全 文 ：　　1997—12—20收稿。
徐福元副研究员,葛明宏(江苏省林业科学研究所　南京　211153) ;赵振东( 中国林业科学研究院林产化学工业研究
所) ;朱克恭(南京林业大学)。
* 1997～1999年国家自然科学基金资助项目“抗松材线虫病马尾松种源的化学组成及抗性机理研究”的部分内容。孙
震(中国林科院林化所) ,张培(江苏省林科所)参加了部分工作。
马尾松不同种源氨基酸含量与
抗松材线虫病的关系*
徐福元　葛明宏　赵振东　朱克恭
　　摘要　在选出和验证抗病马尾松种源的基础上,研究了马尾松不同抗病性种源的树体内氨基
酸含量的差异。结果表明, 抗病种源在接种松材线虫前后均比较感种源含有较少的组氨酸、苏氨酸、
甘氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等 9 种游离氨基酸。它们与感病指数
均呈正相关, 这说明游离氨基酸含量低的马尾松种源抗松材线虫病。11 种固态氨基酸的含量与感
病指数有负相关性, 说明其含量较高的种源具较强抗病性能。
关键词　马尾松种源　氨基酸　松材线虫病　抗病因子
　　据报道植物体内的氨基酸含量与植物抗病虫害性能有关,例如,天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨
酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和蔗糖均具有刺激害虫吸食的作用 [ 1] , 是抗虫水稻品种
引起褐飞虱拒食的原因之一 [ 2]。在有关松材线虫病( Bursap helenchus xy lophilus ( Steiner &
Buhrer) N ickle)的研究方面,已从 40个马尾松种源中筛选出 3个抗病种源(广西 2号、广西 3
号和广东 5号)。鉴于松材线虫入侵松树的木质部树脂道内, 线虫危害的生活周期有 2种方式,
在入侵到树死亡期间取食植物细胞(薄壁细胞) ,树死之后,腐生生物进入死树, 有细菌、真菌、
非致病线虫和昆虫,松材线虫以取食真菌来维持其种群一年有余[ 3]。树体内营养成份的高低直
接影响松材线虫的取食、生长发育和繁殖。本文选择有代表性的抗病种源广西 2号、中抗种源
四川 2号、敏感种源陕西 1号及敏感松种黑松(对照) ,分别对接种松材线虫前后的营养成份游
离氨基酸、固态氨基酸含量与抗(感)病指数的关系进行了研究,以期发现鉴定抗病种源的简单
方法。
1　材料与方法
1. 1　供试松种
从本所 40个马尾松种源基因库选出的抗病种源广西 2号( H )、中抗种源四川 2号( M )、
敏感种源陕西 1号( L )和敏感松种黑松( S)。
1. 2　接种线虫来源和方法
林业科学研究　1998, 11( 3) : 313～318
Forest Resear ch 　　 　　　
松材线虫系从近期死亡的病死木分离而得,并经 PDA 灰葡萄孢( Botryt is cinerea)平板培
养繁殖。接种采用“树干打孔法”,接种线虫量为 5 000条/株。
1. 3　发病症状进程观察标准
按徐福元 [ 4]的分极标准进行。
1. 4　采样及氨基酸的分析方法
1. 4. 1　采样　分别在接种线虫前一周( H10、M10、L10和 S10)、接种线虫后一周( H11、M11、
L11和 S11)和接种线虫后一月( H12、M12、L12和 S12)各采集 3株松树,每株采侧枝样各 500
g ,供试验分析。
1. 4. 2　分析仪器　用日立 835-50氨基酸分析仪测定氨基酸成份组成和含量。
1. 4. 3　分析步骤
( 1)游离氨基酸的提取(乙醇提取法) :选取木材鲜样 5 g 切碎后,分别用 20 mL 75%乙醇
于沸水浴中回流提取 3次并过滤,滤液合并后蒸去乙醇。加 15 mL 乙醚充分萃取除去脂溶性
成分, 水层以旋转蒸发器蒸发至干。干燥样品加0. 02 mol / L HCl定容,并在10 000 r / min下离
心 20 min,取上清液上机测定。
( 2)固态氨基酸的提取(盐酸水解法) : 取 50～100 mg 绝干试料于水解管中,加 10 mL 6
mol / L HCl ,并将水解管与真空泵相连, 抽至基本无气泡止,在真空管下用喷灯封管, 并置于
110±1 ℃烘箱内水解 24 h。打开水解管,过滤后定容。吸取1 mL 至小烧杯中减压蒸干后,加
入 1 mL 去离子水离心,取上清液上机测定。
　　　
2　结果与分析
2. 1　马尾松不同种源的抗病性验证
从 1996年选出的 3个抗病种源、11个中等抗病种源、18个低抗种源和 8个敏感种源中选
出 3种有代表性的抗病类型,它们是
抗病种源广西 2号、
中抗种源四川 2号和
敏感种源
陕西 1号及敏感松种黑松作对照,经 1997年 6月 8日的接种试验,进行抗病性验证。经观察,
广西 2号、四川 2号、陕西 1号和黑松的感病指数 IP 分别为 0、40. 0、60. 0和 100. 0,其抗病指
数 I R 相反(表 1)。种源对松材线虫病的抗感病进程观察,抗病种源广西 2号( H)的抗病性稳
定,其它四川 2号( M )、陕西 1号( L )和黑松( S)的抗病指数下降明显,并存在很大差异(图 1)。
抗病验证说明被选出抗病种源的可靠性和稳定性,其它 2个抗病种源( GX3和 GD5)也有同样
结果,其抗病指数为 100. 0。
表 1　不同种源对松材线虫病感病症状观察
种　　源 抗病评价 株　数 感病指数 I P 抗病指数 I R
广西 2号 抗病种源( H) 4 0　 ( c C) 100. 0 ( a A)
四川 2号 中抗种源( M ) 4 40. 0 ( b B) 60. 0 ( a AB)
陕西 1号 敏感种源( L) 4 60. 0 ( a AB) 40. 0 ( b B)
黑松(对照) 敏感松种( S) 4 100. 0 ( a A) 0　 ( c C)
　　注: IP 和 IR 后具不同小写字母者方差分析差异显著,具不同大写字母者差异极显著。
314　　　　　　　　　　　　　　　　林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　11卷
图 1　马尾松不同种源对松材线虫病的抗性进程差异
2. 2　不同抗病性种源蛋白含量与感病性的关
系
分析了抗病种源( H)、中抗种源( M )、敏感
种源( L )和敏感松种黑松( S)的固态氨基酸、游
离氨基酸和粗蛋白 [ 5] (以固态与游离氨基酸之
差表示)的含量及 3次采样测定的蛋白的平均
含量与对松材线虫病的感病指数进行相关性
分析发现:固态氨基酸与种源对松材线虫病的
感病指数有较密切的相关关系,它们的相关系
数 r (固态氨基酸) = - 0. 780 6(表 2) ,说明固
态氨基酸含量高的种源抗松材线虫病。
表 2　马尾松不同种源的蛋白质含量与感病性的关系
测定对象(种源) 采样次数 固态氨基酸( g/ k g) 游离氨基酸( g/ kg) 粗蛋白( g/ k g)
抗　病( H) 3 12. 056 4 3. 534 5 8. 521 9
中　抗( M ) 3 11. 723 5 4. 451 6 7. 271 9
低　抗( L) 3 11. 567 4 3. 184 7 8. 382 7
对照黑松( S ) 3 8. 856 4 4. 086 8 4. 769 6
相关系数 r - 0. 780 6 0. 328 4 - 0. 786 6
2. 3　不同抗病性种源氨基酸含量与感病性的关系
本试验对不同抗病种源的松材线虫病感病指数与不同时间采样(接种线虫前一周、后一
周、后四周和平均)样本的游离和固态氨基酸进行了相关分析(表 3、4) ,比较了差异显著性, 并
评价了它们的抗性程度。
表 3　不同抗病种源游离氨基酸含量与感病指数的相关分析
氨 基酸 种 类 相 关 系数 ( r)
中　名 英　名 接种前一周 接种后一周 接种后四周 平　均
天门冬氨酸 Asp - 0. 375 1 - 0. 429 4 - 0. 385 1 - 0. 497 5
苏氨酸 Th re 0. 856 5 0. 898 8 0. 534 5 0. 830 5
丝氨酸 Ser 0. 018 2 0. 116 2 - 0. 587 2 0. 002 5
谷氨酸 Glu - 0. 692 0 0. 817 9 - 0. 817 2 - 0. 895 1
脯氨酸 Pro - 0. 102 9 0. 401 7 - 0. 249 0 - 0. 153 4
甘氨酸 Gly - 0. 346 2 0. 527 7 0. 896 8 0. 825 8
丙氨酸 Ala 0. 016 5 - 0. 526 3 - 0. 774 4 - 0. 554 6
胱氨酸 Cys 0. 054 1 0. 373 5 0. 891 6 0. 531 7
缬氨酸 Val - 0. 446 6 0. 076 6 0. 082 5 - 0. 416 6
甲硫氨酸 Meth 0. 141 1 0. 859 8 0. 681 5 0. 529 7
异亮氨酸 Ile - 0. 167 5 0. 265 9 0. 994 7 0. 955 6
亮氨酸 Leu - 0. 301 3 0. 123 4 0. 959 4 0. 528 1
酪氨酸 Tyr - 0. 663 1 0. 399 2 0. 768 2 0. 537 3
苯丙氨酸 Pheny - 0. 305 8 0. 111 1 0. 063 3 0. 063 2
赖氨酸 Lys - 0. 421 8 - 0. 072 3 0. 540 7 - 0. 353 7
组氨酸 His 0. 891 6 0. 891 6 0. 891 6 0. 891 6
色氨酸 Try 0. 748 5 0. 075 3 - 0. 320 5 0. 639 8
精氨酸 Ar g 0. 790 5 0. 083 8 0. 485 6 0. 361 7
总　和 T otal 0. 205 6 0. 457 3 0. 289 7 0. 328 4
3153期　　　　　　　　　徐福元等: 马尾松不同种源氨基酸含量与抗松材线虫病的关系　　　　　　　　
2. 3. 1　游离氨基酸含量与感病指数的关系　游离氨基酸含量与感病指数呈正相关(表 3)。表
明抗病种源、比较敏感种源游离氨基酸的含量较低, 即抗病种源感病指数随着游离氨基酸的含
量降低而降低, 有较明显相关趋势的为组氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、
亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等 9种游离氨基酸。其中以不同采样期中的组氨酸和苏氨酸与不同抗
病种源的感病指数相关显著的频次最多,而相关性最密切的为异亮氨酸和亮氨酸,相关系数分
别为 r= 0. 994 7和 r= 0. 959 4。另外,也有谷氨酸和丙氨酸含量与感病指数呈负相关的,其它
氨基酸的相关性均不明显。
2. 3. 2　固态氨基酸含量与感病指数的关系
( 1)固态氨基酸含量与感病指数呈负相关, 说明抗病种源的固态氨基酸含量较高,相关趋
势较明显的有异亮氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨
酸、酪氨酸和苯丙氨酸等 11种固态氨基酸(表 4)。
表 4　不同抗病种源固态氨基酸含量与感病指数的相关分析
氨 基酸 种 类 相 关系 数 r
中　名 英　名 接种前一周 接种后一周 接种后四周 平　均
天门冬氨酸 Asp - 0. 713 4 - 0. 326 7 - 0. 653 1 - 0. 828 6
苏氨酸 Th re - 0. 646 0 - 0. 390 6 - 0. 503 0 - 0. 590 7
丝氨酸 Ser - 0. 665 2 - 0. 382 2 - 0. 392 0 - 0. 781 5
谷氨酸 Glu - 0. 525 5 - 0. 372 4 - 0. 679 3 - 0. 619 3
脯氨酸 Pro - 0. 675 8 - 0. 984 4 - 0. 311 6 - 0. 527 1
甘氨酸 Gly - 0. 786 9 - 0. 339 9 - 0. 317 8 - 0. 403 0
丙氨酸 Ala - 0. 800 1 - 0. 366 4 - 0. 297 8 - 0. 625 1
胱氨酸 Cys - 0. 121 0 - 0. 045 8 0. 891 6 0. 378 8
缬氨酸 Val 0. 604 9 - 0. 277 6 - 0. 749 0 - 0. 669 1
甲硫氨酸 Meth - 0. 542 7 - 0. 262 3 - 0. 018 0 - 0. 395 2
异亮氨酸 Ile - 0. 720 3 - 0. 451 7 - 0. 749 7 - 0. 872 5
亮氨酸 Leu - 0. 647 3 - 0. 267 1 - 0. 679 2 - 0. 687 8
酪氨酸 Tyr - 0. 481 3 - 0. 473 6 - 0. 578 8 - 0. 857 7
苯丙氨酸 Pheny 0. 120 1 0. 018 2 - 0. 691 9 - 0. 372 2
赖氨酸 Lys - 0. 804 9 - 0. 307 7 - 0. 672 0 - 0. 639 1
组氨酸 His - 0. 762 6 - 0. 340 5 - 0. 701 6 - 0. 668 2
色氨酸 Try 0 0 0 0
精氨酸 Ar g - 0. 496 3 - 0. 098 7 - 0. 622 9 - 0. 471 8
总　和 T otal 0. 648 0 - 0. 383 3 - 0. 780 6 0. 691 5
( 2)固态氨基酸含量与感病指数呈正相关的仅胱氨酸一种, 有较明显的相关趋势, r =
0. 891 6。这一特殊现象有待进一步研究。
3　讨　论
　　( 1)从 40个马尾松种源中选出的有代表性的抗病种源广西 2号、中抗种源四川 2号和敏
感种源陕西 1号及敏感松种黑松(对照) ,经接种后的抗病验证,其感病进程和感病指数仍保持
原有抗病水平,没有产生变异,说明抗病种源的抗病性较为稳定。
316　　　　　　　　　　　　　　　　林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　11卷
( 2)接种松材线虫后的马尾松不同抗病性种源的游离氨基酸中,其游离氨基酸含量与感病
指数存在明显正相关趋势的有组氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、
酪氨酸和精氨酸等9种。根据 Sogaw a[ 1]、王荫长 [ 6]、李盾[ 7]和张增全 [ 8]等的研究,叶鞘中数种游
离氨基酸含量较少的水稻品种能抗褐稻飞虱。葛振华等 [ 9]认为游离氨基酸总量以及其中的异
亮氨酸、赖氨酸和丙氨酸含量较少的马尾松种源抗日本松干蚧。李盾[ 7]和李国清[ 2]建议将几种
主要游离氨基酸(苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸、天门冬氨酸)作为鉴定或预测
未知抗病花生和抗虫水稻品种的主要生化指标。本试验结果表明不同抗病性马尾松种源中的
9种游离氨基酸也存在含量较少的趋势。这也反映用游离氨基酸的含量这一生化指标来鉴定
抗病种源或抗病松种也有一定的前景。
( 3)松材线虫分泌的蛋白酶[ 10]和海藻糖[ 11]对植物蛋白质有明显的影响,而与植物本身的
抗(感)病程度有关 [ 12]。本试验的分析结果表明,具不同抗病性种源的 11种固态氨基酸与松材
线虫病的感病指数均有较明显的负相关趋势,也就是说 11种固态氨基酸含量高的马尾松种源
抗松材线虫病。其抗病原因,是物质含量高导致生长势旺盛,产生丰富的次生代谢产物,从而抑
制了松材线虫的繁殖, 还是这些物质本身就具有抗松材线虫病的作用等有待进一步研究。
参　考　文　献
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8　张增全,顾金炎.褐稻虱饲料株中数种氨基酸的营养效应.昆虫学报, 1985, 28( 2) : 15～21.
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3173期　　　　　　　　　徐福元等: 马尾松不同种源氨基酸含量与抗松材线虫病的关系　　　　　　　　
Studies on the Relationship of Amino Acid Content of Different
Masson Pine Provenances and Their Resistance
to Pine Wood Nematode ( PWN)
X u Fuyuan　Ge Minghong　Zhao Zhendong　Zhu K egong
　　Abstract　On the basis of selected and tested resistance o f masson pine ( P inus massoni-
ana) pr ovenances, and ex ternal symptoms o f resistant difference of masson pine provenances,
GX2( H ) , SC2( M ) , SX1( L ) and black pine( S) ( P . thunber gii) resistant to PWN ( Bursap he-
lenchus x ylop hilus) w er e observed. The resistant provenance GX2 w as stable ( IR= 100. 0) .
How ever, those o f the other pro venances SC2, SX1 and black pine var ied ( I R = 60. 0, 40. 0
and 0 respect ively) . Comparing w ith SC2, SX1 and black pine, the resistant factor s in w ood o f
GX2 w ere analysed and the results showed that : the factor that less sucking st imulato ry o f
fr ee am ino acid ( including His, T hre, Gly , Ile, Glu, Cy s, M eth, Leu, Ty r, T ry and Arg ) ex isted
in the wood of GX2 indicated it seemed to be one o f the ant i-feeding causes. A clear positive
co rrelation w as found betw een the ext rernal symptoms of index of pathogenesis ( I P ) and the
content of fr ee am ino acid. It indicated that the pines w ith low content of f ree am ino acid are
resistant to PWN and v ice versa . And a negativ e corr elat ion betw een the I P and the total
cr ude pro tein and 11 stationary amino acids w ere also found.
　　Key words　masson pine pr ovenance　Bursaphelenchus xy lop hilus　amino acid　resis-
tant factor
　　Xu Fuyu an , Associate Profes sor, Ge M inghong ( T he Forest ry Research Inst itute of Jiangsu Province　Nanj ing　
211153) ; Zhao Zh endong ( T he Research Inst itute of Chemical Proces sing and Ut iliz at ion of Forest Produ cts, CAF) ; Zhu
Kegong ( Nanjing Fores tr y Un ivers ity ) .
318　　　　　　　　　　　　　　　　林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　11卷