全 文 ：园艺学报，2015，42 (3)：554–562.
Acta Horticulturae Sinica
554 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1014；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–01–08；修回日期：2015–03–02
基金项目：国家自然科学基金项目（31000908）；国家重点基础研究发展计划（‘973’）项目（2012CB113900）；重庆市自然科学基金项
目（2011BA1002）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2012B020）
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：swausongm@163.com，swutql@163.com）
芥菜开花整合子 SOC1与AGL24蛋白K结构域
的互作位点鉴定
谢 婷*，谷慧英*，江 为，马关鹏，陈 娇，王志敏，宋 明**，汤青林**
（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715）
摘 要：芥菜开花整合子 SOC1 与 AGL24 相互作用能够调节开花时间。为了深入研究 SOC1 与 AGL24
蛋白互作的分子机理，利用 ISIS 系统在线预测了 SOC1/AGL24 互作位点，并分别在 MIKC 型蛋白 SOC1
和 AGL24 的 K 域构建了 5 个 SOC1 突变体和 3 个 AGL24 突变体。酵母双杂交和 β–半乳糖苷酶活性检
测表明：突变体 AGL24R137L和 AGL24E169L能够与 SOC1 蛋白互作，但作用强度与 SOC1/AGL24 差异不显
著；然而 AGL24 蛋白第 107 位的谷氨酰胺突变为亮氨酸后（AGL24Q107L），则与 SOC1 的作用消失。说
明 SOC1/AGL24 的作用强度能够被 AGL24 蛋白 K 域第 107 位调节，但可能不受第 137 和 169 位调控。
进一步研究发现：SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V、SOC1R109L和 SOC1C137K 突变体均能与 AGL24 相互
作用；但 SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V 和 SOC1R109L 突变体与 AGL24 的作用强度均显著低于
SOC1/AGL24，而 SOC1C137K 突变体与 AGL24 的作用显著高于 SOC1/AGL24。说明 SOC1/AGL24 的作用
强度能够被 SOC1 蛋白 K 域第 77、81、108、109 位负调控或者第 137 位正调控。这为利用氨基酸位点调
节 SOC1/AGL24 的深入研究及其开花时间分子调控奠定了基础。
关键词：芥菜；开花调节；SOC1；AGL24；酵母双杂交
中图分类号：S 637.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0554-09

Identification of Interaction Sites in K-domains of Flowering Signal
Integrator SOC1 and AGL24 in Brassica juncea
XIE Ting*，GU Hui-ying*，JIANG Wei，MA Guan-peng，CHEN Jiao，WANG Zhi-min，SONG Ming**，
and TANG Qing-lin**
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University；Key Laboratory of Horticulture Science for
Southern Mountainous Regions，Ministry of Education；Key Laboratory of Olericulture，Chongqing 400715，China）
Abstract：The flowering signal integrator SOC1 can interact with AGL24 in Brassica juncea，which
plays an important role in regulating flowering time. Based on the binding sites in the K-domains of
MIKC-type proteins predicted by ISIS system，we constructed five single-site mutants of SOC1
（respectively named SOC1V77K，SOC1P81K，SOC1K108V，SOC1R109L and SOC1C137K）and three single-site
mutants of AGL24（respectively named AGL24Q107L，AGL24R137L and AGL24E169L）to unravel the

谢 婷，谷慧英，江 为，马关鹏，陈 娇，王志敏，宋 明，汤青林.
芥菜开花整合子 SOC1 与 AGL24 蛋白 K 结构域的互作位点鉴定.
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molecular mechanism of the protein interactions of SOC1 and AGL24. Yeast two-hybrid experiments and
β-galactosidase activity assays showed that mutant of AGL24Q107L could no more interact with SOC1.
However，AGL24R137L and AGL24E169L mutants as well as AGL24 retained similarly strong interacting
with SOC1 protein. So it was suggested that the interactions of SOC1/AGL24 were probably not regulated
by the amino acid sites of 137th or 169th but 107th in the K-domain of AGL24. Further research showed
that mutants of SOC1V77K，SOC1P81K，SOC1K108V，SOC1R109L and SOC1C137K remained interacting with
AGL24 protein. Mutants of SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V and SOC1R109L fused with AGL24 had
significantly low interaction strength compared with SOC1/AGL24. On the contrary，the interaction
strength of SOC1C137K and AGL24 was greatly higher than that of SOC1/AGL24. It was indicated that the
interaction strength of SOC1/AGL24 could be controlled by negative regulation sites of 77th，81st，108th
and 109th amino acids，as well as positive regulation site of 137th amino acid in the K-domain of SOC1
protein. The study provided valuable information for further studies on direct regulation of SOC1/AGL24
and molecular mechanisms of flowering time in Brassica juncea.
Key words：Brassica juncea Coss.；flowering-time control；SOC1；AGL24；yeast two-hybrid system

SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）是一个开花信号整合子，能够
整合春化途径、光周期途径等成花诱导信号，从而调控开花时间（Hepworth et al.，2002；Moon et al.，
2003）。拟南芥 SOC1 主要在叶片和茎尖分生组织表达，其表达量随着发育而增加（Samach et al.，
2000）。SOC1 过量表达引起植株早花，而其功能缺失则导致晚花（Borner et al.，2000）。SOC1 是一
种多功能蛋白，不仅调控开花时间，在花形态建成、花分生组织特异性分化、花器官发育和果实发
育等方面都具有重要调节作用（Liu et al.，2007，2009），这些功能在单子叶植物和双子叶植物中都
保守（Cseke et al.，2003；Ferrario et al.，2004；Lee et al.，2004）。Ding 等（2013）在石斛兰中克
隆了与 SOC1 高度同源的基因 DOSOC1，将此基因分别转入野生型拟南芥和石斛兰后，DOSOC1 的
过量表达均引起植株早花；将 DOSOC1 转入 soc1-2 功能缺失的拟南芥突变体后，DOSOC1 过量表
达只能轻微的抑制突变体的晚花表型，使开花时间稍微提前。因此，随着不同植物的进化，SOC1
在促进成花转变这一功能上既具有保守性，又具有一定的特异性。
AGAMOUS LIKE24（AGL24）基因是一个开花激活因子，编码典型的 MADS 域蛋白。AGL24
在营养生长期的茎端分生组织、新叶原基的整个区域以及生殖生长期的叶片维管束中表达（Hartmann
et al.，2000）。虽然 AGL24 基因序列与 SVP 高度相似，但是 agl24 突变体的晚花表现型与 soc1 非常
相似（Yu et al.，2002）。AGL24 是 SOC1 的一个正调控因子，AGL24 的超量表达会引起 SOC1 上调
表达；SOC1 的超量表达也可引起 AGL24 上调表达。因此这两者可以彼此正调控（Michaels et al.，
2003）。目前已发现拟南芥 AGL24 蛋白与 SOC1 蛋白存在相互作用（van Dijk et al.，2010），芥菜
AGL24 与 SOC1 蛋白也能互作（江为 等，2014），但 AGL24/SOC1 互作的氨基酸调控位点仍然未知。
芥菜开花时间的早晚会影响产品器官的产量与品质。虽然 SOC1 与 AGL24 能够调节开花时间，
但是它们调控芥菜开花时间的分子机制并不清楚，有关芥菜作物 SOC1/AGL24 蛋白互作的氨基酸位
点仍未见报道。
本试验中分别构建芥菜 SOC1、AGL24 蛋白 K 域的多个突变体，并利用酵母双杂交系统检测芥
菜 SOC1/AGL24 蛋白互作的氨基酸位点，为深入研究 SOC1 和 AGL24 在开花调控网络中的作用机
理奠定基础。
Xie Ting，Gu Hui-ying，Jiang Wei，Ma Guan-peng，Chen Jiao，Wang Zhi-min，Song Ming，Tang Qing-lin.
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1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2014 年 2月至 10月在重庆市蔬菜学重点实验室完成。将芥菜材料‘青叶芥’在RXZ-300D
型智能人工气候箱中种植，光照强度 200 µmol · m-2 · s-1。在 22 ℃ 12 h 光照与 18 ℃ 12 h 黑暗交替
培养幼苗至 4 片真叶时，低温春化（7 ℃ 12 h 光照与 4 ℃ 12 h 黑暗交替）处理 30 d，然后在回温
条件（20 ℃ 12 h 光照与 18 ℃ 12 h 黑暗交替）下生长 5 d 后，剪取茎尖，–80 ℃冰箱保存备用。
1.2 引物设计
依据拟南芥和油菜 SOC1（NCBI 登录号分别为 AFM77891.1 和 NP_182090.1）设计引物 O-L 和
O-R（表 1）用于克隆芥菜 SOC1。依据拟南芥和油菜 AGL24（NCBI 登录号分别为 AF005158 和
JQ906709）设计引物 A-L 和 A-R（表 1）用于克隆芥菜 AGL24。芥菜 SOC1 和 AGL24 均为 MIKC
型蛋白，其蛋白互作有可能发生在 K 域（Kaufmann et al.，2005）。参考 Ofran 和 Bost（2007）的 ISIS
（Interaction Sites Identified from Sequence）方法，在线预测 SOC1 与 AGL24 蛋白相互作用的氨基酸
位点，并选取 SOC1 蛋白 K 域中第 77、81、108、109 和 137 位共 5 个氨基酸位点进行点突变，选
取 AGL24 蛋白 K 域中第 107、137 和 169 位共 3 个氨基酸位点进行点突变。设计 10 条 SOC1 点突
变引物和 6 条 AGL24 点突变引物（表 1）。

表 1 引物序列
Table 1 Primers used in the experiments
引物名称
Primer name
引物序列（5′–3′）
Primer sequence
引物名称
Primer name
引物序列（5′–3′）
Primer sequence
O-L CGCCATATGATGGTGAGGGGCAAAACTCAGATGA O-R CGCGGATCCCTTTCTTGAAGAACAAGGTAACCCA
O1-L CCAAGGATCGTAAGAGCAGCAAACC O1-R TGCTGCTCTTACGATCCTTGGTATG
O2-L CAGCAAAAAGGTTTCTGAAGAAAAT O2-R CTTTTTGCTGCTGACACGATCCTTG
O3-L TCGAAGCTTCCGTACGTAAACTATT O3-R GTACGGAAGCTTCGAGCTGTTCAAT
O4-L CAAACTTAAACTATTGGGAGAAGGC O4-R CTCCCAATAGTTTAAGTTTGGAAGC
O5-L CAAAAAGATTCGAGCAAGAAAGACT O5-R CTTGCTCGAATCTTTTTGACACT
A-L CGCCATATGATGGCGAGAGAGAAGATAAGGATAA A-R CGCGGATCCTCTCTCTCTCAGATTCATTCCCAAG
A1-L ACAAAACCAAGCTGCTCAGACAAAT A1-R TGTCTGAGCAGCTTGGTTTTGTCTT
A2-L TTAGTCTTGTGTCTGAAAAGAAGGG A2-R TCAGACACAAGACTAAGTCCAGATT
A3-L AGACTGAGGCTGCAACTAGTGACGT A3-R GTCACTAGTTGCAGCCTCAGTCTTC
3′AD AGATGGTGCACGATGCACAG 3′BD TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC
T7 TAATACGACTCACTATAGGGCG
注：下划线为 NdeⅠ或 BamHⅠ酶切位点；方框表示突变位点。
Note：Restriction enzymes of NdeⅠor BamHⅠused for cloning are underlined；Mutant sites are enclosed with square frames.

1.3 突变体克隆及其酵母载体构建
以 Ofran 和 Bost（2007）的方法，ISIS 在线预测 SOC1 与 AGL24 蛋白相互作用的氨基酸位点，
并选取蛋白 K 域的氨基预测位点进行点突变（Kaufmann et al.，2005）。采用重叠延伸 PCR 技术共
进行 3 轮次 PCR 克隆突变体（表 2）。在突变体构建时，先分别将第 1、2 轮次的 PCR 产物电泳，
回收目的条带；再等量混合使其互为模板及引物，加入 dNTP 及 Pfu 酶在 PCR 仪上扩增 10 个循环；
并以此次的产物作为第 3 轮次 PCR 的模板，扩增产物琼脂糖凝胶电泳后，OMEGA Gel Extraction 试
剂盒回收目的条带，并连接到 pEASY-Blunt Simple 克隆载体后送 Invitrogen 公司测序。
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芥菜开花整合子 SOC1 与 AGL24 蛋白 K 结构域的互作位点鉴定.
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将 SOC1 基因的突变体质粒以及酵母表达载体 pGBKT7 经 NdeⅠ/BamHⅠ双酶切后连接，构建
酵母重组质粒 pGBKT7-SOC1V77K、pGBKT7-SOC1P81K、pGBKT7-SOC1K108V、pGBKT7-SOC1R109L、
pGBKT7-SOC1C137K。分别经 T7 / 3′BD 引物 PCR 检测以及 NdeⅠ/ BamHⅠ双酶切鉴定后，挑选阳性
克隆送 Invitrogen 公司测序。将 AGL24 基因的突变体质粒经 NdeⅠ/BamHⅠ双酶切后连接到载体
pGADT7，构建酵母融合质粒 pGADT7-AGL24Q107L、pGADT7-AGL24R137L、pGADT7-AGL24E169L。
分别经 T7 / 3′AD 引物 PCR 检测以及 NdeⅠ/ BamHⅠ双酶切鉴定后测序鉴定。

表 2 芥菜 SOC1 与 AGL24 定点突变体的引物组合
Table 2 Primers used for point mutants of SOC1 and AGL24 in Brassica juncea
引物组合 Primers used for PCR 起始模板
Starting template 第 1 轮 PCR
First round PCR
第 2 轮 PCR
Second round PCR
第 3 轮 PCR
Third round PCR
突变氨基酸
Mutant amino acid
突变体
Mutants
SOC1 O-L / O1-R O1-L / O-R O-L / O-R V77K SOC1 V77K
O-L / O2-R O2-L / O-R O-L / O-R P81K SOC1 P81K
O-L / O3-R O3-L / O-R O-L / O-R K108V SOC1 K108V
O-L / O4-R O4-L / O-R O-L / O-R R109L SOC1 R109L
O-L / O5-R O5-L / O-R O-L / O-R C137K SOC1 C137K
AGL24 A-L / A1-R A1-L / A-R A-L / A-R Q107L AGL24 Q107L
A-L / A2-R A2-L / A-R A-L / A-R R137L AGL24 R137L
A-L / A3-R A3-L / A-R A-L / A-R E169L AGL24 E169L


1.4 酵母转化及毒性与自激活检测
参考 Clontech 公司 Gold Yeast Two-Hybrid System 操作手册，采用醋酸锂转化法，将重组质粒
pGADT7-AGL24、pGADT7-AGL24Q107L、pGADT7-AGL24R137L 和 pGADT7-AGL24E169L 分别转入
Y187，获得酵母转化子，并分别涂在SD/-Leu、SD/-Leu/X-α-Gal、SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/X-α-Gal/AbA
固体平板上。将 pGBKT7-SOC1、pGBKT7-SOC1V77K、pGBKT7-SOC1P81K、pGBKT7-SOC1K108V、
pGBKT7-SOC1R109L和 pGBKT7-SOC1C137K分别转入Y2Hgold，获得酵母转化子，并分别涂在SD/-Trp、
SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Leu/-Trp 和 SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 固体平板上。同时以空载体转化子 Y187
（pGADT7）和 Y2Hgold（pGBKT7）为对照，毒性与自激活检测。
1.5 酵母双杂交及 β–半乳糖苷酶活性检测
将 Y187（pGADT7-AGL24Q107L）、Y187（pGADT7-AGL24R137L）和 Y187（pGADT7-AGL24E169L）、
分别与 Y2HGold（pGBKT7-SOC1）融合；将 Y2HGold（pGBKT7-SOC1V77K）、Y2HGold（pGBKT7-
SOC1P81K ）、 Y2HGold （ pGBKT7-SOC1K108V ）、 Y2HGold （ pGBKT7-SOC1R109L ）和 Y2HGold
（pGBKT7-SOC1C137K）分别与 Y187（pGADT7-AGL24）融合。挑取单个阳性融合菌于 500 μL 2×
YPDA 中混匀，30 ℃培养 20 ~ 24 h，4 000 × g 离心后用 1× YPDA 稀释，取适量涂于 DDO
（SD/-Leu/-Trp）固体培养基，30 ℃倒置培养 3 ~ 5 d。再从 DDO 培养基挑取阳性克隆分别涂于
DDO/A（SD/-Leu/-Trp/ AbA）、QDO（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）、QDO/x/A（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/
X-α-Gal/ AbA）固体培养基，30 ℃培养 5 ~ 7 d 观察是否有蓝色菌落。
选取具有相互作用的酵母杂交组合，以 Thermo 公司 Yeast β-Galactosidase Assay Kit 测定酵母
融合菌 OD660 值和 A420 吸光值，重复测 3 次，计算 β–半乳糖苷酶活性。β–半乳糖苷酶活性 =
（1 000 × A420）/（t × V × OD660）。t 为反应时间（min），V 为菌悬液体积（mL），活性单位表示为
‘Miller Units’。
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2 结果与分析
2.1 SOC1 与 AGL24 蛋白 K 域的突变体构建
如图 1 所示，在 SOC1 蛋白 K 域（第 72 ~ 171 位点）选取了 5 个位点（第 77、81、108、109
和 137 位点），AGL24 蛋白 K 域（第 73 ~ 174 位点）选取了 3 个位点（第 107、137 和 169 位点）。
在以上 8 个氨基酸突变位点中，除了 AGL24 蛋白第 169 位点不保守外，其余 7 个位点在甘蓝、白
菜、油菜、拟南芥等十字花科植物 SOC1 或 AGL24 同源蛋白中均完全保守。
利用重叠延伸 PCR 构建了 SOC1 蛋白的 5 个点突变体（SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V、
SOC1R109L 和 SOC1C137K）以及 AGL24 的 3 个点突变体（AGL24Q107L、AGL24R137L和 AGL24E169L）。
其中 SOC1V77K和 SOC1P81K位于 SOC1蛋白K域的 α螺旋之间，而 SOC1K108V、SOC1R109L和 SOC1C137K
则位于 α 螺旋内部；AGL24Q107L、AGL24R137L 和 AGL24E169L 均位于 AGL24 蛋白 K 域的 α 螺旋内部
（图 1）。
将 SOC1 和 AGL24 基因的突变体经 NdeⅠ/ BamHⅠ双酶切后分别构建到 pGBKT7、pGADT7 酵
母载体，获得酵母诱饵质粒（pGBKT7-SOC1V77K、pGBKT7-SOC1P81K、pGBKT7-SOC1K108V、
pGBKT7-SOC1R109L 和 pGBKT7-SOC1C137K ） 和 猎 物 质 粒 （ pGADT7-AGL24Q107L 、 pGADT7-
AGL24R137L、pGADT7-AGL24E169L）。诱饵质粒与猎物质粒分别转入酵母 Y2Hgold、Y187 后均无毒
性，也无自激活现象，完全可用于后续的酵母双杂交研究。



图 1 SOC1 和 AGL24 蛋白的氨基酸突变位点
Fig. 1 Mutant sites in K domains of SOC1 and AGL24

2.2 AGL24 蛋白 K 域的点突变影响 SOC1/AGL24 蛋白互作
将 AGL24 的 3 个突变体与 SOC1 酵母双杂交发现：试验中所有二倍体酵母在 DDO 平板上均可
以长出菌落，但只有 AGL24R137L、AGL24E169L 与 SOC1 的杂交组合能够在 DDO/A、QDO 平板上生
长且菌落呈白色（表 3），而且这 2 个杂交组合还能在 QDO/X/A 平板上长出蓝色菌落（图 2，C1、
D1），其相应阴性对照均不生长（图 2，B2、B3、C2 和 D2）。由此表明：突变体 AGL24R137L、AGL24E169L
均能够与 SOC1 蛋白相互作用，并激活报告基因 HIS3、AUR1-C、ADE2、MEL1 的转录表达。
酵母 β–半乳糖苷酶活性分析表明：第 137 和 169 位点的 AGL24 突变体（AGL24R137L 和
AGL24E169L）的作用强度（酶活性为 3.11 和 3.70 Miller Units）与非突变体 AGL24（酶活性为 4.44 Miller
Units）差异不显著（表 3），说明这 2 个位点可能不会调节 SOC1 与 AGL24 之间的作用强度。

谢 婷，谷慧英，江 为，马关鹏，陈 娇，王志敏，宋 明，汤青林.
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图 2 AGL24 突变体与 SOC1 酵母双杂交检测
酵母双杂交组合参见表 3。
Fig. 2 Protein interactions of AGL24 mutants with SOC1 via
yeast two-hybrid on the QDO/X-α-Gal/AbA plates
Hybrid combinations refer to Table 3.
图 3 SOC 突变体与 AGL241 酵母双杂交检测
酵母双杂交组合参见表 4。
Fig. 3 Protein interactions of SOC1 mutants with AGL24 via
yeast two-hybrid on the QDO/X-α-Gal/AbA plates
Hybrid combinations refer to Table 4.
表 3 AGL24 突变体与 SOC1 相互作用分析
Table 3 Protein interactions of AGL24 mutants with SOC1 in yeast
选择性培养基 Selective agar plates 编号
No.
菌株
Strain DDO DDO/A QDO QDO/X/A
β–半乳糖酶活性
β-galactosidase activity
A1 Y187（pGADT-T）× Y2HGold（pGBKT7-53） 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue /
A2 Y187（pGADT-T）× Y2HGold（pGBKT7-Lam） 白色 White 无 No 无 No 无 No /
B1 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold （pGBKT7-SOC1） 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 4.44 ± 0.74 a
B2 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7） 白色 White 无 No 无 No 无 No /
B3 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1） 白色 White 无 No 无 No 无 No /
C1 Y187（pGADT7-AGL24R137L）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1）白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 3.11 ± 0.04 a
C2 Y187（pGADT7- AGL24R137L） × Y2HGold（pGBKT7） 白色 White 无 No 无 No 无 No /
D1 Y187（pGADT7-AGL24 E169L） × Y2HGold（pGBKT7-SOC1）白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 3.70 ± 0.08 a
D2 Y187（pGADT7-AGL24 E169L）× Y2HGold（pGBKT7） 白色 White 无 No 无 No 无 No /
E1 Y187（pGADT7-AGL24 Q107L）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1）白色 White 无 No 无 No 无 No /
E2 Y187（pGADT7-AGL24 Q107L）× Y2HGold（pGBKT7） 白色 White 无 No 无 No 无 No /
注：显著性水平为 0.05。DDO：SD/-Leu/-Trp；DDO/A：SD/-Leu/-Trp/AbA；QDO：SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp；QDO/x/A：SD/-Ade/-His/-Leu/-
Trp/X-α-Gal/AbA。
Note：The significance level is 0.05. DDO：SD/-Leu/-Trp；DDO/A：SD/-Leu/-Trp/AbA；QDO：SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp；QDO/x/A：SD/-Ade/-
His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/ AbA.

但是，突变体 AGL24Q107L 与 SOC1 融合后
不能在 DDO/A、QDO 平板上生长（表 3），也
不能在 QDO/X/A 平板生长（图 2，E1）；而非
突变体 AGL24 与 SOC1 的杂交组合（图 2，B1）
以及阳性对照（图 2，A1）均能在 QDO/X/A
平板长出篮斑，阴性对照不能在 QDO/X/A 平
板生长（图 2，A2、E2）。说明 AGL24 第 107
位氨基酸突变后（AGL24Q107L突变体）会导致
SOC1与AGL24的相互作用消失。因此，AGL24
第 107位氨基酸能够调节 SOC1与AGL24之间
的作用强度。
2.3 SOC1蛋白K域的点突变影响SOC1/AGL24
蛋白互作
酵母双杂交发现：SOC1V77K、SOC1P81K、
SOC1K108V、SOC1R109L、SOC1C137K 突变体与
AGL24 融合后能在 DDO、DDO/A、QDO 平板
上生长白色菌落（表 4），而且也能在 QDO/X/A
平板上长蓝色菌落（图 3，C1、D1、E1、F1
和 G1），说明以上 5 个 SOC1 突变体均能与
AGL24 相互作用。
酵母 β–半乳糖苷酶活性表明：SOC1C137K
突变体与 AGL24 蛋白的作用强度（酶活性为
21.58 Miller Units）显著高于非突变体SOC1（酶
活性为 4.44 Miller Units）（表 4）。由此说明
SOC1 蛋 白 第 137 位 氨 基 酸 能 够 调 节
Xie Ting，Gu Hui-ying，Jiang Wei，Ma Guan-peng，Chen Jiao，Wang Zhi-min，Song Ming，Tang Qing-lin.
Identification of interaction sites in K-domains of flowering signal integrator SOC1 and AGL24 in Brassica juncea .
560 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：554–562.

SOC1/AGL24 的聚合强度。
另外，SOC1V77K × AGL24、SOC1P81K × AGL24、SOC1K108V × AGL24、SOC1R109L × AGL24 杂交
组合彼此之间作用强度差异不显著（酶活性分别为 3.14、2.73、2.50 和 3.19 Miller Units），但是均显
著低于 SOC1 × AGL24 杂交组合（酶活性为 4.44 Miller Units），说明 SOC1 蛋白的第 77、81、108
和 109 位氨基酸也能够调节 SOC1/AGL24 的聚合强度。
综上可知：SOC1C137K突变体能够显著增加 SOC1/AGL24 的作用强度；然而 SOC1V77K、SOC1P81K、
SOC1K108V、SOC1R109L 以及 AGL24Q107L能显著削弱 SOC1/AGL24 的聚合强度。但是 AGL24Q107L突
变体的效果（相互作用消失）要比 SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V、SOC1R109L（作用强度降低）
更为明显。由此推测 SOC1 蛋白第 137 位（SOC1C137K）和 AGL24 蛋白第 107 位（AGL24Q107L）分
别为正向调控或者负向调控 SOC1/AGL24 聚合强度的理想氨基酸位点。

表 4 SOC1 突变体与 AGL24 相互作用分析
Table 4 Protein interactions of SOC1 mutants with AGL24 in yeast
选择性培养基 Selective agar plates 编号
No.
菌株
Strain DDO DDO/A QDO QDO/X/A
β–半乳糖酶活性
β-galactosidase activity
A1 Y187（ pGADT-T）× Y2HGold（pGBKT7-53） 白色
White
白色
White
白色
White
蓝色
Blue
/
A2 Y187（pGADT-T）× Y2HGold （pGBKT7-Lam） 白色
White
无 No 无 No 无 No /
B1 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1） 白色
White
白色
White
白色
White
蓝色
Blue
4.44 ± 0.74 b
B2 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7） 白色
White
无 No 无 No 无 No /
B3 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1） 白色
White
无 No 无 No 无 No /
C1 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold （pGBKT7-SOC1 V77K） 白色
White
白色
White
白色
White
蓝色
Blue
3.14 ± 0.04 c
C2 Y187（pGADT7） × Y2HGold （pGBKT7- SOC1 V77K） 白色
White
无 No 无 No 无 No /
D1 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1P81K） 白色
White
白色
White
白色
White
蓝色
Blue
2.73 ± 0.08 c
D2 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7- SOC1P81K） 白色
White
无 No 无 No 无 No /
E1 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1K108V） 白色
White
白色
White
白色
White
蓝色
Blue
2.50 ± 0.04 c
E2 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7- SOC1K108V） 白色
White
无 No 无 No 无 No /
F1 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1R109L） 白色
White
白色
White
白色
White
蓝色
Blue
3.19 ± 0.22 c
F2 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1R109L） 白色
White
无 No 无 No 无 No /
G1 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1C137K） 白色
White
白色
White
白色
White
蓝色
Blue
21.58 ± 0.29 a
G2 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1C137K） 白色
White
无 No 无 No 无 No /
注：显著性水平为 0.05。DDO：SD/-Leu/-Trp；DDO/A：SD/-Leu/-Trp/AbA；QDO：SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp；QDO/x/A：SD/-Ade/-His/-Leu/-
Trp/X-α-Gal/ AbA。
Note：The significance level is 0.05. DDO：SD/-Leu/-Trp；DDO/A：SD/-Leu/-Trp/AbA；QDO：SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp；QDO/x/A：SD/-Ade/-
His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/ AbA.
3 讨论
开花是植物生长发育和繁衍后代的关键时期，花期调控对植物生产和育种具有重要意义。植物
谢 婷，谷慧英，江 为，马关鹏，陈 娇，王志敏，宋 明，汤青林.
芥菜开花整合子 SOC1 与 AGL24 蛋白 K 结构域的互作位点鉴定.
园艺学报，2015，42 (3)：554–562. 561

开花受外界环境因素（温度、光照等）和内在因素（植物年龄、遗传因素等）调控，是一系列信号
转导和基因调控的结果（Moon et al.，2003）。SOC1 与 AGL24 能够整合多个开花途径的开花信号，
并与其他基因形成一个复杂的调控网络共同调节植物开花（Lee & Lee，2010）。本研究中芥菜 SOC1
和 AGL24 均与十字花科其他作物的同源蛋白高度保守，只有少数氨基酸有差别。它与油菜、甘蓝
等作物的亲缘关系很近（Cseke et al.，2003；Ferrario et al.，2004；Lee et al.，2004）。目前在很多植
物中都克隆了 SOC1 和 AGL24 同源基因，它们主要在茎尖和叶片等器官表达，随着发育年龄的增加
其表达水平有所增加（Lee et al.，2000；Papaefthimiou et al.，2012；Ding et al.，2013）。
尽管目前在拟南芥和芥菜中均证实 SOC1 与 AGL24 之间存在蛋白互作（van Dijk et al.，2010；
江为 等，2014），但是调控 SOC1/AGL24 蛋白互作的氨基酸位点并不清楚。van Dijk 等（2010）利
用 IMSS（Interaction Motif Search and Selection）对拟南芥 SOC1 与其他 MIKC 型蛋白作用位点进行
了预测，并在 SOC1 蛋白的 M 域与 I 域的边界处构建了突变体 SOC1MQD62-64SIPK。酵母双杂交发现
SOC1 分别与 AGL24、AP1、FUL、CAL 和 SVP 蛋白有相互作用；而与 STK、MAF2、FLC 没有蛋
白互作。但是突变体 SOC1MQD62-64SIPK 与 AGL24 仍有相互作用；与 STK、MAF2 和 FLC 仍然没有蛋
白互作；而与 AP1、FUL、CAL、SVP 的相互作用消失。以上表明：SOC1 蛋白的第 62 ~ 64 位能够
调节 SOC1/AP1、SOC1/FUL、SOC1/CAL、SOC1/SVP 的蛋白互作；但可能并不调节 SOC1/AGL24
的相互作用。
van Dijk 等（2010）进一步预测了 AGL24 与其他 MIKC 型蛋白的作用位点，并构建了突变体
AGL24R61S。酵母双杂交发现：AGL24 分别与 SOC1、AP1、FUL 蛋白互作；而与 CAL、STK、SVP、
FLC、MAF2 没有蛋白互作。但是单突变体 AGL24R61S分别与 SOC1、AP1、FUL 仍有相互作用；与
CAL、SVP、FLC 仍然没有蛋白互作；而与 STK、MAF2 蛋白获得了相互作用。由此说明：AGL24
蛋白第 61 位氨基酸能够调节 AGL24/STK、AGL24/MAF2 蛋白互作；但可能并不调节 SOC1/AGL24、
SOC1/AP1、SOC1/FUL 的相互作用。
为了阐明 SOC1/AGL24 蛋白互作的调控位点，本试验没有采用 van Dijk 等（2010）的 IMSS
（Interaction Motif Search and Selection）方法，而以 Ofran 和 Bost（2007）的 ISIS（Interaction Sites
Identified from Sequence）方法在线预测了 SOC1 与 AGL24 蛋白互作位点，构建了的 5 个 SOC1 点
突变体和 3 个 AGL24 点突变体（图 1）。通过酵母双杂交首次找到了调控 SOC1/AGL24 的氨基酸位
点，即 SOC1 蛋白 K 域第 77、81、108、109 和 137 位氨基酸以及 AGL24 蛋白 K 域第 107 位氨基酸。
今后对这些氨基酸位点的深入研究，将有望彻底破译 SOC1/ALG24 调控开花时间的分子机制。

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