全 文 ：第 wu卷 第 y期
u s s y年 y 月
林 业 科 学
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∏±qou s s y
紫椴 Œ≥≥•2°≤• 反应体系的建立与优化
穆立蔷 刘赢男 冯富娟 杨国亭
k东北林业大学 哈尔滨 txsswsl
摘 要 } 分别采用单因子试验和正交设计 u种方法对影响紫椴 Œ≥≥•p°≤• 反应体系的 w个因素kפ´ 酶 oªun o
§‘×°o引物l在 v个水平上进行优化试验 ∀正交设计选用 |kvwl方案 o采用直观分析法获得影响因素最佳反应水
平 ∀单因子试验分别研究各因素对 Œ≥≥•p°≤• 反应的影响情况 o找出最佳反应水平 ∀u种方法所得影响因素最佳水
平存在差异 o通过综合比较与分析 o最终建立了紫椴 Œ≥≥•p°≤• 的最佳反应体系 }在 us ˏ的反应体系中 oפ´ 酶 t1s
˜ oªun u1s °°²¯#pt o§‘×° s1us °°²¯#pt o引物 s1w Λ°²¯#pt ot ≅ °≤• ¥∏©©¨µovs ±ª模板 ⁄‘„ ∀在此基础上筛选出
tw个扩增稳定 !多态性丰富的 Œ≥≥• 引物 o并通过梯度 °≤• 试验 o确定引物最佳退火温度 ∀
关键词 } 紫椴 ~Œ≥≥•p°≤• ~正交设计 ~单因子试验 ~梯度 °≤•
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylsy p ssuy p sy
收稿日期 }ussx p ts p us ∀
基金项目 }国家林业局野生动植物保护基金资助项目/紫椴保护与救护0kstswtvuxyl ∀
Εσταβλισηµεντ ανδ Οπτιµιζατιον οφ ΙΣΣΡpΠΧΡ Ρεαχτιον Σψστεµ φορ Τιλια αµυρενσισ
∏¬´¬¤±ª ¬∏≠¬±ª±¤± ƒ ±¨ªƒ∏­∏¤± ≠¤±ªŠ∏²·¬±ª
k Νορτηεαστ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Ηαρβιν txsswsl
Αβστραχτ} ‘²º¤§¤¼¶o·«¨µ¨ ¤µ¨ ·º² °¨ ·«²§¶·²²³·¬°¬½¨ Œ≥≥•p°≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±¶¼¶·¨°o²±¨ ¬¶¤¶¬±ª¯¨©¤¦·²µ·¨¶·o¤±§·«¨
²·«¨µ¬¶²µ·«²ª²±¤¯ §¨¶¬ª±qŒ±·«¬¶¶·∏§¼o·º² °¨ ·«²§¶º¨ µ¨ ∏¶¨§·²²³·¬°¬½¨ Œ≥≥•p°≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±¶¼¶·¨° ²± Τιλια αµυρενσισ
¬±·«µ¨¨¯¨ √¨ ¶¯²©©²∏µ©¤¦·²µ¶kפ´ ⁄‘„ ³²¯¼°¨ µ¤¶¨ o ªun o§‘×°o³µ¬°¨ µlµ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ qƒµ²°·«¨ µ¨¶∏¯·¶º¨ ©²∏±§·«¤··«¨µ¨
º¨ µ¨ ¶²°¨ §¬©©¨µ¨±¦¨¶¥¨·º¨ ±¨·«¨ ·º² °¨ ·«²§¶¬± ¶∏¬·¤¥¯¨¯¨ √¨ ¶¯²©©¤¦·²µ¶q׫µ²∏ª«·«¨ §¨ ³¨ ¤±¤¯¼½¨ o¤¶∏¬·¤¥¯¨Œ≥≥•p°≤•
µ¨¤¦·¬²±¶¼¶·¨° º¤¶ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨§o±¤°¨ ¼¯ us ˏµ¨¤¦·¬²±¶¼¶·¨° ¦²±·¤¬±¬±ªt1s ˜ פ´ ⁄‘„ ³²¯¼°¨ µ¤¶¨ ou1s °°²¯#pt ªun o
s1us °°²¯#pt §‘×°os1w Λ°²¯#pt ³µ¬°¨ µot ≅ °≤• ¥∏©©¨µovs ±ª⁄‘„ ·¨°³¯¤·¨qtw ³µ¬°¨ µ¶º¬·«¶·¤¥¯¨¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ¤±§
µ¬¦«³²¯¼°²µ³«¬¶°©²µŒ≥≥• º¨ µ¨ ¶¦µ¨ ±¨¨ §q׫¨ ²³·¬°¤¯ ¤±±¨ ¤¯¬±ª·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ©²µŒ≥≥•p°≤• µ¨¤¦·¬²± º¤¶³µ²³²¶¨§¥¼ ªµ¤§¬¨±·
°≤• q׫¨ µ¨¶∏¯·³µ²√¬§¨§¤¶·¤±§¤µ§¬½¬±ªŒ≥≥•p°≤• ³µ²ªµ¤°©²µ·«¨ ¤±¤¯¼¶¬¶²©ª¨ ±¨·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼ ²© Τq αµυρενσισq
Κεψ ωορδσ} Τιλια αµυρενσισ~Œ≥≥•p°≤• ~²µ·«²ª²±¤¯ §¨¶¬ª±~¶¬±ª¯¨©¤¦·²µ·¨¶·¶~ªµ¤§¬¨±·°≤•
紫椴k Τιλια αµυρενσισl种群是东北植被区红松阔叶林群落的主要伴生种群及人工天然复合群落的优良混
交组分k聂绍荃等 ot||ul ∀紫椴用途广泛 o经济价值高 o不仅是重要的蜜源树种k徐万林 ot|{vl o而且是优质
胶合板及细木加工的重要树种 ∀在国务院批准的5国家重点保护野生植物名录k第一批l6中 o紫椴被列为国
家µ级保护植物 ∀目前 o关于紫椴的研究主要集中在种群生态k聂绍荃等 ot||ul !育种造林k邹学忠等 o
t||xl !种子解剖k杜凤国等 ot||wl等方面 o而对于其分子生物学方面的研究尚属空白 ∀
Œ≥≥• kŒ±·¨µp≥¬°³¯¨≥¨ ∏´¨ ±¦¨ • ³¨¨ ¤·l又称简单序列重复区间扩增 o是近年来在微卫星技术上发展起来的一
种新型分子标记技术 ∀由于具有多态性高 o稳定性好 o不需预知基因序列 o检测快速 o产物特异性强 o⁄‘„用
量少 o技术要求低 o技术成本低等特点k段昌群 ousswl o现已在物种的遗传多样性与遗传结构k…¤µ·« ετ αλqo
ussul !无性系植物的遗传多样性k∞¶¶¨¯°¤± ετ αλqot|||l !物种形成和种质鉴定k„±§µ¨¤ ετ αλqot||{l等研究领
域得到了广泛应用 ∀不足之处在于稳定性易受到 פ´ 酶 !ªun !引物 !退火温度等多个因素的影响 o°≤• 扩增
的最适反应条件需要一定时间摸索 ∀因此 o在利用 Œ≥≥• 技术进行遗传多样性分析时 o为保证结果的清晰 !可
靠和准确 o必须对反应体系进行优化 ∀
目前 o对 Œ≥≥•p°≤• 反应体系进行优化主要采用单因子试验和正交设计 u种方法 ∀单因子试验是指分别
研究影响因素对 Œ≥≥•p°≤• 反应的影响情况 o找出各自的合适条件 o通过各因素的组合建立 Œ≥≥•p°≤• 反应的
最优体系 ∀目前 o此方法已被广泛应用于 °≤• 反应体系的优化中 ∀何正文等kt||{l首次将试验统计学上的
正交设计应用到 °≤• 反应体系优化中 o综合考查各因素及其交互作用并快速找到影响因素的最佳水平组
合 ∀此后 o谢运海等kussxl !王彦华等kusswl也采用正交设计分别对水曲柳k Φραξινυσ µανδσηυριχαl和不结球
白菜k Βρασσιχα χαµπεστρι󶶳q χηινενσισl的 Œ≥≥•p°≤• 反应体系进行了优化 o确立了较为可靠的反应体系 ∀
表 1 紫椴 ΙΣΣΡ−ΠΧΡ 反应中的影响因素水平
Ταβ .1 Φαχτορσ ανδ λεϖελσ οφ ΠΧΡ ρεαχτιον
影响因素
ƒ¤¦·²µ¶
母液浓度
≤²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²©
¶·²¦®¬±ª¶²¯∏·¬²±
因素水平k体系终浓度l
¨√¨ ¶¯kƒ¬±¤¯ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±l
t u v
פ´ 酶 פ´ ⁄‘„ ³²¯¼°¨ µ¤¶¨Π≈˜#kus ˏlpt  tss t1s t1x u1s
ªunΠk°°²¯#ptl ux t1x u1s u1x
§‘×°Πk°°²¯#ptl u1x s1tx s1us s1ux
引物 °µ¬° µ¨ΠkΛ°²¯#ptl s1x s1v s1w s1x
表 2 ΠΧΡ 正交试验设计表
Ταβ .2 Ορτηογοναλ δεσιγν φορ ΠΧΡ
编号
‘²q
影响因素 ƒ¤¦·²µ¶
פ´ 酶
פ´ ⁄‘„ ³²¯¼°¨ µ¤¶¨Π≈˜#kus ˏlpt 
ªunΠ
k°°²¯#ptl
§‘×°Π
k°°²¯#ptl
引物 °µ¬°¨ µΠ
kΛ°²¯#ptl
t t1s t1x s1tx s1v
u t1s u1s s1us s1w
v t1s u1x s1ux s1x
w t1x t1x s1us s1x
x t1x u1s s1ux s1v
y t1x u1x s1tx s1w
z u1s t1x s1ux s1w
{ u1s u1s s1tx s1x
| u1s u1x s1us s1v
本研究分别采用 u种方法对影响紫椴 Œ≥≥•p°≤• 反应体系的 w个主要因素kפ´ 酶用量 !ªun浓度 !§‘×°
浓度 !引物浓度l在 v个水平上进行优化试验 o通过对 u种试验方法的综合比较与分析 o选取最佳因素水平 o
建立紫椴 Œ≥≥•p°≤• 最佳反应体系 o并为今后 °≤• 反应体系优化方法的选择提供必要参考 ∀同时 o根据最佳
体系筛选出 tw个扩增稳定 !多态性丰富的 Œ≥≥• 引物 o通过梯度 °≤• 确定引物的最佳退火温度 ∀最后 o对扩
增反应的延伸时间以及循环次数进行优化 o得到了紫椴 Œ≥≥•p°≤• 反应的最佳扩增程序 o为今后紫椴地理种
源的群体遗传多样性研究及系统保护提供分子水平上的借鉴与参考 ∀
t 材料与方法
111 材料
ussw年 ts月底采集辽宁省凤城市 o吉林长白山国家自然保护区 o黑龙江省宁安市 !勃利县 !伊春市和内
蒙古自治区大杨树林业局 y个地区紫椴的 t年生枝条 o样本个体间距大于 xs ° o置于实验室内水培 o采集新
生叶片 o置于 p us ε 冰箱中备用 ∀
112 主要试剂及仪器
用于 Œ≥≥•p°≤• 反应的 §‘×° !פ´ 酶 !标准分子量k ¤µ®¨µl⁄usss 购自 פŽ¤•¤公司 oªun 购自 …Œ
ƒ µ¨°¨ ±·¤¶∀引物参照加拿大哥伦比亚大学k˜…≤l提供的 Œ≥≥• 引物序列k张青林等 ousswl o上海生工公司合
成 ∀°≤• 反应在美国 公司的 °×≤2uss型 °≤• 循环仪上进行 ∀试验于东北林业大学林木遗传育种学科实
验室内完成 ∀
113 方法
t1v1t 基因组 ⁄‘„提取 采用改良的 ≤ׄ…法k王军等 ousssl提取基因组 ⁄‘„ os1{ h琼脂糖凝胶电泳检
测 o∞³³¨ ±§²µ©公司生产的 …¬² °«²·²°¨ ·¨µ核酸检测仪检测 ⁄‘„溶液浓度与纯度 o并将浓度稀释至 vs ±ª#ˏpt ∀
t1v1u Œ≥≥•p°≤• 反应因素水平的确定与正交表的设计 针对影响 °≤• 反应的 פ´ 酶 !ªun !§‘×° !引物 w
个因素 o选用 |kvwl正交表在 v个水平上试验 ∀引物为 {tskŠ„l{× o参加 °≤• 反应的因素水平见表 t o|kvwl
正交设计方案k王希田等 ot|||l见表 u ∀
将表 u的 |个处理重复 v次 o进行扩增反应 ∀反应体系总体积为 us ˏo除上述变化因素外 o还含有 t ≅
°≤• ¥∏©©¨µovs ±ª模板 ⁄‘„ ∀反应条
件参考红松 k Πινυσ κοραιενσισlŒ≥≥•p
°≤• 反应程序k冯富娟等 ousswl }|w
ε 预变性 x °¬±o|w ε 变性 vs ¶oxu ε
退火 wx ¶ozu ε 延伸 u °¬±o循环 ws
次 ozu ε 延伸 z °¬±ow ε 保存 ∀ °≤•
产物用 t1x h 琼脂糖凝胶电泳检测 o
∞… 染色 o Š¨ ±¨ Š¨ ±¬∏¶公司的 …¬²
Œ°¤ª¬±ª≥¼¶·¨° 成像 ∀对结果进行直
观分析 o得到紫椴 Œ≥≥•p°≤• 反应各影
响因素的最佳水平 ∀
t1v1v 单因子试验 根据表 t中各
影响因素水平分别研究 w个因素对
Œ≥≥•p°≤• 反应体系的影响 o每个因素
水平做 v 次重复 ∀Œ≥≥•p°≤• 反应体
系及扩增程序与正交试验相同 o°≤•
产物用 t1x h 琼脂糖凝胶电泳检测 o
∞… 染色 o Š¨ ±¨ Š¨ ±¬∏¶ 公司的 …¬²
Œ°¤ª¬±ª≥¼¶·¨° 成像 ∀对结果进行直
zu 第 y期 穆立蔷等 }紫椴 Œ≥≥•2°≤• 反应体系的建立与优化
观评价 o并与正交试验结果进行比对 o建立紫椴 Œ≥≥•p°≤• 反应的最佳体系 ∀
t1v1w 引物筛选 从 y个种源中分别选取 u个模板 o在优化好的反应体系中进行扩增筛选 ∀
t1v1x 退火温度的确定 根据所选引物序列计算理论退火温度 Τµ oΤµ € wkŠ n ≤l n uk„ n ×lk卢圣栋 o
t|||l o设定退火梯度≈k Τµ ? yl ε   o仪器自动形成 t ∗ tu个梯度 o确定最佳退火温度 ∀
u 结果与分析
211 ΠΧΡ 正交设计直观分析
根据 |kvwl正交试验 °≤• 产物电泳结果k图 tl o按照遗传多样性分析要求 o对 °≤• 扩增结果从高到低依
次打分 ∀条带数量丰富 !清晰度高的最佳产物记为 |分 o与此相反 o最差的记为 t分 ∀|个组合的分数依次
为 }y !z !x !w !| !u !{ !t !v ∀根据分数求出每个因素同一水平下的试验值之和 Κι以及每一因素水平下的数据平
均值 κι o并求出同一因素不同水平间平均值的极差 Ρk表 vl ∀
图 t 正交试验 °≤• 产物电泳结果
ƒ¬ªqt ∞¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶²©²µ·«²ª²±¤¯ §¨¶¬ª± °≤• ³µ²§∏¦·¶
t ∗ | }处理编号同表 u ×µ¨¤·°¨ ±·‘²q¤¶¶«²º §¨¬± פ¥qu ~  }标准分子量 ⁄usss ¤µ®¨µ⁄usss q
表 3 正交设计直观分析
Ταβ .3 Ιντυιτιϖε αναλψσισ οφ ορτηογοναλ δεσιγν
结果
• ¶¨∏¯·¶
影响因素 ƒ¤¦·²µ¶
פ´ 酶
פ´ ⁄‘„ ³²¯¼°¨ µ¤¶¨ ª
un §‘×° 引物°µ¬° µ¨
Κt t{ t{ | t{
Κu tx t| tw tz
Κv tu ts uu ts
κt y y v y
κu x t|Πv twΠv tzΠv
κv w tsΠv uuΠv tsΠv
Ρ u v tvΠv {Πv
极差 Ρ 反映了影响因素对反应体系的影
响情况 oΡ越大 o影响越显著 ∀由表 v可知各因
素水平的变化对紫椴 °≤• 反应的影响从大到
小依次为 }§‘×° !ªun !引物 !פ´ 酶 ∀
每一因素水平下的数据平均值 κι反映了
影响因素各水平对反应体系的影响情况 oκι值
越大 o反应水平越好 ∀由表 v可知 Œ≥≥•p°≤• 反
应中 w个影响因素的最佳反应水平为 }פ´ 酶
t1s ˜ oªun u1s °°²¯ # pt o§‘×° s1ux °°²¯ #
pt o引物 s1v Λ°²¯#pt ∀w个因素的最佳水平
组合并没有在正交表中出现 o但与分值最高的 x号组合接近 o仅 פ´ 酶的用量不同 ∀因此 o在使用正交设计
进行反应体系优化时 o可根据电泳结果直接选择 o不经过直观分析 o也能够得到较好的反应体系 ∀
212 单因子试验结果分析
u1u1t פ´ 酶用量对 Œ≥≥•p°≤• 的影响 酶的用量是影响 °≤• 的一个重要因素 o浓度过低不能扩增 o浓度太
高产生非特异性扩增 ∀本试验从 t1s ˜ ot1x ˜ ou1s ˜ v个水平分别进行扩增k图 ul o发现 v个 פ´ 酶用量所
得到的扩增结果不一致 o随着 פ´ 酶用量的增加 o多态性逐渐降低 o扩增条带减弱 o清晰度下降 ∀当 פ´ 酶用
量为 t1s ˜时 o扩增条带明显好于其他 u个水平 o这与正交试验中 פ´ 酶的最佳水平相一致 ∀因此确定 t1s
˜为 Œ≥≥•p°≤• 反应体系中 פ´ 酶的最佳用量 ∀
u1u1u §‘×°浓度对 Œ≥≥•p°≤• 的影响 §‘×°是 °≤• 的原料 o浓度过高会产生错误掺入 o浓度太低导致产率
下降 ∀从图 v中可以看出 o§‘×°浓度为 s1tx °°²¯#pt时不能扩增相对分子质量较大的条带 o浓度为 s1ux
°°²¯#pt时扩增条带弱 ∀浓度为 s1us °°²¯#pt时条带清晰 o多态性好 o为反应最优水平 ∀而在正交试验中
§‘×°的最佳浓度为 s1ux °°²¯#pt o且 v个水平间的差异显著 ∀由于 Œ≥≥•p°≤• 反应体系中每种 §‘×°的终
浓度在 s1su ∗ s1us °°²¯#pt范围内时 o°≤• 产物量 !特异性与合成忠实性间的平衡最佳k周延清 oussxl ∀因
{u 林 业 科 学 wu卷
图 u 不同水平 פ´ 酶及 §‘×°的 Œ≥≥•p°≤• 电泳结果
ƒ¬ªqu ∞¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶µ¨¶∏¯·¶²©Œ≥≥•p°≤• º¬·«§¬©©¨µ¨±·¯ √¨¨¯¶²©×¤´ ⁄‘„ ³²¯¼° µ¨¤¶¨ ¤±§§‘×°
t ∗ v }פ´ ⁄‘„聚合酶用量分别为 t ˜ ot1x ˜ ou ˜ פ´ ⁄‘„ ³²¯¼°¨ µ¤¶¨ ²©t ˜ ot1x ˜ ou ˜ ~ w ∗ y }§‘×°浓度分别
为 s1tx os1us os1ux °°²¯#pt §‘×° ²©s1tx os1us os1ux °°²¯#pt ~  }标准分子量 ⁄usss ¤µ®¨µ⁄usss q
此选择 s1us °°²¯#pt作为 Œ≥≥•p°≤• 反应体系中 §‘×°的最佳浓度 ∀
u1u1v ªun浓度对Œ≥≥•p°≤• 的影响 ªun浓度是影响 °≤• 结果的重要因素之一 ∀ ªun不仅影响 פ´ 酶活
性 o还能与反应液中的 §‘×° !引物及模板相结合 o影响引物与模板的结合效率 !产物特异性及引物二聚体的
形成k席嘉宾等 ousswl ∀从图 v中可以看出 ªun浓度在 t1x !u1s !u1x °°²¯#pt v个水平间扩增无显著差异 o
同时正交试验结果表明 ªun浓度在 t1x和 u1s °°²¯#pt时对 °≤• 反应结果影响基本一致 ∀因此选择 u1s
°°²¯#pt作为 Œ≥≥•p°≤• 反应体系中 ªun的最佳浓度 ∀
图 v 不同水平 ªun及引物的 Œ≥≥•p°≤• 电泳结果
ƒ¬ªqv ∞¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶µ¨¶∏¯·¶²©Œ≥≥•p°≤• º¬·«§¬©©¨µ¨±·¯ √¨¨ ¶¯²© ªun ¤±§³µ¬°¨ µ
t ∗ v } ªun浓度分别为 t1x ou1s ou1x °°²¯#pt ªun ²©t1x ou1s ou1x °°²¯#pt ~ w ∗ y }引物浓度分别为
s1v os1w os1x Λ°²¯#pt °µ¬°¨ µ²©s1v os1w os1x Λ°²¯#pt ~  }标准分子量 ⁄usss ¤µ®¨µ⁄usss q
图 w Œ≥≥•p°≤• 最佳反应体系扩增结果
ƒ¬ªqw ∞¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶µ¨¶∏¯·¶²©¶∏¬·¤¥¯¨
Œ≥≥•p°≤• µ¨¤¦·¬²± ¶¼¶·¨°
t1 凤城 ƒ ±¨ª¦«¨ ±ª~u1 长白山国家自然保护区 ≤«¤±ª¥¤¬‘¤·¬²±¤¯
‘¤·∏µ¨ • ¶¨¨µ√¨~v1 勃利县 …²¯¬≤²∏±·¼~w1 宁安市 ‘¬±ªπ¤±~
x q伊春市 ≠¬¦«∏±~y1大杨树林业局 ⁄¤¼¤±ª¶«∏ƒ²µ¨¶·µ¼
…∏µ¨¤∏q  }标准分子量 ⁄usss ¤µ®¨µ⁄usss1
u1u1w 引物浓度对 Œ≥≥•p°≤• 的影响 引物浓度关系到
扩增产物的质量 o浓度偏高会引起错配和非特异性产物
扩增 o增加引物二聚体的形成几率 ∀浓度太低则无法进
行有效扩增 ∀从图 w中可以看出在各引物浓度下 o都能
扩增出一致的条带 o随着引物浓度的升高 o扩增条带由弱
到强 ∀当浓度为 s1w Λ°²¯ #pt时 o反应稳定 o条带清晰 ∀
在正交试验中引物浓度在 s1v与 s1w Λ°²¯#pt时平均值
κι十分接近 o说明 u个水平对反应体系的影响无明显差
别 o因此选择 s1w Λ°²¯#pt作为 Œ≥≥•p°≤• 反应体系中引
物的最佳浓度 ∀
综上所述 o本试验得到紫椴 Œ≥≥•p°≤• 反应的最佳体
系 }פ´ ⁄‘„聚合酶 t1s ˜ oªun u1s °°²¯#pt o§‘×° s1us
°°²¯#pt o引物 s1w Λ°²¯ #pt ot ≅ °≤• ¥∏©©¨µovs ±ª模板
⁄‘„ ∀用其对紫椴群体的模板 ⁄‘„进行扩增 o取得了较好的扩增效果k图 wl ∀
213 引物筛选及退火温度的确定
Œ≥≥•p°≤• 扩增 o退火温度明显影响扩增谱带式样k姜静等 oussvl ∀而有些研究学者则认为 o不论引物组
成如何均采用 xs ∗ xu ε 退火温度 o也能获得清晰的谱带k邹喻苹等 ot||{l ∀本试验根据紫椴 Œ≥≥•p°≤• 反应
的最佳体系 o从 tss个 Œ≥≥• 引物中筛选出 tw个扩增稳定 !重复性强的引物用于 °≤• 扩增k表 wl ∀再针对筛
|u 第 y期 穆立蔷等 }紫椴 Œ≥≥•2°≤• 反应体系的建立与优化
图 x 引物梯度退火电泳图
ƒ¬ªqx ׫¨ ©¨©¨¦·²©¤±±¨ ¤¯¬±ª·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ²± Œ≥≥• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±
t ∗ tu }退火温度依次为 ≤²µµ¨¶³²±§¬±ª·²wy1s owy1v owz1t ow{1s ow|1w oxt1t oxv1u oxw1| oxy1u oxz1t oxz1{ ox{1s ε q
选出的引物逐个进行梯度退火试验 o确定引物的最佳退火温度k表 wl ∀图 x 为引物 {txk≤×l{ Š的梯度退火
°≤• o从图中可以看出 o退火温度过低 o扩增特异性差 o杂带较多 o背景深 ~退火温度过高 o引物与模板结合差 o
电泳条带弱 o甚至没有扩增 ∀对其他引物进行梯度 °≤• o也得到同样结果 ∀在选择最佳退火温度时 o如扩增
结果相近 o宜选择较高退火温度 o以提高反应的特异性 ∀
表 4 ΙΣΣΡ 引物序列和最佳退火温度( Τµ) ≠
Ταβ .4 ΙΣΣΡ πριµερ σεθυενχεσ ανδ συιταβλε αννεαλινγ τεµ περατυρε ( Τµ )
引物
°µ¬°¨ µ
引物序列
°µ¬°¨ µ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶
理论退火温度
„¦¤§¨ °¬¦ ΤµΠε
最佳退火温度
≥∏¬·¤¥¯¨ ΤµΠε
引物
°µ¬° µ¨
引物序列
°µ¬° µ¨¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶
理论退火温度
„¦¤§¨ °¬¦ ΤµΠε
最佳退火温度
≥∏¬·¤¥¯¨ ΤµΠε
{sz k„Šl{× xs xs1u {vx k„Šl{ Š≤ xy xt1w
{ts kŠ„l{× xs xt1t {vy k„Šl{ ≠„ xw w|1w
{tv k≤×l{× xs xt1t {ww k≤×l{ Š≤ xy xs1u
{tw k≤×l{ „ xs xt1t {wy k≤„l{ • × xu xt1t
{tx k≤×l{ Š xu xt1u {w{ k≤„l{ „Š xw xt1w
{t{ k≤„l{ Š xu xu1| {xy k„≤l{ ≠„ xw w|1w
{vw k„Šl{ ≤× xw xv1u {x| k׊l{ • ≤ xw w|1w
≠ • 代表 „和 × o≠ 代表 Š和 ≤ ∀ • ¶·¤±§¶©²µ„ ¤±§× ~ ≠ ¶·¤±§¶©²µŠ ¤±§≤ q
图 y 不同延伸时间 Œ≥≥•p°≤• 电泳结果图
ƒ¬ªqy ∞¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶µ¨¶∏¯·¶²©Œ≥≥•p°≤• º¬·«
§¬©©¨µ¨±·¨ ¬·¨±¶¬²±·¬°¨
t ∗ w }延伸时间分别为 wx ¶ot °¬±ot1x °¬±ou °¬±∀
∞¬·¨±¶¬²± ¤·wx ¶ot °¬±ot1x °¬±ou °¬±q
 }标准分子量 ⁄usss ¤µ®¨µ⁄usss q
214 延伸时间对 ΙΣΣΡ−ΠΧΡ 的影响
在 Œ≥≥•p°≤• 反应中延伸温度一般为 zu ε o除了退火温度外 o延伸时间是另外一个重要的影响因素 ∀延
伸时间的长短与扩增片断的长度呈正相关k冯富娟等 ousswl ∀时间过短 o无法完成扩增 o产量低 ~时间过长 o
会产生非特异扩增 ∀本试验进行了 wx ¶!t °¬± !t1x °¬±和 u °¬± w种尝试 o发现在 u °¬±时 o获得了稳定扩增 o
并且在 uxs ¥³明显扩增出了多态性条带 ∀因此 o在本研究中采用 u °¬±的延伸时间 ∀
215 循环次数对 ΙΣΣΡ−ΠΧΡ 的影响
选择适宜的循环次数将会获得良好的扩增图谱 ∀从理论上说 o循环次数越多 o扩增产物产率越高 o但实
际上会受到各反应成分的用量限制 ∀在原来的反应程序的基础上 o其他条件不变 o分别试验了 vs !vx !ws !wx
个循环对扩增结果的影响 ∀发现随着循环次数的增加 o扩增产物的量也增多 o相比之下 ows个循环得到的条
带强弱合适 o清晰可辨 o为最佳循环次数 ∀
v 讨论
Œ≥≥•p°≤• 反应对模板浓度的要求范围较宽 ∀冯富娟等
kusswl在进行红松 Œ≥≥•p°≤• 反应体系优化时证实模板纯度不会
影响扩增结果 o模板浓度在 ts ∗ uss ±ª#ˏpt之间扩增结果相同 ∀
因此 o本研究在进行优化时没有考虑模板纯度和浓度对反应体系
的影响 o而是直接采用 vs ±ª#ˏpt作为模板浓度进行 °≤• 扩增 o
取得了良好的扩增效果 ∀
本研究针对目前常见的 u种 Œ≥≥•p°≤• 试验方法进行反应体
系优化 o发现利用正交设计直观分析法 o能够迅速获得满意的试
验结果 ∀但该方法也存在一定的局限性 o如对试验结果本身的评
价带有主观成分 o打分的先后次序直接影响分析结果 o使影响因
sv 林 业 科 学 wu卷
素最佳反应水平的确定缺乏可靠性 ∀本试验在正交设计中认为 §‘×°浓度对反应体系影响最大 oפ´ 酶影响
最小 ∀而在单因子试验中则发现 §‘×° !פ´ 酶和引物对反应体系均有显著影响 oªun浓度变化对反应体系
的影响不显著 ∀此外 ou种方法所得到的因素最佳水平也不完全相同 o这既与 °≤• 反应的不稳定性有关 o也
与正交设计采用的主观打分有关 ∀虽然正交设计采用直观分析 o有的研究k谢云海等 oussxl还采用方差分析
法对试验结果进行分析 o但这仍不可避免由主观打分所造成的试验误差 ∀因此 o如果能对 °≤• 扩增结果建
立客观的评价标准 o将会更好地促进该方法的应用 ∀
参 考 文 献
杜凤国 o苏春华 o李云凤 o等 qt||w q紫椴和糠椴种子解剖构造的研究 q吉林林学院学报 otskul }|| p tsu
段昌群 qussw q生态科学进展 }第一卷 q北京 }高等教育出版社
冯富娟 o王凤友 o刘 彤 qussw q红松 Œ≥≥•p°≤• 实验系统影响因素 q植物学通报 outkvl }vuy p vvt
何正文 o刘运生 o陈立华 o等 qt||{ q正交设计直观分析法优化 °≤• 条件 q湖南医科大学学报 ouvkwl }wsv p wsw
姜 静 o杨传平 o刘桂丰 o等 qussv q桦树 Œ≥≥•p°≤• 反应体系的优化 q生态学杂志 ouukvl }|t ∗ |v
卢圣栋 qt||| q现代分子生物学实验技术 qu版 q北京 }中国协和医科大学出版社
聂绍荃 o关文彬 o杨国亭 o等 qt||u q紫椴种群生态学研究 q哈尔滨 }东北林业大学出版社
王 军 o贺普超 qusss q山葡萄基因组 ⁄‘„提取及 • „°⁄鉴定 q果树科学 otzkul }z| p {u
王希田 o温广玉 qt||| q概率论与数理统计 q哈尔滨 }东北林业大学
王彦华 o侯喜林 o徐明宇 qussw q正交设计优化不结球白菜 Œ≥≥• 反应体系研究 q西北植物学报 ouwkxl }{|| p |su
席嘉宾 o郑玉忠 o杨中艺 qussw q地毯草 Œ≥≥• 反应体系的建立与优化 q中山大学学报 }自然科学版 owvkvl }{s p {w
谢运海 o夏德安 o姜 静 o等 qussx q利用正交设计优化水曲柳 Œ≥≥•p°≤• 反应体系 q分子植物育种 ovkvl }wwx p wxs
徐万林 qt|{v q中国蜜源植物 q哈尔滨 }黑龙江科技出版社
张青林 o罗正荣 qussw qŒ≥≥• 及其在果树上的应用 q果树学报 outktl }xw p x{
周延清 qussx q⁄‘„分子标记技术在植物研究中的应用 q北京 }化学工业出版社
邹学忠 o阎忠林 o朴素梅 o等 qt||x q不同立地条件水曲柳 !核桃楸 !紫椴造林的研究 q林业科技通讯 okvl }ty p t{
邹喻苹 o蔡美琳 o王晓东 qt||{ q古代/太子莲0及现代红花中国莲种质资源的 • „°⁄分析 q植物学报 owskul }tyv p ty{
„±§µ¨¤ ⁄ • o ÷¬¤±ª ± ≠ o Ž¨³«¤µ·≥ • qt||{1„¶¶¨¶¶¬±ª«¼¥µ¬§¬½¤·¬²± ¬± ±¤·∏µ¤¯ ³²³∏¯¤·¬²± ²© Πενστεµον k≥¦µ²³«∏¯¤µ¬¤¦¨¤¨ l ∏¶¬±ª«¼³¨µ√¤µ¬¤¥¯¨¬±·¨µp¶¬°³¯¨
¶¨ ∏´¨ ±¦¨ µ¨³¨ ¤·kŒ≥≥• l ¥¤±§¶q²¯ ¦¨∏¯¤µ∞¦²¯²ª¼ oz }ttsz p ttux
…¤µ·«≥ o ¬¨¦«¬±ª¨µ„ ∞o∏¥¥¨µ¶·¨§·× ‹ qussu1 Š¨ ±¨ ·¬¦§¬√ µ¨¶¬·¼ ¬± Αραβιδοπσισ τηαλιανα q ‹ ¼¨±«q¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨§¥¼ ¦¯ ¤¨√¨ §¤°³¯¬©¬¨§³²¯¼°²µ³«¬¦¶¨ ∏´¨±¦¨
k≤„°l ¤±§¬±·¨µp¶¬°³¯¨¶¨ ∏´¨ ±¦¨ µ¨³¨ ¤·kŒ≥≥• l °¤µ®¨µ¶q²¯ ¦¨∏¯¤µ∞¦²¯²ª¼ ott }w|w p xsx
∞¶¶¨¯°¤± ∞o¬¤±´ ¬¤±ªo ≤µ¤º©²µ§ ⁄ o ετ αλqt|||1 ≤¯ ²±¤¯ §¬√¨ µ¶¬·¼ ¬±·«¨ µ¤µ¨ Χαλαµαγροστισ πορτερι ¶¶³q ινσπερατα k°²¤¦¨¤¦¨l }¦²°³¤µ¤·¬√¨ µ¨¶∏¯·¶©²µ
¤¯ ²¯¦¼°¨ ¶¤±§¬±·¨µp¶¬°³¯¨¶¨ ∏´¨ ±¦¨ µ¨³¨ ¤·kŒ≥≥• l °¤µ®¨µ¶q ²¯ ¦¨∏¯¤µ∞¦²¯²ª¼ o{ }wwv p wxt
k责任编辑 徐 红l
tv 第 y期 穆立蔷等 }紫椴 Œ≥≥•2°≤• 反应体系的建立与优化