全 文 ：第 50 卷 第 3 期
2 0 1 4 年 3 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 3
Mar．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140315
收稿日期: 2013 － 05 － 12; 修回日期: 2013 － 08 － 01。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30671700)。
* 池玉杰为通讯作者。
一色齿毛菌锰过氧化物酶(MnP)活性检测与
MnP1 基因的克隆*
于 存 池玉杰
(东北林业大学林学院 哈尔滨 150040)
摘 要: 锰过氧化物酶(MnP)广泛存在于白腐菌中，是降解木质素的主要酶系。首先对采自长白山的一色齿毛
菌菌株 CB1 降解木质素的过氧化物酶进行检测，结果表明一色齿毛菌可产生 MnP，但不产生木质素过氧化物酶
(LiP); Mn2 +不是其产生 MnP 的必要因子，在 LNAS 培养基中加入木屑为底物的条件下，一色齿毛菌 MnP 最大酶
活为 18. 4 U·L － 1。在酶活检测的基础上，为了深入研究 MnP 降解木质素的功能，根据已知的 MnP 基因保守区序列
设计引物，以一色齿毛菌菌株 CB1 的基因组 DNA 为模板，采用染色体步移技术，克隆到该菌株一个编码 MnP1 蛋白
的全长 DNA 基因(GenBank 登录号 JQ782578. 1)，命名为 Cu-mnp1。该基因 DNA 全长 4 268 bp，含有 16 个外显子和
15 个内含子; 其启动子区域含有 TATA-Box，CAAT-Box，SP1，AP1，HSE，XRE 等多个顺式作用元件; 其 cDNA 基因
(GenBank 登录号 JQ782579. 1)编码区长度为 1 092 bp，编码 363 个氨基酸。BLAST 比对分析表明，在 cDNA 水平上
Cu-mnp1 与猴头菇菌株 CB1 的 mnp2 基因的相似性最高为 70%。蛋白结构分析表明，Cu-MnP1 含有 4 个二硫键属
于短 MnP。
关键词: 一色齿毛菌(单色下皮黑); 木质素降解酶; 锰过氧化物酶; 基因克隆; 染色体步移
中图分类号: S718. 81 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)03 － 0109 － 08
Detection on Manganese Peroxidase Activity and Cloning of Cu-mnp1 of Cerena unicolor
Yu Cun Chi Yujie
(College of Forestry，Northeast Forestry University Harbin 150040)
Abstract: Manganese peroxidase (MnP) widely exists in white-rot fungi and it is the main enzyme to degrade lignin．
The ligninolytic peroxidase activity of Cerena unicolor stain CB1 collected from Changbai Mountain was firstly detected，
result showed that C． unicolor could produce MnP，but no lignin peroxidase ( LiP) excreted，and Mn2 + was not the
essential factor for C． unicolor to produce MnP． The highest MnP activity was gained when sawdust was added to LNAS
culture solution with Mn2 + substrate which was 18. 4 U·L － 1 ． On the basis of MnP activity determination，a MnP full
length DNA gene termed Cu-mnp1 (GenBank accession No． JQ782578. 1) was cloned in order to study the function of
MnP to degrade lignin furtherly． Forward and reverse primers for PCR and nested gene-specific primers for genome walking
PCR were designed based on the conserved sequences of the known MnP genes and amplified DNA fragment，all the PCR
reactions were conducted by the genomic DNA of the C． unicolor stain CB1 as the template． The full length DNA gene Cu-
mnp1 was 4 268 bp containing 16 exons and 15 introns，its promoter region contained diverse cis-acting elements such as
TATA-Box，CAAT-Box，SP1，AP1，HSE，and XRE． Its cDNA gene contained 1 092 bp coding region encoding 363
amino acids． BLAST analysis indicated that Cu-mnp1 in the cDNA level showed the highest similarity with mnp2 gene
(GenBank accession No． JQ248599. 1) from Hericium erinaceum strain CB1 which was 70% ． Protein structure analysis
showed that Cu-Mnp1 contained 4 disulfide bonds belonging to short MnP．
Key words: Cerena unicolor; ligninolytic enzyme; manganese peroxidase (MnP); gene cloning; genome walking
白腐菌在分解木质素的过程中通过分泌能够降
解木质素的酶系统，氧化与分解木质素，这些酶系统
主要包括锰过氧化物酶 ( manganese peroxidase，
MnP)、木质素过氧化物酶( lignin peroxidase，LiP)和
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漆酶( laccase)等。其中 MnPs(EC 1. 11. 1. 13)是一
类依赖 H2O2 的含 Fe
3 +和血红素辅基的糖基化细胞
外过氧化物酶，分子质量在 38 ～ 62. 5 kDa 之间，仅
广泛 存 在 于 多 孔 菌 目 ( Polyporales )、伞 菌 目
( Agaricales )、革 菌 目 ( Corticiales )、刺 革 菌 目
(Hymenochaetales)的白腐担子菌中，到目前为止在
其他微生物中并未发现有 MnP 的相关报道( Janusz
et al．，2013)。在白腐菌降解木质素的非特异性细
胞外氧化酶中，MnP 最常见，对降解木质素结构起
着至关重要的作用，被认为是木质素降解的关键酶
(Deguchi et al．，1998; Kirk et al．，1998)。
自从 Masaaki 等(1984)首次从黄孢原毛平革菌
(Phanerochaete chrysosporium)的木质素裂解培养液
中分离检测到 MnP 以来，由于其在生物制浆、生物
降解等方面的潜在应用，被人们广泛关注。MnP 通
常以多种同工酶的形式存在，白腐菌在菌丝营养生
长的不同阶段会分泌一系列相近的 MnPs 同工酶，
一般高水平的液体培养基中至少存在 3 种及以上的
异构体。随着白腐菌分子生物学研究的迅速发展，
越来越多的 MnPs 同工酶基因已被克隆(Alic et al．，
1997; Li et al．，1999; Giardina，2000; Maeda et al．，
2001; Johansson et al．，2002; Hilden et al．，2005;
Nagai et al．，2007)。
一色齿毛菌 ( Cerrena unicolor)又名单色下皮
黑，是一种生长在多种阔叶树枯立木、倒木和衰弱活
立木上的多孔菌科( Polyporaceae)白腐菌。对该种
MnP 基因的研究国内外尚属空白。由于 MnP 底物
的多样性及酶本身结构、基因编码、调控表达的复杂
性，对于 MnP 的分子生物学、高效表达体系的构建
等研究尚有待深入。因此，研究白腐菌 MnP 的基因
结构具有重要意义，可为进一步深入研究 MnP 降解
芳香族化合物的机制与 mnp 基因表达调控之间的
关系提供基础依据，对进一步构建优良工程菌株也
具有重要意义。
1 材料与方法
1. 1 菌种来源和培养基
一色齿毛菌菌株 CB1 由采自于长白山的子实
体上分离得到，PDA 斜面上的菌种保存于 4 ℃ 冰
箱。试验时挑取小块试管内的菌种，接种于 PDA 平
板培养基上，于 28 ℃下培养，经 4 ～ 5 天菌丝长满平
板。
产酶基础培养基( L － 1 ): 低氮天冬酰胺 － 琥珀
酸培养基 ( LNAS，low nitrogen asparagine succinic
acid)，是一种营养成分有限的基础产酶培养基，参
见闫洪波(2009)。
1. 2 产酶培养方式与酶活性测定方法
产酶培养方式与酶活性测定方法均按照闫洪波
(2009)进行。采用 3 种不同培养方式进行菌种培
养: A． LNAS 培养基不含 Mn2 +，即矿物元素溶液中
不添加 MnSO4·H2O; B． LNAS 培养基含 Mn
2 +
(2. 67 × 10 － 3 mmol·L － 1 )，即矿物元素溶液中添加
MnSO4·H2O; C． LNAS 培养基含 Mn
2 + (2. 67 × 10 － 3
mmol·L － 1)，并加入 2 g 大青杨(Populus ussuriensis)
木屑为产酶底物。每项试验设 3 个重复。培养至
3，5，7，9，11，13，15，17，19，21 天提取培养液即胞外
酶液，测定酶活后，绘制产酶活性时间曲线图，利用
SPSS 软件数据处理系统对 3 种不同的培养方式产
生的酶活性进行方差分析。
1. 3 Cu-mnp1 基因克隆
1. 3. 1 基因组 DNA 的提取与 Cu-mnp1 基因 DNA
片段的扩增 从 PDA 斜面培养基上取少量菌丝接
种于 PDA 平板培养基上，在 28 ℃下培养 4 天后，刮
取长势旺盛的三皿平板上的新鲜菌丝体，使用
TIANGEN 公司的 DNAquick _快捷型植物基因组
DNA 提取系统及相关方法提取真菌基因组 DNA。
将所得 DNA 用 1. 0% 琼脂糖凝胶电泳和 Eppendof
公司的核酸测定仪检测 DNA 的大小、纯度及浓度，
然后将 DNA 稀释到终浓度为 100 ng·μL － 1用于 PCR
反应。
根据 GenBank 已报道的多种担子菌不同 MnP
基因序列，用序列对比软件 ClustalX 2. 0 进行同源
比对查找保守区，设计出上游和下游 2 条 PCR 引物
1F，1R(表 1)，以一色齿毛菌基因组 DNA 为模板，
用于扩增其 MnP1 基因 ( Cu-mnp1 ) 的 DNA 片段。
25 μL反应体系组成为: 10 × PCR Buffer 2. 5 μL，
2. 5 mmol·L － 1 dNTP 4 μL，10 μmol·L － 1上下游引物
各 0. 5 μL，5 U·μL － 1 rTaq DNA 聚合酶 0. 25 μL，模
板 DNA 0. 5 μL，然后往反应体系内补足 ddH2O 至
25 μL。反应条件为: 94 ℃ 预变性 3 min; 94 ℃
30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环; 72 ℃延伸
10 min。扩增完毕，取样用 1. 0%的琼脂糖凝胶电泳
检测，观察电泳图确定目的条带。
1. 3. 2 染色体步移法 ( genome walking)扩增 Cu-
mnp1 全长 DNA 基因 根据已克隆到的 Cu-mnp1 基
因片段，在 5 端设计了 2 次 3 个巢式特异性引物
SP1，SP2 和 SP3，在 3 端设计了 1 次 3 个巢式特异
性引物 SP1，SP2 和 SP3(表 1)，设计方向为需要扩
增的未知区域方向，以一色齿毛菌基因组 DNA 为模
板，利用 TaKaRa 公司的染色体步移试剂盒(Genome
011
第 3 期 于 存等: 一色齿毛菌锰过氧化物酶(MnP)活性检测与 MnP1 基因的克隆
Walking Kit)及相关方法克隆该基因的 5上游和 3
下游序列，以获得全长 DNA 基因。引物设计要求、
PCR 的反应体系、扩增的温度条件和循环数等见
http: / /www． takara． com． cn /? action = Page＆Plat =
pdetail＆newsid = 289＆subclass = 1。扩增完毕后，取
第 2，3 轮 PCR 反应液各 2 μL，用 1. 0%琼脂糖凝胶
进行电泳检测，观察电泳图确定目的条带。
表 1 Cu-mnp1 全长基因克隆中使用的引物
Tab. 1 PCR primers used for genomic PCR to amplify full-length Cu-mnp1
引物名称 Primer description 5 － 3的核苷酸序列 Nucleotide sequence 5 － 3
Cu-mnp1 片段上游引物 1F Upstream primer 1F of Cu-mnp1 fragment
Cu-mnp1 片段下游引物 1R Downstream primer 1R of Cu-mnp1 fragment
第 1 次 5 Walking PCR 引物 5-SP1 First 5Walking PCR primer 5-SP1
第 1 次 5 Walking PCR 引物 5-SP2 First 5Walking PCR primer 5-SP2
第 1 次 5 Walking PCR 引物 5-SP3 First 5Walking PCR primer 5-SP3
第 2 次 5 Walking PCR 引物 5UTR-SP1 Second 5 Walking PCR primer 5UTR-SP1
第 2 次 5 Walking PCR 引物 5UTR-SP2 Second 5 Walking PCR primer 5UTR-SP2
第 2 次 5 Walking PCR 引物 5UTR-SP3 Second 5 Walking PCR primer 5UTR-SP3
3 Walking PCR 引物 3-SP1 3Walking PCR primer 3-SP1
3 Walking PCR 引物 3-SP2 3Walking PCR primer 3-SP2
3 Walking PCR 引物 3-SP3 3Walking PCR primer 3-SP3
CTGACGTTCCACGACGCTAT
GTCGGCGCGGGCGACGGAGTG
GCCGTTGGCATCTGAGAAAGGGT
CGAAGGACAAAAAAACTTACGG
CGGCACCTCCACCACTAATG
ACCTCTTCGCCACATTCTCCA
TCAGCCCGTTTGTCTATGTCTAAG
GTCTAAGCGAGCGTTGTTCCTGT
CGGTCGCTCTAACTTCTCTCTTCC
TCTTCCCGCTCCTGATCTCACC
GAACCTTCTGACCCAACTGACAAG
1. 3. 3 胶回收、连接、转化、测序与序列拼接 使用
凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit，E． Z． N． A)回收
各个环节中 PCR 产物的目的片段，将目的片段连接
到 PMD18-T 载体 ( TaKaRa ) 并转化至大肠杆菌
(Escherichia coli)Top10 感受态细胞中，进行蓝白斑
筛选后所得菌液交给上海英俊生物技术公司进行双
向测序。每个 PCR 产物都是 2 个以上克隆进行测
序以核准编码。测序结果用 BLAST 进行比对分析，
将 Cu-mnp1 基因组 DNA 片段与染色体步移获得的
5上游和 3下游序列进行比对并拼接，从而获得 Cu-
mnp1 全长 DNA 基因。
1. 4 Cu-mnp1 全长 DNA 基因生物信息学分析
通过 RNA 剪接位点(内含子 /外显子)Augustus
预测网站( http: / / augustus． gobics． de /)预测内含子
和外显子的数量、位置，并通过在 NCBI 上进行同源
序列比对进行核对与校正。外显子核准后，通过
NCBI 的 ORF Finder ( http: / /www． ncbi． nlm． nih．
gov / projects / gorf /)查找该基因的读码框 ORF，分析
起始密码子、终止密码子。使用 BioEdit 分析软件对
DNA 和 cDNA 核苷酸序列进行碱基成分分析，将
cDNA 核苷酸序列翻译为氨基酸序列，并对其氨基
酸组成进行分析。利用 Neural Network Promoter
Prediction ( http: / /www． Fruitfly． org / seq _ tools /
promoter． html)对 Cu-mnp1 5启动子区进行结构分
析。使 用 NCBI 的 BLAST 和 Conserved Domain
Database (CDD) 软件 ( http: / /www． ncbi． nlm． nih．
gov / Structure / cdd /wrpsb． cgi) 分析蛋白序列的基本
信息、保守结构域。采用 Signal Scan ( http: / /www-
bimas． cit． nih． gov / molbio / signal /) 和 SignalP 4. 0
(http: / /www． cbs． dtu． dk / services / SignalP /)预测蛋
白信号肽。使用 CLUSTAL 2. 0 在线 ( http: / /www．
ebi． ac． uk /Tools / clustalw2 / index． html)和 MEGA 4. 0
软件对多种白腐菌的 MnP 同工酶进行蛋白序列比
对，分析保守氨基酸及金属结合位点等信息，与其他
白腐菌 MnP 的异同，采用 NJ 法构建系统发育树。
使 用 swissmodel 的 自 动 建 模 模 式 ( http: / /
swissmodel． expasy． org /) 以 及 NCBI 的 Vector
Alignment Search Tool(VAST)进行蛋白质三维结构
的预测以及功能位点的模拟。
2 结果与分析
2. 1 3 种培养方式降解木质素的过氧化物酶活性
检测
一色齿毛菌菌株 CB1 在 21 天的培养过程中，
经以藜芦醇为底物的测定方法，在 3 种不同的培养
方式中于 310 nm 处均未检测到 LiP 的活性; 但 3 种
培养方式，经以 2，6 － 二甲氧基苯酚(2，6-DMP)为
底物，于 470 nm 处都检测到了 MnP 的活性。在培
养方式 A 的培养液中不含 Mn2 +，提取的酶液检测
到了 MnP 的活性，9 天达到最高为 15. 07 U·L － 1，随
后出现下降，然后在较低的水平保持稳定; 在培养
方式 B 的培养液中含 Mn2 +，提取的酶液检测到了
MnP 的活性，也是在 9 天达到最高为 16. 05 U·L － 1，
随后出现下降，然后在较低的水平保持稳定。A、B
2 种培养方式在第 3 天都可以检测到 MnP 的活性，2
种培养方式的酶活性曲线较相似，仅仅是在培养液
中含有 Mn2 +比不含有 Mn2 + 的 MnP 酶活性稍高一
点，但 Mn2 +不是一色齿毛菌产生 MnP 的必要因子。
在培养方式 C 中，提取的酶液也是在第 3 天就检测
到 MnP 的活性，但第 3 天就出现一个高峰，有较高
111
林 业 科 学 50 卷
的酶活分泌，随后第 5 天出现分泌量下降的趋势，在
第 7 天又上升达到最大分泌量，酶活性为 18. 4 U·
L － 1，随后出现下降，然后在较低的水平保持稳定。
对比 A、B、C 3 种培养过程中 MnP 的产生结果，表明
在培养液中添加底物木屑可以提高 MnP 的产生量，
且最大酶活分泌时间提前 2 天，底物对于一色齿毛
菌的 MnP 可产生诱导作用。21 天内一色齿毛菌在 3
种培养方式中产生 MnP 的情况见图 1，3 组重复数
据的误差线标注其上。
方差分析结果表明，培养时间的显著性水平
Sig．值 = 0. 00 ＜ 0. 05，表明不同培养时间之间的
MnP 活性差异显著; 而培养方式的显著性水平 Sig．
值 = 0. 03 ＜ 0. 05，表明 3 种不同培养方式之间 MnP
的活性有差异，但差异不如不同培养时间之间的
MnP 活性显著 (表 2)。培养方式的多重比对结果
(表 3)显示，在 P = 0. 05 时培养方式 A 与培养方式
C 之间差异显著，即添加木屑对 MnP 的影响是显
著的。
图 1 一色齿毛菌在 3 种培养方式下
MnP 活性随时间的变化
Fig. 1 MnP activity of 3 kinds of culture methods
表 2 一色齿毛菌 MnP 活性方差分析
Tab． 2 The variance analysis of MnP activity from C． unicolor
来源
Origin
平方和
Sum of square
自由度
Degree of freedom
均方
Mean square
统计量值
Statistic value
显著性水平
Sig． (P = 0. 05)
校正模型 Correcting model 576. 37 12 48. 03 16. 23 0. 00
截距 Intercept 3 116. 74 1 3 116. 74 1 053. 24 0. 00
培养时间 Culture time 551. 96 10 55. 20 18. 65 0. 00
培养方式 Culture method 24. 40 2 12. 21 4. 13 0. 03
误差 Errors 59. 18 20 2. 96
总计 Total 3 752. 29 33
校正总计 Correction total 635. 56 32
表 3 一色齿毛菌 MnP 培养方式多重比较分析
Tab． 3 The comparative analysis of multiple culture methods of MnP activity from C． unicolor
培养方式( I)
Culture method( I)
培养方式( J)
Culture method( J)
均值差值( I － J)
Mean difference( I － J)
标准误差
Std． error
显著性水平
Sig． (P = 0. 05)
95%置信区间 95% Confidence interval
下限 Lower bound 上限 Uppper bound
A B － 0. 510 7 0. 733 51 0. 494 － 2. 040 8 1. 019 3
C － 2. 025 5 * 0. 733 51 0. 012 － 3. 555 6 － 0. 495 4
B A 0. 510 7 0. 733 51 0. 494 － 1. 019 3 2. 040 8
C － 1. 514 8 0. 733 51 0. 052 － 3. 044 8 0. 015 3
C A 2. 025 5 * 0. 733 51 0. 012 0. 495 4 3. 555 6
B 1. 514 8 0. 733 51 0. 052 － 0. 015 3 3. 044 8
2. 2 Cu-mnp1 DNA 全长基因的克隆结果
2. 2. 1 基因 Cu-mnp1 的 DNA 片段 以基因组
DNA 为模板，用引物 1F 和 1R 扩增到一个 598 bp
的目的基因片段(图 2a-2)。将该片段序列登录到
NCBI 网站进行 BLAST 同源序列比对后，发现其具
有 MnP 特性，与其他白腐菌的 MnP 具有最大同源
性，其中与日本刺皮菌 ( Echinodontium japonicum)
mnp(AF218412. 1)、南方灵芝(Ganoderma australe)
mnp( DQ267753. 1)、糙皮侧耳 ( Pleurotus ostreatus)
mnp( JN020144. 1 ) 等 MnP 基因相似性在 67% ～
84%之间，因此确定该序列即为一色齿毛菌锰过氧
化物酶 1 片段基因，将其命名为 Cu-mnp1。
2. 2. 2 基因 Cu-mnp1 DNA 片段的两侧序列 通过
筛选 5 端第 1 次和 3 端染色体步移第 1 ～ 3 轮 PCR
产物的目的片段，经测序和 BLAST 比对分析，在 5
和 3 端分别获得了一个 905 bp 和 1 547 bp 的目的
序列(图 2b － 1、图 2c － 11 上带)，与 Cu-mnp1 部分
序列分别有 244 bp 和 99 bp 重叠区域，表明所得序
列即为基因 Cu-mnp1 片段的 5端和 3端侧翼序列。
3 部分拼接后得到了 2 680 bp 的全长 DNA 基因。
在此基础上，又在 5 端进行了第 2 次染色体步移，
获得了一个 1 623 bp 的目的序列 (见图 2d － 12 亮
211
第 3 期 于 存等: 一色齿毛菌锰过氧化物酶(MnP)活性检测与 MnP1 基因的克隆
图 2 Cu-mnp1 全长 DNA 基因克隆(M: DL2000 Marker; APx: AP1 － 4)
Fig． 2 Cloning of full-length DNA gene Cu-mnp1(M: DL2000 Marker; APx: AP1 － 4)
a. Cu-mnp1 基因片段 PCR;b. 5第 1 次染色体步移产物;c. 3染色体步移产物;d. 5 第 2 次染色体步移产物。
a. Degenerate PCR product of Cu-mnp1 Lane 1: Not-target fragment; Lane 2: Target fragment． b. First 5 Genome Walking
PCR product Lane 1，4，7，10: 5-SP1 + APx; Lane 2，5，8，11: 5-SP2 + APx; Lane 3，6，9，12: 5-SP1 + APx． c. 3
Genome Walking PCR product Lane 1，2，3，4: 3-SP1 + APx; Lane 5，6，7，8: 3-SP2 + APx; Lane 9，10，11，12: 3-SP3 + APx．
d. Second 5 Genome Walking PCR product Lane 1，2，3，4: 5UTR-SP1 + APx; Lane 5，6，7，8: 5UTR-SP2 + APx; Lane
9，10，11，12: 5UTRSP3 + APx．
带)，与 2 680 bp 的全长 DNA 基因 5 端序列有 35
bp 的重叠，并具有基因启动子序列的特征，表明所
得序列即为全长 DNA 基因 Cu-mnp1 5 端的启动子
序列。2 部分拼接后得到了 4 268 bp 包括启动子区
域的全长 DNA 基因。Cu-mnp1 的基因组碱基序列
包括 5启动子区域、外显子、内含子和 3 下游非编
码区。
结合 Augustus 与 BLAST 比对，全面分析了 Cu-
mnp1 全长 DNA 基因内含子和外显子的位置与数
量，获得了 cDNA 序列信息。将该基因组 DNA 与
cDNA 基因序列分别提交到 NCBI 的 GenBank 上，登
录号 分 别 为 JQ782578. 1 ( DNA ) 和 JQ782579. 1
( cDNA)。对 Cu-mnp1 全长 DNA 基因序列结构分
析的结果表明，该基因含有 1 909 bp 的完整开放阅
读框( open reading frame，ORF)、起始密码子 ATG、
终止密码子 TAA、5非翻译区 1 768 bp、3非翻译区
591 bp。该基因含有 16 个外显子、15 个内含子，外
显子长度在 9 ～ 241 bp 之间，内含子长度在 50 ～ 58
bp 之间。所有内含子剪切位点均符合真核生物普
遍遵循的 GT-AG 规则。从 ATG 到 TAA 的 cDNA 序
列 G-C 含量占 52. 38%，而 DNA 序列由于加入了内
含子导致了 G-C 含量下降了 4. 19%。在 cDNA 水
平上进行 BLAST 比对分析，Cu-mnp1 与猴头菇
(Hericium erinaceum) CB1 mnp2 基因( JQ248599. 1)
的序列相似性最高为 70%，与绵皮孔菌( Spongipellis
sp． ) mnp1 ( AB244274. 1 )、扁 芝 ( Ganoderma
applanatum) mnp1 ( AB035734. 1 )、云芝 ( Trametes
versicolor ) mnp ( AJ745080. 3 )、猴 头 菇 mnp1
(HM116841. 3)等相似性达到 67% ～ 69%，与 T．
versicolor 的 manganese-repressed peroxidase (mrp)
(AF008585. 1)、毛缘齿耳( Steccherinum fimbriatum)
的过氧化物酶基因 (HM480284. 1 )也有较高的相
似性。
对基因 Cu-mnp1 5 非翻译区序列进行分析的
结果表明，该区域包含了调控真核基因转录的基本
元件。在翻译起始位点上游区 － 115 ～ － 65 bp 之间
存在推定的基础启动子区域，其序列为: 5-tcctgcctc
gtataaatacgtcaagaaatgcaggggaggacctcagtgctc-3，其中存
在 1 个 TATA-Box 位于 － 105 ～ － 100 bp 之间，推定
的转录起始点位于 － 74 bp 处。1 个 CAAT-Box 位于
－ 1 613 ～ － 1 609 bp，还有 5 个反向的 CAAT-Box
( － 168，－ 424，－ 738，－ 1 410，－ 1 538)。还发现
了一些重要的作用元件，包括 1 个转录因子结合位
点 SP1( － 420，gggcgg)、2 个转录激活蛋白 1 结合位
点 AP1( － 1 595，tgactaa; － 1 561，tgactca)、3 个热
激元件 HSE 符合 5-NTTCNNGAAN-3 ( heat-shock
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林 业 科 学 50 卷
element，－ 1 654，－ 1 015，－ 572)、3 个异型生物质
响 应 元 件 XRE ( Xenobiotic response element，
－ 1 599，－ 1 020，－ 632)等。
2. 3 推定的一色齿毛菌锰过氧化物酶 1 ( Cu-
MnP1)的特征与系统发育分析
基因 Cu-mnp1 在去掉内含子后，在 cDNA 水平
上，含有 1 092 bp 的完整开放阅读框 ORF，编码了
363 个氨基酸的蛋白质多肽前体(GenBank 登录号
AFK91529. 1)。经信号肽预测，这个蛋白质多肽前
体包含了 1 个 19-aa 的信号肽(其中包含有 N － 末
端的 MAF 短序列)，以及 1 个 6-aa 的中间前导短
肽。这样成熟的一色齿毛菌锰过氧化物酶 1 ( Cu-
MnP1)的蛋白质长度为 338 个氨基酸。预测成熟蛋
白分子质量为 35. 78 kDa，pI 为 4. 89，带负电荷残基
(Asp + Glu)有 40 个，带正电荷残基(Arg + Lys)有
24 个，总原子数为 4 961 个，分子式为 C1 584H2 442 N432
O491 S12。与催化结构、晶体结构和功能有关的氨基
酸残基与其他白腐菌的 MnP 相同，都是保守的。主
要包括: 1) 3 个与血红素连接的氨基酸 R43，H47，
H175; 2) 3 个与 Mn2 + 连接的氨基酸 E36，E40 和
H182; 3) 5 个与血红素远侧末端的 Ca2 + 连接的氨
基酸 S176，D193，T195，S198，D200，4 个与近侧末端
的 Ca2 +连接的氨基酸 D48，G66，D68，S70; 4) 构成
4 个二硫桥的 8 个半胱氨酸残基 C3: C15，C14:
C284，C34:C120 和 C248:C314。
Cu-MnP1 蛋白三维结构的预测以及功能位点
的模拟图如图 3。图中 A，B，C 为三级结构的不同
侧面。从图 3 可看出 Cu-MnP1 蛋白是一个含 Fe3 +，
Ca2 +和 Mn2 +金属离子结合位点，包含有 10 个主螺
旋的高聚物蛋白。
使用 BLAST 和 CLUSTAL 2. 0 在线对 Cu-MnP1
和多种白腐菌的过氧化物酶进行氨基酸序列同源性
比对的结果表明: Cu-MnP1 与污叉丝孔菌 ( D．
squalens)的 MnP(EJF56126. 1)相似性最高为 75%
(覆盖度 100% )，与该种的 LiP( EJF59849. 1)相似
性为 71% (覆盖度 100% )，与 T． versicolor FP-101664
SS1 的多功能过氧化物酶 VP(Versatile Peroxidase，
EIW53183. 1)相似性为 69% (覆盖度 100% )，另外
与 T． versicolor 的 MnP ( AAT90348. 1 )、D． squalens
的 VP ( EJF56475. 1 )、H． erinaceum 的 MnP2
(AFD50189. 1)和 MnP1 ( ADK26471. 3 )、肺形侧耳
(P． pulmonarius)的 VP(AFM93767. 1)、P． ostreatus
的 MnP3(ACM47219. 1)的相似性在 60% ～ 65% 之
间。对来自 10 种白腐菌的 21 个 MnP 同工酶氨基
酸序列进行系统进化树分析的结果表明，多个 MnPs
明显分为 2 个进化分枝(图 4)，在进化树的上半部
分即第 1 分枝的 MnPs 都含有 5 个二硫键，属于长的
MnP 称为 MnP1; 在进化树的下半部分即第 2 分枝
的 MnPs 都含有 4 个二硫键，属于短的 MnP，称为
MnP2。Cu-MnP1 由于含有 4 个二硫键，在系统发育
过程中与短 MnPs(MnP2)遗传距离较近并聚类在
一起。
图 3 Cu-MnP1 蛋白的三级结构与模拟功能位点
Fig． 3 The third-class structure and putative function sites of Cu-MnP1
3 结论与讨论
本研究采用 3 种不同培养方式对一色齿毛菌降
解木质素的过氧化物酶系统 MnP 和 LiP 的活性进
行了检测; 在此基础上，采用常规 PCR 和染色体步
移技术，克隆到了一色齿毛菌菌株 CB1 的 MnP1 基
因 Cu-mnp1。得出以下结论: 一色齿毛菌可产生
MnP，但不产生 LiP。对比 3 种不同培养方式下酶活
性测定结果可以看出，在缺乏 Mn2 +的情况下也有微
量的 MnP 产生; 在培养液内添加酶作用的底物木
屑，可以提高 MnP 的分泌量。基因 Cu-mnp1 的 5启
动子区域包含了调控真核基因转录的基本元件
TATA-Box，CAAT-Box，Inverted CAAT-Box 以及其他
重要的顺式作用元件 SP1，AP1，HSE，XRE 等; Cu-
411
第 3 期 于 存等: 一色齿毛菌锰过氧化物酶(MnP)活性检测与 MnP1 基因的克隆
图 4 来源于 10 种白腐菌的 21 个 MnPs 的 NJ 系统发育树
Fig． 4 Neighbour joining tree of 21 complete MnPs from 10 basidiomycetes based on realigned sequences
Cu-MnP1 用●标志，树枝上的数字表示 Bootstrap 验证中该树枝的可信度。
Main groups MnP1 and MnP2 are depicted． Cu-MnP1 is indicated as
● ． Bootstrap values are from 1 000 replications．
MnP1 蛋白的三维结构与功能位点具有与黄孢原毛
平革菌 MnP 类似的特征; 对多条 MnP 蛋白进行系
统进化分析的结果表明 MnP 可分为两大类群，其中
Cu-MnP1 归属于第 2 类含有 4 个二硫键的短 MnP
类群。
尹立伟等(2010)对灰树花、红平菇、杏鲍菇和
乳白耙齿菌的 MnP 活性随时间变化的研究结果显
示，在 11 ～ 15 天 MnP 活性达到最高。本研究中一
色齿毛菌在相同培养条件下，在第 7 ～ 9 天 MnP 活
性达到最高，MnP 最大酶活分泌时间提前，推测原
因可能与一色齿毛菌菌丝生长速度较快和诱导代谢
提前有关。另外，对于灰树花和红平菇，Mn2 + 是产
MnP 必要因子，而一色齿毛菌在缺乏 Mn2 +的情况下
也有微量的 MnP 产生。
在 mnp 启动子的研究中，发现一些 mnp 基因 5
端上游启动子区域包含有几个共同的响应元件如
SP1，AP2，HSE，MRE 和 XRE 等，在不同来源的 mnps
之间也存在着不同的调控元件 ( Tello et al．，2000;
Pease et al．，1989; Lobos et al．，1998; Hilden et al．，
2005)。本研究中 Cu-mnp1 的 5启动子区域包含了
调控真核基因转录的基本元件以及其他重要的顺式
作用元件 SP1，XRE，HSE 等，但是却没有很多 mnp
基因启动子区域 存 在的金 属 响应因 子 ( metal
response element，MRE)，这与 Le-mnp1 (Nagai et al．，
2007)和 Ds-mnp( Li et al．，1999)相一致，这种情形
在 mnp 基因中并不常见。推测一色齿毛菌 MnP 酶
活不受 Mn2 +的调控可能与不存在该元件有关。
MnP 从进化的观点来看，可以分出 2 类。第 1
类的预蛋白序列较长，一般含有 376 ～ 395 个氨基酸
(平均 383aa)，含有 5 个二硫桥，其中第 5 个二硫桥
用于稳定较长的 C 末端。很多较早研究的 MnPs 属
于这类典型的或称作长型 MnP(MnP1)，它们形成了
一个单系的类群并较早地从真菌过氧化物酶的系统
发 育 树 中 分 支 出 去 ( Lankinen et al．， 2005;
Morgenstern et al．，2010)。第 2 类 MnP 来源于木质
素过氧化物酶( LiP)和多功能过氧化物酶(VP)，具
有较短的预蛋白 (一般含有 354 ～ 365aa，平均为
363aa)，含有 4 个二硫桥与 LiP 相似，具有 MnP 和
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林 业 科 学 50 卷
LiP 2 种特性( Sundaramoorthy et al．，1994)，称作短
MnP(MnP2)。随着研究的深入，一些短 MnPs 较多
地被克隆出来，如 Cu-MnP1 由于含有 4 个二硫键而
属于短 MnP，系统发育分析也表明 Cu-MnP1 与短
MnPs 遗传距离较近并聚类在一起。氨基酸序列同
源性比对的结果也表明，Cu-MnP1 不仅与一些 MnPs
有较高的相似性，也与部 分 LiPs 和 VPs 具有类似的
相似性。
参 考 文 献
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(责任编辑 石红青)
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