木作为寄主，寄生于木材腐
朽部分，以分解木材中的木质素而获得碳源、氮源、
矿质等营养，现广泛进行人工栽培。猴头菌的营养
功效、多糖提取物、抗病机制在医疗及工业领域上有
重要的经济价值。目前对白腐菌产生 MnPs 基因的
功能分析和开发利用的研究并不多，对猴头菌 MnPs
基因的克隆及序列分析尚无报道。本研究以猴头菌
为试验材料，克隆 MnPs 基因全长 cDNA 序列(命名
为 He-mnp1)，对 He-mnp1 基因及蛋白序列进行分
析，为今后研究猴头菌 MnPs 基因功能、转录调控和
构建优良工程菌株提供参考。
1 材料与方法
1. 1 菌种
猴头菌菌株 CB1(H． erinaceum CB1)源于长白
山，分离后保藏于东北林业大学森林保护学科森林
病虫病理实验室。此菌株 CB1 经分子生物学 ITS 鉴
定(GenBank 登录号为 GU584100)。
1. 2 试剂
大肠杆菌(Escherichia coli) Top10 感受态细胞
(TIANGEN); pMD 20 T Simple Vector ( TaKaＲa);
DNAquick － 快捷型植物基因组 DNA ( TIANGEN);
E． Z． N． A 真菌 ＲNA 提取试剂盒(OMEGA); 2 步法
ＲT-PCＲ 试剂盒 ( TaKaＲa); E． Z． N． A 凝胶回收试
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林 业 科 学 51 卷
剂盒(OMEGA); 质粒 DNA 小提试剂盒(OMEGA)。
1. 3 引物的设计
根据 GenBank 中已报道的 10 条白腐菌锰过氧
化物酶同源基因，包括变色栓菌(Trametes versicolor)
KN9522 ( cmp2 ) AY677129; 变 色 栓 菌 KN9522
( cmp3) AY677130; 偏肿革裥菌 ( Lenzites gibbosa)
CB － 1 ( mnp2 ) JQ388597; 平 菇 侧 耳 ( Pleurotus
ostreatus) ( mnp ) U21878; 平 菇 侧 耳 ( mnp3 )
AB011546; 弯 孢 拟 蜡 孔 菌 ( Ceriporiopsis
subvermispora) (mnp1) AF013257; C． subvermispora
(mnp4)AY217670; 黄孢原毛平革菌(Phanerochaete
chrysosporium) (MnP-1 ) M60672; 黄孢原毛平革菌
(mnp2 ) L29039; 原 毛 平 革 菌 属 的 P． sordida
(mnp3) AB078606。利用软件 ClustalX 2. 0 进行相
似序列比对，查找到核苷酸同源序列的保守区，根据
保守区序列设计上游引物为 5-SYNATGTNATH
TYCTCCNA-3，下游引物为 5-NANＲCNGCGＲAA
NCNGCT -3，进行简并 PCＲ 的扩增。
1. 4 猴头菌的总 ＲNA 和 DNA 的提取
收集猴头菌新鲜菌丝体，提取猴头菌总 ＲNA
(OMEGA 真菌提取试剂盒)和猴头菌基因组 DNA
(TIANGEN)，检验总 ＲNA 和 dsDNA 的质量 (完整
性)，其浓度可用变性琼脂糖凝胶电泳和核酸检测
仪测量分析 A260 /A280 及 A260 /A230 的比值，纯度
为 1. 8 ～ 2. 0。具体操作参照试剂盒说明书进行。
1. 5 猴头菌 MnP 的 cDNA 基因克隆
根据 MnP 基因的简并引物，以提取的猴头菌
DNA 为模板，PCＲ 扩增到 He-mnp1 的 DNA 片段。
MnP 基因 cDNA 片段利用 2 步法 ＲT-PCＲ 试剂盒
(TaKaＲa)，PrimeScriptTM ＲTase 酶和 Oligo dT 引物
(TaKaＲa 独自设计的 dT 区域)，以反转录反应液为
模板扩增体系如下: 10 × PCＲ Buffer 5 μL，dNTP
(2. 5 mmol·L － 1 )8 μL，简并引物(10 μmol·L － 1 )各
1 μL，rTaq DNA 聚合酶 ( 5 U·μL) 0. 5 μL，模板
1 μL，用 ddH2O 补足至 50 μL。扩增参数: 94 ℃
3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 个循
环，72 ℃ 10 min。猴头菌 MnP 基因的 5和 3末端
cDNA 序列，采用 ＲACE 克隆技术首先设计 5特异
性引物 GSP: 5-CGACGCAATTGGTTTCTCTCAG-3，
使用 SMAＲTerTM ＲACE cDNA 试剂盒快速扩增
(Clontech，USA); 然后设计 3端外侧特异性引物
GSP: 5-TTCCACGACGCAATTGGTTTC-3和 3端内
侧 特 异 性 引 物 NGSP: 5- CAGCATTCTTTCTC
GCTTCACT-3，使用 3-Full ＲACE 试剂盒(TaKaＲa)
扩增出 3末端 cDNA 序列。利用 ContigExpress 拼接
软件，重新设计 MnP 的 cDNA 基因的上游引物: 5-
ATGGCGTTCAAAACTTTCGCC-3; 下 游 引 物: 5-
TTAAGACGGGGGGACGGGG-3(下划线分别为起始
密码子和终止密码子)，最终 PCＲ 获得 He-mnp1 基
因的 cDNA 全长序列。
1. 6 猴头菌 MnP 的生物信息学分析
克隆获得猴头菌 He-mnp1 基因的全长 cDNA 序
列，通过 NCBI 数据库进行 BLAST 同源搜索，OＲF
Finder 查找该基因的完整开放阅读框( open reading
frame，OＲF)，分析起始密码子 ATG 和终止密码子
TAA 的正确位置。利用 Expasy 数据库和 BioEdit 软
件预测 He-mnp1 蛋白质的理化特性及氨基酸的组
成，同时进行亲 /疏水性及跨膜区的分析。采用
SignalP 4. 1 软件进行蛋白信号肽的预测，并利用
Clustal W 和 MEGA 5. 1 软件对 He-mnp1 蛋白序列
同源性比对和构建白腐菌 MnPs 系统发育树。利用
Conserved Domain Database(CDD)蛋白保守结构域
的预测，查看 He-mnp1 血红素、基质及锰、钙等结合
位点。采用 PredictProtein 软件和 SWISS-MODEL 软
件进行 He-mnp1 蛋白二级结构的预测和同源三维
建模(Canales et al．，1998)。
2 结果与分析
2. 1 猴头菌 He-mnp1 DNA 与 cDNA 基因片段的
扩增
同时以提取的猴头菌总 DNA 和总 ＲNA 为模
板，进行 PCＲ 扩增产物的验证，经 1. 0%的琼脂糖凝
胶电泳图谱，见图 1 中 CK 为空对照，1 － 2 泳道表明
猴头菌 He-mnp1 DNA 产物在 600 bp 左右有单一亮
带，经过回收 PCＲ 产物测序得到He-mnp1基因片段
573 bp; 3 － 4 泳道为He-mnp1 cDNA 产物在 400 bp
左右处有单一亮带，经过 ＲT-PCＲ 产物测序得到
He-mnp1 cDNA 基因片段 412 bp。同时将猴头菌
He-mnp1 DNA 和 cDNA 基因片段进行 BLAST 比对，
He-mnp1 2 条目的基因与其他白腐菌的 MnPs 基因
序列最大相似度为 72%，确定猴头菌 He-mnp1 为一
新的 MnP 基因。 He-mnp1 基因的 DNA 序列比
cDNA 序列长 161 bp，表明 DNA 水平上的 He-mnp1
含有一段内含子序列。
2. 2 猴头菌 He-mnp1 cDNA 全长序列的扩增
利用 ＲACE 试剂盒扩增 He-mnp1 3端和 5端
cDNA 目的片段，首先以反转录的 cDNA 为模板，3
端进行嵌套 PCＲ，外侧引物进行 PCＲ 验证，经 1. 0%
的琼脂糖凝胶电泳检测，结果未扩增出目的条带，见
图 2 中 1 － 2 泳道，可能是基因自身丰度较低，需要
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第 5 期 尹立伟等: 猴头菌 MnP1 基因全长 cDNA 克隆及生物信息学分析
图 1 猴头菌 He-mnp1 DNA 与 cDNA 基因片段
Fig． 1 He-mnp1 DNA and cDNA gene fragment from H． erinaceum
M: DNA 标记 2 000 bp DL 2 000 Marker; CK:空对照 Control;
1 － 2: He-mnp1 DNA 基因片段 He-mnp1 DNA gene fragment;
3 － 4: He-mnp1cDNA 基因片段 He-mnp1 cDNA gene fragment．
以第 1 次 PCＲ 产物为模板，利用内侧引物进行第 2
次 PCＲ 反应，见图 2 中 3 － 4 泳道，回收产物经测序
得到 3基因片段 410 bp，测序结果显示目的基因序
列之后有一段明显的 poly A 序列; 5 端采用
SMAＲT ＲACE 技术，利用特异引物进行 ＲT-PCＲ 扩
增得到 723 bp 目的条带，回收并验证结果见图 2 中
5 － 6 泳道。分别将序列进行 BLAST 比对，与其他
白腐菌的 MnPs 相似度各达 74% 和 62%。利用
ContigExpress 拼接软件，将 3端和 5 端及 cDNA 序
列对接，查找各特异性引物，最终 PCＲ 获得He-mnp1
的 cDNA 全长序列 1 080 bp，见图 2 中第 7 泳道; 同
时以猴头菌总 DNA 为模板，PCＲ 获得 He-mnp1 的
DNA 全长序列 1 647 bp 作为目的基因对照，见图 2
中第 8 泳道。在 NCBI 中 OＲF Finder 推导 He-mnp1
基因含有 1 条 1 080 bp 的完整 开放阅读框，
GenBank 注册新基因登录号为 HM116841，起始密码
子 ATG，终止密码子 TAA，5UTＲ 有 68 个核苷酸，
3UTＲ有 131 个核苷酸，共编码蛋白 359 aa。
图 2 He-mnp1 基因全长 cDNA 序列
Fig． 2 Full length cDNA products of He-mnp1
1 － 4: He-mnp1 3端片段 He-mnp1 3 terminal fragment; 5 － 6:
He-mnp1 5端片段 5 terminal fragment; 7 － 8: He-mnp1 的 cDNA
和 DNA 全 长 序 列 Full length cDNA and DNA products of
He-mnp1 ．
2. 3 猴头菌 He-mnp1 基因的生物信息学分析
2. 3. 1 猴头菌 He-mnp1 的氨基酸组成 一般生物
的蛋白质由 20 种基本氨基酸组合而成。使用
BioEdit 软件分析了猴头菌 He-mnp1 的 359 aa，其氨
基酸组成为: 丙氨酸(Ala)11. 98%、半胱氨酸(Cys)
2. 23%、天 冬 氨酸 ( Asp ) 7. 24%、谷 氨酸 ( Glu )
6. 13%、苯 丙 氨 酸 ( Phe ) 6. 96%、甘 氨 酸 ( Gly )
7. 52%、组 氨 酸 ( His ) 1. 95%、异 亮 氨 酸 ( Ile )
6. 41%、赖氨酸( Lys)1. 95%、亮氨酸( Leu)6. 69%、
蛋氨酸(Met)1. 67%、天冬酰胺(Asn)3. 9%、脯氨酸
(Pro)7. 52%、谷氨酰胺 (Gln)3. 9%、精氨酸 (Arg)
3. 61%、丝氨酸( Ser)5. 85%、苏氨酸( Thr)8. 64%、
缬氨酸(Val)5. 29%、色氨酸( Trp)0. 56%和酪氨酸
(Tyr) 0，其中丙氨 酸 ( Ala ) 含量最 高，酪 氨酸
(Tyr)无。
2. 3. 2 猴头菌 He-mnp1 蛋白质的的理化特性 利
用 Expasy 数据库中 protparam tool 和 Compute pI /
Mw tool 预测 He-mnp1 的分子质量约为 38. 18 kDa，
等电点(pI)为 4. 35，其中含有 48 个带负电荷的氨
基酸残基(ASP + Glu)和 20 个带正电荷的氨基酸
残基(Arg + Lys)。N － 末端含硫类的蛋氨酸 M
(MET)序列，在酵母和大肠杆菌中的半衰期分别大
于 10 和 20 h，不稳定指数达 52. 97，脂肪族氨基酸
指数较高，达到 78. 38，这是由于其中含有较多的
Gly(7. 5% )、Ala(12% )、Asp(7. 2% )、Phe(7. 0% )、
Pro(7. 5% )和 Thr(8. 6% )。
2. 3. 3 猴头菌 He-mnp1 信号肽的预测与蛋白序列
同源性比对 采用 SignalP 4. 1 Server 系统对猴头菌
He-mnp1 氨基酸序列的信号肽进行了预测，使用
Nature Methods 方法预测最可能的信号肽切割位点
位于 18 － 19 aa 之间: TNA-AI，He-mnp1 前 18 个氨
基 酸 残 基 为 信 号 肽 序 列 ( MAFKTFAAFIA
LWGVTNA)，He-mnp1 成 熟 蛋 白 N 末 端 序 列
(VACPDGVNT ATNA)。使用 Clustal W 在线软件对
5 种不同白腐真菌猴头菌、Heterobasidion irregulare、
变 色 栓 菌、地 中 海 嗜 蓝 孢 孔 菌 ( Fomitiporia
mediterranea)、平菇侧耳的 MnPs 同工酶基因进行同
源蛋白多序列比对，比对结果显示了成熟蛋白 (用
虚线框隔开)、保守氨基酸残基及半胱氨酸等信息，
图中名称均为缩写(例如:变色栓菌的 MnP 基因缩
写为 Tv-mnp)，结果见图 3。
2. 3. 4 猴头菌 He-mnp1 蛋白系统发育树的构建
在 NCBI 数据库中进行 BLAST 序列比对，将克隆的
He-mnp1 全长 cDNA 序列翻译成含有 359 aa，tblastn
结果未搜索到相似度为 100% 的基因序列，确定猴
头菌 He-mnp1 为新基因序列，GenBank 注册新基因
登录号为 HM116841。在 190 株菌种中选择 10 株白
腐菌与猴头菌 He-mnp1 进行同源性分析，采用
MEGA 5. 1 软件 Neighbor-Joining 法并构建 He-mnp1
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林 业 科 学 51 卷
图 3 He-mnp1 与同源蛋白的多重比对
Fig． 3 Multiple alignment of homologous protein and He-mnp1
* :保守的氨基酸残基 The conserved residues; □:保守的 Mn2 + 结合结构域 The conserved Mn2 + binding domain;↓:使 Mn2 + 氧化的锰结合
位点 The Mn-binding site enabling oxidation of Mn2 + ; ◆ :参与芳香族底物的氧化残基 Ｒesidues that are involved in oxidation of aromatic
substrates; ▲:保守半胱氨酸 The conserved cysteine residues; ◇ :催化作用中必不可少的 2 个组氨酸(H) The two histidines(H) that are
essential for catalysis．
蛋白系统进化树。结果表明黄孢原毛平革菌编码蛋
白 mnp1， mnp2， mnp3 ( AAA33744， AAA33745，
AAB39652)，弯孢拟蜡孔菌编码序列 mnp1 和 mnp2
(AAC05222 和 AAB92247 )，地中海嗜蓝孢孔菌
mnp1 和 mnp2(ADK60889 和 ADK60890)，包括在第
1 组群(Group I)，它们都是由 5 个二硫键的 10 半胱
氨酸组成的 MnPs。而猴头菌 CB1 编码蛋白 He-
mnp1(ADK26471)(图 4 中左箭头所示)，平菇侧耳
mnp3(BAA33449)，冬生多孔菌(Polyporus brumalis)
mnp1(HQ910417)和变色栓菌 KN9522 编码 cmp2
序列 (AAT90349)，包括在第 2 组群 (GroupⅡ)，它
们都是由 4 个二硫键的 8 半胱氨酸组成的 MnPs。
另外，选择 2 株变色栓菌木质素过氧化物酶基因编
码序列 LiP1 和 LiP2 ( CAA53334，CAA53333) 作为
外源群组，包括在第 3 组群(Group Ⅲ)。系统发育
分析表明第 1 组群、第 2 组群和第 3 组群之间有较
为清晰的界限。猴头菌 He-mnp1 与平菇侧耳、冬生
多孔菌、变色栓菌的 MnPs 基因遗传距离较近、同源
27
第 5 期 尹立伟等: 猴头菌 MnP1 基因全长 cDNA 克隆及生物信息学分析
性最高，而与黄孢原毛平革菌、弯孢拟蜡孔菌和地中
海嗜蓝孢孔菌 MnPs 基因遗传距离较远，从系统进
化树中也可看出同一物种的 MnPs 基因同工酶之间
在遗传距离上会较近(图 4)。
图 4 He-mnp1 的蛋白系统发育树分析
Fig． 4 Protein phylogenetic tree analysis of He-mnp1
2. 3. 5 猴头菌 He-mnp1 氨基酸的亲 /疏水性及跨
膜区分析 通过 ExPASy 蛋白预测专家系统中
Protscale 软件采用 Kyte ＆ Doolittle 方法分析猴头菌
He-mnp1 蛋白序列的亲 /疏水性及蛋白跨膜区，结果
显示 He-mnp1 的蛋白有明显的亲水区，仅存在 81 －
105、121 － 141 间有 2 处疏水区域，见图 5( a)。与利
用 TMpred 在线工具分析 He-mnp1 蛋白跨膜区，疏
水性分析结果一致，见图 5(b)跨膜蛋白的拓扑结构
模型的预测参数 TM-helix 螺旋长度都在 17 ～ 33 之
间，结果 He-mnp1 由内向外存在 3 处跨膜核心区，
内侧在 1 － 21(21)→1671 +、85 － 109(25)→749 +
+、125 － 145(21)→551 +，以 749 + + 为强烈的跨
膜取向。由外向内存在 4 处跨膜核心区，1 － 21
(21)→1421、24 － 44(21)→157 + +、85 － 103 (19)
→455，130 － 152(23)→462，N 末端外存在最优的跨
膜拓扑结构模型，2 处强烈的跨膜螺旋位点分别为
1 － 21(21)→1421 和 85 － 109 (25)→749。蛋白的
开始区域有较强的疏水性，可能与分泌蛋白的信号
肽性质相关，此蛋白平均亲水指数为 － 0. 042，是一
个亲水蛋白。
2. 3. 6 猴头菌 He-mnp1 蛋白保护结构域预测 首
先根据 NCBI 数据库的 Conserved Domain Database
(CDD)预测到 He-mnp1 基因存在一个保守结构域，
并对其酶的作用物或抑制剂的结合位点、血红素结
合位点、基质结合位点、锰结合位点、钙结合位点做
了预测(Ｒuiz-Dueйas et al．，2009)。保守结构域分
析显示 He-mnp1 为特定群体 － 真菌木质素降解酶，
属 Class Ⅱ类的真菌血红素过氧化物酶蛋白家族
(Morgenstern et al．，2010)。此家族成员共享一个血
红素辅基和催化多元氧化反应，以过氧化氢为电子
受体。Class Ⅱ类过氧化物酶是真菌糖蛋白，与木质
素氧化分解相关，含有多处血红素结合位点、3 个基
质结合位点、3 个 Mn2 + 结合位点和 2 处保守的
Ca2 + 结合域 (图 6 ) ( Sundaramoorthy et al．，1994;
2005; Blodig et al．，2001)。
2. 3. 7 猴头菌 He-mnp1 蛋白二级结构预测 使用
PＲEDATOＲ 在线软件预测 He-mnp1 蛋白二级结构
中 α －螺旋(Alpha helix，Hh)的氨基酸有 110 个，所
占比例为 30. 99% ;β －折叠(Extended strand，Ee)氨
基酸有 12 个，占 3. 38% ;无规则卷曲(Ｒandom coil，
Cc)的氨基酸有 233 个，占 65. 63%。由图 7 可见，
He-mnp1 蛋白以 α －螺旋(蓝色)和无规则卷曲(紫
色)为主，β － 折叠 (红色)所占比率最低，验证了
He-mnp1 蛋白二级结构属于稳定蛋白。
2. 3. 8 猴头菌 He-mnp1 蛋白三维结构建模 使用
SWISS-MODEL 的 Cn3D 软件预测工具构建猴头菌
He-mnp1 蛋白三维结构模型，结构模型有不同的结
构形式，其中有螺纹模型、线性模型、球棍模型及空
37
林 业 科 学 51 卷
图 5 He-mnp1 亲 /疏水性( a)和 跨膜区(b)
Fig． 5 Hydrophilicity /Hydrophobicity ( a) and transmembrane region ( b) of He-mnp1
图 6 He-mnp1 蛋白保守结构域
Fig． 6 Conserved domain of He-mnp1
间结构模型，见图 8 为 He-mnp1 蛋白三维螺纹模
型。将 He-mnp1 成熟蛋白序列通过 VAST Search 比
对后，将结果输入 Cn3D 软件进行功能位点模拟，结
果显示从 He-mnp1 蛋白三维结构模型中得到 1 个
47
第 5 期 尹立伟等: 猴头菌 MnP1 基因全长 cDNA 克隆及生物信息学分析
图 7 He-mnp1 蛋白二级结构预测
Fig． 7 The secondary structure prediction of He-mnp1
Fe 血红素，2 个 Ca2 +、1 个 Mn2 +的结合位点及组氨
酸残基等。
图 8 He-mnp1 三维结构模型的构建
Fig． 8 The construction of the three-dimensional
structure model of He-mnp1
3 结论与讨论
我国林区、贮木及建材腐朽或材质降低，牵涉到
胞外大分子氧化降解和胞内小分子分解代谢(严东
辉等，2003; 戴玉成等，2008; 曾祥谓等，2008)，在
真菌分泌降解木质素的非特异性胞外氧化还原酶
中，MnPs 基因起着至关重要的作用。其白腐菌的分
子特征和转录调控已在逐步开展研究(Manubens et
al．，2003; Johansson et al．，2002; Ｒyu et al．，2014)，
发现一些白腐菌［黄孢原毛平革菌、弯孢拟蜡孔菌、
地中海嗜蓝孢孔菌、射脉菌(Phlebia radiata)等］存
在多个 MnPs 同工酶基因，它们受不同的诱导条件，
如氮源、温度、pH 值(Kazumichi et al．，2013)、吐温
80、热稳定性、血红素、静置与振荡、Mn2 + 浓度
(Mancilla et al．，2010; Sangcheol et al．，2004)等影
响，而猴头菌 He-MnPs 同工酶基因仍需进一步研
究。本文所克隆的猴头菌 He-mnp1 基因全长 cDNA
序列登录号(HM116841. 3)，在 2010 年提交序列之
后又经过 2 次更新，He-mnp1 全长 cDNA 序列共
1 279 bp，含有 1 条 1 080 bp 的完整开放阅读框，
DNA 测序获得1 647 bp，与 He-mnp1 的 cDNA 全长
序列相对比，具有 10 条内含子，内含子平均长度为
51 ～ 62 bp; 11 条外显子，平均长度为 13 ～ 208 bp，
并翻译成 359 aa。
通过 Signal 软件预测信号肽，发现 He-mnp1 蛋
白质多肽前体包含 1 个 18 aa 的信号肽及 1 个 5 aa
的中间前导短肽，这样 He-mnp1 成熟蛋白编码序列
为 336 aa;利用 Clustal W 软件进行同源 MnPs 蛋白
多重比对，结果表明白腐菌 MnPs 序列之间存在一
些相似性及保守区域，具体分析成熟蛋白与芳香结
合位点于 143 － 146 之间( I － P － E － P)，在催化作
用中必不可少的 2 个组氨酸分别为 H 48 远端组氨
酸和 H 174 近端组氨酸，精氨酸残基位于 Ｒ 44，构
成 4 个二硫键的 8 半胱氨酸残基分别位于 C 26:
C 38，C 39: C 58，C 143: C 271 和 C 307: C 336。
从 He-mnp1 氨基酸组成结构来看，白腐菌 MnPs 基
因的催化机制、晶体结构和功能位点与相关的氨基
酸残基都是相对保守的。并构建了白腐菌 MnPs 蛋
白系统进化树，He-mnp1 与平菇侧耳 mnp2、冬生多
孔菌 mnp1 和变色栓菌 cmp2 的亲缘关系最为接近。
通常白腐菌同一物种的 MnPs 基因同工酶会聚类在
一起，除非同一物种中含有 4 个或 5 个二硫键的组
成不 同，MnPs 基 因 就 会 分 配 在 不 同 的 组 群
(Groups)。Hildén 等 ( 2005 ) 对射脉菌的 Pr-MnP2
和 Pr-MnP3 基因进行了系统发育和结构分析，研究
结果显示，Pr-MnP2 含有 10 个半胱氨酸，而 Pr-MnP3
57
林 业 科 学 51 卷
含有 8 个半胱氨酸，它们在进化树的位置就会出现
不同(Hildén et al．，2005; Hakala et al．，2006)。白
腐菌中这种二硫键频繁出现在胞外蛋白中，把不同
的肽链连接在一起形成稳定的蛋白质三维结构，使
蛋白质分子不易被降解，可提高锰过氧化酶的活力
和热稳定性。另外选择 2 株变色栓菌木质素过氧化
物酶基因 LiP1 和 LiP2 作为外源群组，2 条 LiPs 基
因在遗传相似系数上极为接近，虽与 MnPs 基因同
属木质素降解酶基因，但在遗传距离上变色栓菌
LiPs 基因与第 1、第 2 组群有较为清晰的界限。
根据 CDD 数据库预测 He-mnp1 蛋白存在一个
保守结构域，该成熟蛋白保守结构域与同源蛋白多
序列比对分析发现，结构域中有多处血红素结合位
点; 基质结合位点分别位于 Ｒ 44，F 47，H 48; 构
成 Mn2 + 结合有 2 处保守结构域(37 － 40 和 174 －
187)，其中 He-mnp1 蛋白配体的 Mn2 + 结合位点分
别位于 E 37，E 41，D 174; 2 处保守的 Ca2 +结合域，
其中 4 个与近侧末端的 Ca 连接氨基酸结合位点分
别位于(D49，G 65，D 67，S 69)和 5 个远侧 Ca 结
合位点分别位于 ( T 175，D 192，T 194，I 197，
D 199)。以上说明，He-mnp1 的蛋白结构域中有多
处结合位点，包括血红素、Mn2 +、Ca2 + 和基质的存
在，推测猴头菌可能存在多条 MnPs 同工酶基因，且
参与猴头菌 He-mnps 基因的转录水平，调控着锰过
氧化物酶表达量的高低。同源蛋白多序列的比对结
果显著地提高了 He-mnp1 蛋白二级结构预测的精
确度，此蛋白二级结构中存在 α － 螺旋、β － 折叠和
一些无规则卷曲，He-mnp1 属于稳定蛋白。与此同
时，通过 SWISS-MODEL 同源建模法构建了He-mnp1
成熟蛋白三维结构螺纹模型，结果该功能蛋白所结
合的主要位点区域，显示有 1 个 Fe 血红素、2 个
Ca2 +、1 个 Mn2 +离子的结合，一些组氨酸残基以及
肽链向外突出的缠绕等。该 He-mnp1 蛋白三维结
构与解析的 MnPs 蛋白空间特征基本吻合，这些生
物信息为 He-mnp1 蛋白的功能预测及认识其 MnPs
基因的转录表达提供初步参考。
通过 Protscale 软件分析猴头菌 He-mnp1 蛋白
序列的亲 /疏水性及蛋白跨膜区，结果显示 He-mnp1
是一 个 亲 水 蛋 白，平 均 亲 水 指 数 为 － 0. 042，
He-mnp1由内向外存在 3 处跨膜核心区，跨膜片段
含有多处的疏水残基，但 He-mnp1 拓扑结构分析结
果还需要进一步验证。通过分析其理化特性、功能
位点、亲 /疏水性及蛋白跨膜区、蛋白结构等，利用多
种生物信息学软件进行猴头菌 He-mnp1 蛋白的预
测，可知 He-mnp1 蛋白具有白腐真菌 MnPs 基因典
型的保守结构域和同源性，表明所克隆的猴头菌
He-mnp1 是高等真菌 MnPs 基因家族的新成员，属
Class Ⅱ类的真菌血红素过氧化物酶蛋白家族，可为
猴头菌筛选 MnPs 基因工程菌株提供基础信息，但
对基因功能的改造有待深入研究。目前本研究小组
已针对大肠杆菌、毕赤酵母(Pichia pastoris)和构巢
曲霉(Aspergillus nidulans)等生物系统开展 MnPs 基
因转录与异源表达研究，并将深入研究主要的功能
蛋白。
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(责任编辑 朱乾坤)
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