全 文 ：第 50 卷 第 2 期
2 0 1 4 年 2 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 2
Feb．，2 0 1 4
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20140206
收稿日期: 2013 － 02 － 27; 修回日期: 2013 － 06 － 24。
基金项目: 江苏省科技支撑(农业)项目(BE2011381) ; 江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(CXZZ12-0544) ; 江苏高校优势学科建
设工程资助项目(PAPD)。
银杏营养贮藏蛋白质的分离纯化与结构鉴定
吴彩娥1 范龚健1 李婷婷1 吴海霞1，2 徐文斌1
(1. 南京林业大学森林资源与环境学院 南京 210037; 2. 运城学院生命科学系 运城 044000)
摘 要: 为探究银杏营养贮藏蛋白质的结构与功能的关系，采用 DEAE-Sepharose FF 离子交换色谱和 Sephadex
G-75 葡聚糖凝胶色谱对银杏营养贮藏蛋白进行分离纯化，得到一条 36 kDa 的蛋白。质谱分析结果表明: 该蛋白中
的 2 个肽段序列与大豆贮藏蛋白质(29 kDa)和薯蓣块茎贮藏蛋白质(30 kDa)的部分氨基酸序列吻合。红外光谱
结果表明:β －折叠构象是银杏营养贮藏蛋白质的主要二级结构。
关键词: 银杏; 营养贮藏蛋白质; 分离纯化; 结构鉴定
中图分类号: S718. 43 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)02 － 0037 － 05
Isolation，Purification and Structural Determination of
Vegetative Storage Proteins in Ginkgo biloba
Wu Caie1 Fan Gongjian1 Li Tingting1 Wu Haixia1，2 Xu Wenbin1
(1. College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University Nanjing 210037;
2. Department of Life Science，Yuncheng University Yuncheng 044000)
Abstract: To reveal the relationship between the structure and function of vegetative storage proteins in Ginkgo biloba，
the vegetative storage proteins were separated and purified by DEAE-Sepharose FF ion-exchange chromatography and
Sephadex G-75 gel chromatography． A target protein was obtained and its molecule weight was 36 kDa． The mass-
spectrometry showed that there were two peptide sequences which were consistent to some sequences of the Soybean storage
protein (29 kDa) and the Dioscorea storage protein (30 kDa) ． The infrared spectrometry indicated that the secondary
structure of the protein was mainly in β-sheet conformations．
Key words: Ginkgo biloba; vegetative storage protein; isolation and purification; structure identification
营养贮藏蛋白质( vegetative storage protein，简
称 VSPs)能维持植物体内相对稳定的内环境，保
证植物的正常生长发育，是多数落叶树种越冬期
间贮藏氮素的主要形式 (彭方仁等，2001 )。贮
藏蛋白质除了能防止树木养分损失外，还能为其
生长发育提供必需的养分 (董艳敏等，2007 )。
银杏( Ginkgo biloba)营养贮藏蛋白质主要存在于
枝条的木质部和皮层中，已有研究表明银杏枝条
皮层中的含量高于木质部，当年生枝条中含量高
于 2 年 生 枝 条 ( 彭 方 仁 等， 2006; 郭 红 彦，
2007 )。银杏营养贮藏蛋白质的细胞学特性和生
化性质的研究已有报道 (吴青霞等，2006; 彭方
仁等，2010)。郭娟等(2002)等对银杏营养贮藏
蛋白质进行了准确定位，郭红彦等(2009 )确定了
银杏营养贮藏蛋白质的分子质量为 32 kDa 和 36
kDa。目前对银杏营养贮藏蛋白质结构与功能的
关系还未见报道。为揭示银杏营养贮藏蛋白质
结构与功能的关系，本文采用 DEAE-Sepharose
FF 离子交换色谱和 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶
色谱分离纯化银杏营养贮藏蛋白质，并对获得
的蛋白质进行结构初探，揭示其结构与功能的
关系。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
银杏枝条于 2011 年 12 月采集于南京林业大学
校园内 2 年生的雌株银杏健壮枝条。枝条皮层经液
氮研磨成粉末、石油醚脱脂备用。
林 业 科 学 50 卷
1. 2 试验方法
1. 2. 1 银杏营养贮藏蛋白质提取及粗蛋白干粉制
备 蛋白提取: 银杏枝条经液氮研磨，用石油醚以
1∶ 5(m /v)的比例混匀，4 ℃脱脂。脱脂后的粉末用
0. 25 mol·L － 1，pH 9. 0 的 Tris-HCl 缓冲液( TBS)以
1∶ 10(m /v)的比例混匀，4 ℃浸提 10 h。浸提液过
滤，得到的滤液5 000 r·min － 1、4 ℃离心 30 min，得
到的上清液即为蛋白粗提液(蔡金星等，2007; 陈
振家等，2007)。
粗蛋白干粉制备: 参照黄文等(2004)和徐文斌
(2011)的方法并加以改进。采用 80% 的硫酸铵沉
淀蛋白，经静止离心后得到的沉淀用少量 0. 01 mol·
L － 1 TBS(pH 8. 5)溶解，转移至透析袋透析，最终得
到的蛋白溶液经冷冻干燥备用。
1. 2. 2 36 kDa 银杏营养贮藏蛋白质的分离纯化
DEAE-Sepharose FF 离 子 交 换 层 析: 将 DEAE-
Sepharose FF 用 pH 8. 5 的 0. 5 mol·L － 1 TBS 洗涤平
衡，真空脱气后装柱; 银杏营养贮藏粗蛋白质经 pH
8. 5 的 0. 01 mol·L － 1 TBS 溶解，配制成 10 mg·mL － 1
蛋白溶液。离子交换层析上样量为 5 mL，洗脱流速
为 1 mL·min － 1，起始缓冲液为 pH 8. 5 的 0. 01 mol·
L － 1 TBS，极限缓冲液为 pH 8. 5 的 0. 01 mol·L － 1
TBS，同时含 0. 3 mol·L － 1 NaCl。调整流速让洗脱液
以恒定速度流过色谱柱，分管收集洗脱液，每管收集
6 mL (栾明明等，2007 )。分管收集的洗脱液在
280 nm测定吸光度。
Sephadex G-75 凝 胶 层 析: 将 预 处 理 好 的
Sephadex G-75 用 0. 01 mol·L － 1 TBS(pH 8. 5)洗涤平
衡，真空脱气后装柱; 以 0. 01 mol·L － 1 TBS(pH 8. 5)
溶解银杏营养贮藏蛋白，上样体积为 5 mL; 调整流
速让洗脱液以恒定速度流过色谱柱，蛋白质上样浓
度 15 mg·mL － 1，上样量 5 mL，洗脱液流速 0. 3mL·
min － 1，分管收集洗脱液，每管收集 6 mL(王子佳等，
2009)。分管收集的洗脱液在 280 nm 测定吸光度。
SDS-PAGE 凝胶电泳: 分离胶 15%、浓缩胶
4. 4%，上样量 20 μL; 电泳时，浓缩胶恒定电压60 V
30 min，分离胶稳定电压 120 V 90 min (郭红彦等，
2007)。凝胶采用考马斯亮蓝染色法染色。所得凝胶
采用 Gel Doc 2000 凝胶成像系统及 Quantity One 分析
软件，根据低分子质量标准蛋白 Marker 分析计算。
银杏贮藏蛋白质含量的测定: 在 280 nm 下测
定蛋白溶液的吸光值，检测其浓度的变化趋势。
1. 2. 3 36 kDa 银杏营养贮藏蛋白质的结构鉴定及
数据分析 1) 质谱 ( LC-MS)检测 样品预处理:
参考徐文斌等(2011)的方法并加以改进。对 1. 2. 2
中获得的银杏 VSPs 进行 SDS-PAGE，获得目标蛋白
条带，经胰酶酶解，获得银杏 VSPs 酶解液，进行 LC-
MS 检测。
2) 傅里叶红外光谱检测 参考陈静涛等
(2008)的方法，测定银杏 VSPs 的红外特征吸收曲
线，记录4 000 ～ 400 cm － 1区间背景光谱。
2 结果与分析
2. 1 36 kDa 银杏营养贮藏蛋白质的分离纯化
2. 1. 1 DEAE-Sepharose FF 色 谱 分 析 DEAE-
Sepharose FF 离子交换色谱如图 1 所示。银杏 VSPs
经分离后得到Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ 4 个组分，收集 4 个组
分，浓缩后冷冻干燥，进行 SDS-PAGE 分析。
图 1 DEAE-Sepharose FF 离子交换色谱
Fig． 1 DEAE-Sepharose FF ion-exchange chromatograph
图中曲线为银杏营养贮藏蛋白质经 DEAE-Sepharose FF 纯化时的
4 个洗脱峰，直线为线性梯度洗脱时所对应 NaCl 的浓度。In figure
the curve means four elution peaks were obtained on DEAE-Sepharose
FF column chromatography of VSPs，the straight line means the
concentration of NaCl in gradient elution．
彭方仁等 (2010)研究了银杏蛋白含量在 1 年
中的动态变化规律，发现 32 kDa 和 36 kDa 蛋白质
具有营养贮藏蛋白质的特征，符合营养贮藏蛋白质
积累和降解受“源 － 库关系”调节的标准。本研究
对峰Ⅰ ～Ⅳ进行 SDS 电泳分析(图 2)。电泳结果表
明: 银杏 32 kDa 和 36 kDa 蛋白质存在于峰Ⅳ中，但
是 2 种蛋白质分离效果较差，需要进一步分离。
2. 1. 2 Sephadex G-75 凝胶色谱分析 Sephadex G-
75 凝胶利用分子筛作用对蛋白质进行分级分离，待
分离样品的上样浓度和洗脱液的流速对分离效果影
响显著(Tommasi et al．，2006)。经 2. 1. 1 得到的银
杏 VSPs 的峰Ⅳ，经 Sephadex G-75 凝胶色谱分离，结
果如图 3 所示。银杏营养贮藏蛋白质峰Ⅳ被分为 3
个组分，其中组分 1 是穿透峰，不含目标蛋白质，而
Sephadex G-75 的分子筛范围为 3 ～ 80 kDa，因此峰 2
和 3 需进行 SDS-PAGE 分析，以明确 32 kDa 和
36 kDa银杏 VSPs 的分布。
峰 2 和峰 3 的电泳结果(图 4)表明: 峰 2 中只存
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第 2 期 吴彩娥等: 银杏营养贮藏蛋白质的分离纯化与结构鉴定
图 2 SDS-PAGE 电泳
Fig. 2 Result of SDS-PAGE
图 3 Sephadex G-75 凝胶色谱
Fig． 3 Sephadex G-75gel chromatograph
图中曲线为经 DEAE-Sepharose FF 分离得到的峰Ⅳ经 Sephadex G-75
凝胶色谱分离所得 3 个洗脱峰。In figure the curve means three elution
peaks were obtained on Sephadex G-75 column chromatography of peak Ⅳ
obtained by DEAE-Sepharose FF．
在 1 条 36 kDa 的蛋白条带，达到了电泳纯度; 而峰 3
中则含有条带颜色较浅的 32 kDa 蛋白，同时也存在
其他多条杂质蛋白，后续分离较为困难。因此，本研
究对峰 2 中的 36 kDa 银杏 VSPs 进行后续质谱分析。
图 4 Sephadex G-75 色谱结果 SDS-PAGE 电泳分析
Fig． 4 SDS-PAGE result of ptoteins after Sephadex
G-75 gel chromatograph
2. 2 36 kDa 银杏营养贮藏蛋白质的结构鉴定及数
据分析
2. 2. 1 LC-MS 分析 将 2. 1. 2 中获得的 36 kDa 银
杏 VSPs 进行一级结构鉴定，通过 LC-MS 分析获得
36 kDa 银杏 VSPs 多条肽段的氨基酸序列。经
NCBI 数据库中植物贮藏蛋白库中肽质量指纹图谱
比对分析发现，36 kDa 银杏 VSPs 的 2 个肽段氨基
酸序列与数据库中大豆 ( Glycine max)贮藏蛋白质
(29 kDa)和薯蓣(Dioscorea opposita)块茎贮藏蛋白
质(30 kDa)的部分序列完全吻合，蛋白信息和相应
匹配肽段信息如表 1。
表 1 36 kDa 银杏 VSPs 的 LC-MS 质谱鉴定①
Tab. 1 Identification of 36 kDa VSPs by LC-MS
gi Number 134145 46917481
MW 29 064. 86 30 406. 1
Sequence
MKMKVLVFFVATILVAWQCHAYDMFPLRMNTGYGAR
TPEVKCASWRLAVEAHNIFGFETIPEECVEATKEYIHGE
QYRSDSKTVNQQAYFYARDLEVHPKDTFVFSIDGTVLSN
IPYYKKHGYGVEKFNSTLYDEWVNKGNAPALPETLKNY
NKLVSLGFKIIFLSGRTLDKQAVTEANLKKAGYHTWEKL
ILKDPQDPSTPNAVSYKTAAREKLIRQGYNIVGIIGDQW
SDLLGGHRGESRTFKLPNPLYYIQ
MSSSTLLHLLLLSSLLFSCLANVEDEFSYIEGNPNGPENWGNLKPE
WETCGKGMEQSPIQLRDNRVIFDQTLGRLRRNYRAVDARLRNSG
HDVLVEFKGNAGSLSINRVAYQLKRIHFHSPSEHEMNGERFDL
EAQLVHESQDQKRAVVSILFIFGRADPFLSDLEDFIKQFSSSQKNEI
NAGVVDPNQLQIDDSAYYRYMGSFTAPPCTEGISWTVMRKVATV
SPRQVLLLKQAVNENAINNARPLQPTNFRSVFYFEQLKSKVCAI
① 表中 gi Number 表示蛋白在 NCBI 数据库中的编号; MW 表示蛋白的分子质量; Sequence 表示匹配蛋白质的完整序列，其中带下划线的
氨基酸序列为 36 kDa 银杏 VSPs 的匹配肽段。In table gi Number means the number of protein in NCBI database; MW means the molecular weight of
protein; Sequence means the complete sequence of matched protein in which the underlined amino acid sequences are the matched peptides of 36 kDa
VSPs of G． biloba．
36 kDa 银杏 VSPs 中匹配率较高的 2 个肽段序
列氨基酸丰度见图 5，6。根据 LC-MS 分析结果发现，
NCBI 数据库中没有与 36 kDa 银杏 VSPs 完全匹配的
蛋白质，但可以通过相似氨基酸序列来判断该蛋白质
的部分功能特性。参考肽指纹图谱比对结果，结合
NCBI 网站上有关蛋白质的功能信息和结构域表明，
银杏 VSPs 肽段 KGNAGSLSINRVAYQLKRI 与薯蓣块
茎贮藏蛋白质部分肽段匹配部分，属于蛋白质碳酸酐
酶活性结构域; 而肽段 RMNTGYGART- PEVKC 与大
豆营养贮藏蛋白质部分肽段匹配，属于酸性磷酸酶结
构域。
2. 2. 2 傅里叶红外光谱分析 36 kDa 银杏 VSPs
的傅里叶红外光谱分析如图 7 所示。36 kDa 银杏
VSPs 在氢键区(4 000 ～ 2 500 cm － 1)存在 2 个峰，其
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林 业 科 学 50 卷
图 5 肽段 KGNAGSLSINRVAYQLKRI 相对丰度
Fig. 5 Relative abundance of peptide KGNAGSLSINRVAYQLKRI
图 6 肽段 RMNTGYGARTPEVKC 相对丰度
Fig． 6 Relative abundance of peptide RMNTGYGARTPEVKC
吸收频率分别为3 420. 25和2 925. 69 cm － 1，前者是
由游离的 N—H 键伸缩振动引起的波长吸收，后者
是由—CH2 结构不对称伸缩振动引起的。这也进一
步说明 36 kDa 银杏 VSPs 中存在 N—H 和—CH2 官
能团，而且这些官能团是蛋白质固有的，在多种蛋白
质中均能检测到。36 kDa 银杏 VSPs 在三键和累积
双键区(2 500 ～ 2 000 cm － 1)出现 1 个峰，其吸收频
率为2 141. 13 cm － 1，主要由伸缩振动的 C≡C 键所
引起的波长吸收，但是该峰的透过率不高，说明 36
kDa 银杏 VSPs 结构中三键所占比例不高。36 kDa
银杏 VSPs 在双键区(2 000 ～ 1 500 cm － 1 )也出现 2
个峰，分别是由 C C 键(1 635. 49 cm － 1 )和—NO2
(1 540. 77 cm － 1 ) 基团的伸缩引起的波长吸收。
36 kDa银杏 VSPs 在 C—H 键弯曲伸缩区 (1 500 ～
1 300 cm － 1 )存在 2 个峰，分别由—CH2 (1 461. 09
cm － 1)和—CH3 (1 389. 47 cm
－ 1 ) 的弯曲伸缩引起。
此外，36 kDa 银杏 VSPs 在指纹区 ( 1 300 ～ 400
cm － 1)也存在 2 个峰(1 046. 48和 554. 15 cm － 1 )，前
者透过率较大，是由羧基中的 C O 的伸缩振动形
成，后者则是由 C—Br 的伸缩引起的特征峰，这 2 个
峰可以作为 36 kDa 银杏 VSPs 的特征吸收峰。
此外，在红外光谱中沿着多肽骨架的1 700 ～
1 600 cm － 1之间，酰胺 I 带与羰基( C O 键)的拉伸
振动相关结果可以预测蛋白质的二级结构。36 kDa
04
第 2 期 吴彩娥等: 银杏营养贮藏蛋白质的分离纯化与结构鉴定
银杏 VSPs 在此范围内仅有 1 个明显的峰，其峰值
(1 635. 49 cm － 1 ) 与 β － 折叠构象的特征曲线
(1 640 ～ 1 630 cm － 1)相吻合，因此可推测 36 kDa 银
杏 VSPs 的二级结构以 β －折叠构象为主。
图 7 36 kDa 银杏 VSPs 红外光谱分析
Fig． 7 FT-IR spectra of 36 kDa ginkgo VSPs
3 讨论
在蛋白质纯化工艺中，离子交换色谱的使用率
占 75% 以 上。本 文 采 用 离 子 交 换 剂 DEAE-
Sepharose FF 对银杏贮藏蛋白质进行分离纯化，但
是没有获得高纯度的银杏贮藏蛋白质。张允允等
(2011)采用 2 次葡聚糖 Sephadex G-100 层析，得到
了高纯度的藻蓝蛋白质。本试验参考目标蛋白的分
子质量后选用 Sephadex G-75 作为填料，对含银杏
VSPs 的组分Ⅳ进行了进一步分离，得到峰 2 和峰 3，
经电泳分析结果表明: 峰 2 中仅有 36 kDa 1 条蛋白
带，已经达到了电泳纯度;而峰 3 中除了 32 kDa 目
标蛋白，还存在较多杂蛋白，需要进一步分离纯化。
由于木本植物的 VSPs 结构信息在蛋白质库中
很少被采集，本研究获得的 36 kDa 银杏 VSPs 在蛋
白质库中也没有完全匹配的蛋白质。但是，与不同
来源的贮藏蛋白质相似的序列比较后发现，36 kDa
的银杏 VSPs 具有碳酸酐酶 ( carbonic anhydrase，
CA)和酸性磷酸酶 ( acid phosphatase，ACP)相似的
氨基酸序列。碳酸酐酶能催化碳酸分解为二氧化碳
和水，在植物体中参与 CO2 传导而进入羧化位点，
其活性高低显著影响光合作用(黄瑾等，2010)。已
有研究表明光合作用与 CA 活性呈正相关，据此推
测，银杏 VSPs 可能具有光合作用酶的作用，为银杏
芽萌发提供能量。酸性磷酸酶作为植物中重要的水
解酶，与碳水化合物的转化、蛋白质的合成和有机磷
的分解均有着密切的关系。银杏 VSPs 的肽段
KGNAGSLSINRVAYQLKRI 与大豆贮藏蛋白质结构
中 ACP 功能域的氨基酸序列相，可能也具有 ACP
活性，因而可参与秋冬季银杏有机磷元素的富集。
傅里叶红外光谱结果表明: 银杏 VSPs 中除了
共有的—CH2，N—H， C C，C≡C 等官能团之外，
还发现了溴离子和硝基等特殊官能团，但是鉴于试
验条件所限，未能对这些官能团作进一步的功能研
究。蛋白质二级结构预测认为 36 kDa 银杏 VSPs 以
β －折叠为主要的二级构象，且未发现明显的 α －螺
旋的特征波峰，这有待进一步分析。
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(责任编辑 王艳娜 郭广荣)
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