全 文 ：园艺学报，2015，42 (3)：489–495.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0791；http：//www. ahs. ac. cn 489
收稿日期：2014–11–17；修回日期：2015–01–26
基金项目：中央高校基本科研业务费项目（DL13EA06-3）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hyi01@tom.com）
间接原位 RT-PCR 法检测辣椒叶组织中辣椒轻
斑驳病毒的分布
杨洪一 1，郭世辉 1，李丽丽 2,*
（1 东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2 黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150081）
摘 要：为了了解辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）在辣椒组织中的分布特点，
探索利用间接原位 RT-PCR 技术对病毒在辣椒组织中进行定位。利用改进的 CTAB 法从辣椒叶片中提取总
RNA，利用 RT-PCR 技术扩增出 PMMoV 的特异片段，并经克隆测序，证明其为 PMMoV 的特异片段。
利用 PCR 技术，制备出了地高辛标记的特异 cDNA 探针。对原位 RT-PCR 反应体系进行优化，经过切片
制备（切片厚度 7 μm、应用 Superfrost plus 正电荷防脱载玻片）、预处理（1 mg  L-1 蛋白酶 K 消化 5 min）、
RT-PCR（37 ℃反转录 2.5 h、PCR 退火温度为 58 ℃）、杂交检测，建立了应用间接原位 RT-PCR 技术检
测 PMMoV 在辣椒组织中分布的方法。原位 RT-PCR 结果显示，叶片组织中 PMMoV 阳性信号主要分布于
栅栏组织，其次是海绵组织，表皮组织中也有少量阳性信号。此外，叶柄中可见少量阳性信号，主要位
于表皮组织。
关键词：辣椒；辣椒轻斑驳病毒；原位 RT-PCR；地高辛；组织定位；cDNA
中图分类号：S 641.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0489-07

Analysis on the Distribution of Pepper mild mottle virus in Leaf Tissues of
Peppers with Indirect in situ RT-PCR
YANG Hong-yi1，GUO Shi-hui1，and LI Li-li2,*
（1College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2Institute of Forestry Science of
Heilongjiang Province，Harbin 150081，China）
Abstract：The aim of this study was to analyze the characterization of distribution of Pepper mild
mottle virus（PMMoV）in tissue of peppers，and an in situ RT-PCR system was developed to locate
PMMoV in tissue of peppers. Total RNA was extracted from pepper leaves with a modified CTAB method.
The specific fragment was amplified by RT-PCR using total RNA as a temple，and it was testified that the
fragment was PMMoV-specific one on the basis of cloning and sequencing. A specific digoxin-labeled
cDNA probe of PMMoV was generated according to PCR labeling technique. A system for localization of
PMMoV in tissue level was developed with indirect in situ RT-PCR，via optimization of in situ RT-PCR
including section preparation（7 μm sections in the Superfrost plus positively charged slides），pre-treating
（1 mg · L-1 protease K digested for 5 min），RT-PCR（performing 2.5 h in 37 ℃ for reverse transcription

Yang Hong-yi，Guo Shi-hui，Li Li-li.
Analysis on the distribution of Pepper mild mottle virus in leaf tissues of peppers with indirect in situ RT-PCR.
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and annealing in 58 ℃ for PCR），and detection of hybridization. The technique，which can analyze the
distribution of PMMoV in tissue of peppers，was developed. The result of in situ RT-PCR showed that
PMMoV-positive signals were the best in palisade tissues of pepper leaves，and it had lots of
PMMoV-positive signals in palisade tissues. Epidermis had also few positive signals. In addition，few
positive signals located mostly in epidermis could be found in petioles.
Key words：Capsicum；Pepper mild mottle virus；in situ RT-PCR；digoxin；location in tissue cDNA

辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）是一种严重危害辣椒生产的种传病毒。
PMMoV 最早在美国发现，其后在西班牙、德国、澳大利亚等国均有报道，对英国、美国一些保护
地辣椒曾造成毁灭性危害（Antignus et al.，2008）。PMMoV 属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），
病毒粒体直杆状，为正单链 RNA 病毒，基因组由 6 357 个核苷酸组成（Hiroyuki et al.，2007）。PMMoV
可通过带毒种子、植株残体传播，在植物残体中可存活数年，可随辣椒制品进入人体，随粪便排出
后仍具有侵染活性（Colson et al.，2010）。中国于 1994 年首次在新疆辣椒上发现 PMMoV，后来山
东青岛、河北保定、宁夏惠农等地区先后有该病毒发生的报道，目前该病害危害日益严重（Wang et
al.，2009；王亚南 等，2010）。传统观点认为，植物病毒在植株体内分布不均一，但病毒的具体分
布规律不详（Hull，2007；Matsushita et al.，2011）。病毒侵入植物，经过复制及长距离转运扩散至
植物各组织，在此基础上，进一步复制增殖，从而干扰植物正常生理活动，因而了解病毒分布是了
解病毒转运及病理作用的一扇窗口。为了了解病毒的分布特点，一些组织定位手段被开发。早期主
要通过电子显微镜、免疫印迹、免疫胶体金、免疫荧光、原位杂交等技术进行病毒的组织定位（Kelley
& Cameron，1986；Nass et al.，1998；Aparicio et al.，1999；Tzanetakis et al.，2004；Genda et al.，
2005），但灵敏度较低。尽管原位杂交灵敏度高于免疫学方法（陈珏，2010），但多适于检测组织内
高滴度病毒，而低滴度病毒需则利用原位 RT-PCR 技术进行检测（Bates et al.，1997）。
原位 RT-PCR 技术是近年来发展起来的病毒组织定位新技术，Hasse 等（1990）首次报道了原位
PCR 扩增技术，简称原位 PCR（in situ PCR），其结合了传统 PCR 技术的高效扩增和原位杂交技术
的细胞定位的优点，既能够在组织切片、细胞样品中检测到低拷贝的 RNA 或 DNA，又能特异地确
定其细胞来源和细胞定位。原位 PCR 主要用于医学研究，近年来在植物学研究中也有所应用
（Johansen，1997；Matsuda et al.，1997）。Silva 等（2003）首次将原位 RT-PCR 技术应用于植物病
毒学研究，在杏树组织中发现了大量李矮缩病毒（Prune dwarf virus，PDV）。之后陆续有报道应用
原位 RT-PCR 技术对植物病毒进行组织定位的报道。在草本植物中，目前仅有关于草莓叶片中的草
莓斑驳病毒组织定位的报道（Yang et al.，2011）。在木本植物中，已有利用原位 RT-PCR 技术对苹
果、梨、杏、葡萄中的病毒、类病毒进行了组织定位的研究，显示叶片中的病毒主要分布于叶肉细
胞；而葡萄、梨茎尖分生组织尖端未能检测到病毒（赵英和牛建新，2008；Zhao et al.，2009；王钰
婷 等，2013）。为了进一步了解 PMMoV 在辣椒组织中的分布特点，本研究中探索利用间接原位
RT-PCR 技术对病毒在叶片和叶柄组织中进行定位。
1 材料与方法
1.1 材料
8 株感病辣椒植株于 2011 年 9 月分别采自黑龙江哈尔滨、吉林九台辣椒田，移栽入花盆，保存
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于东北林业大学微生物学实验室。利用 Agdia 公司的 DAS-ELISA 试剂盒对感病植株及阴性对照样
品进行了检测，确认感病植株为 PMMoV 阳性；RT-PCR 检测显示其未受黄瓜花叶病毒（Cucumber
mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y，
PVY）感染（Dai et al.，2012）。
大肠杆菌 DH5α 菌株为本实验室保存。反转录酶 M-MLV 为 Invitrogen 公司产品，PCR 产物纯
化试剂盒、dNTPs 购于生工生物工程（上海）股份有限公司，Taq DNA 聚合酶、RNasin、pMD 18-T
载体、DNA Marker 购自 TaKaRa 公司。DIG DNA 标记及检测试剂盒购自深圳莱伯克生物科技有限
公司。其它药品为国产分析纯。引物序列为：5′-CGATATAATGCCGTGCTAGAT-3′（上游引物），
5′-GCCATCATGTTTAAGGAGTTGT-3′（下游引物）。引物由大连宝生物公司合成。
1.2 RNA 提取及 RT-PCR
取 0.05 g 辣椒叶片，利用改进 CTAB 法提取总 RNA（Yang & Zhang，2007），最后溶解于 50 µL
DEPC 水中。在 0.2 mL Eppendorf 管中加入随机 9mer 引物（0.25 µmol · L-1）、dNTPs（1 mmol · L-1）、
1 µL 总 RNA、RNasin 0.3 µL、反转录 Buffer 4 µL、2 µL DTT、0.5 µL M-MLV 反转录酶（200 U · µL-1）
及 9 µL 超纯水，终体积 20 µL，混匀。之后进行反转录反应，对反转录温度（37、42 ℃）及时间
（0.5、1.0、2.5 h）进行优化。反转录结束后 70 ℃ 15 min，最后 4 ℃保温。
取 1 µL 反转录产物进行 PCR 反应。反应体系中含 2 µL 10× Buffer，1.5 mmoL · L-1 MgCl2，0.2
mmol · L-1 dNTPs，0.2 µmol · L-1 引物，0.5 U Taq 酶，用水补足至 20 µL。
对 PCR 反应中的退火温度（53 ~ 60 ℃）进行优化，最终反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，
58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35 个循环；最后 72 ℃延伸 5 min。
1.3 克隆测序
以 PCR 产物纯化试剂盒回收 DNA 片段，与 pMD 18-T 载体连接，然后转化大肠杆菌 DH5α 感
受态细胞。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养，提取质粒，通过 PCR 鉴定阳性克隆（Yang & Zhang，
2007）。测序工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行，双向测序。
1.4 探针制备及点杂交
参照地高辛标记试剂盒说明，利用 PCR 技术合成探针。利用点杂交对 RT-PCR 产物进行检测，
具体操作参见文献（Wang et al.，2009）。
1.5 冰冻切片的制作及预处理
分别取 8 株感病植株及阴性对照样品，每株分别取 2 个叶片或叶柄样品，剪成 1.0 cm × 0.5 cm
小段，投入固定液（4%低聚甲醛、4%蔗糖和 2.5%戊二醛）中固定 1 ~ 2 h，然后浸入 15%蔗糖磷酸
溶液中，置于 4 ℃过夜。将包埋剂倒入锡箔纸盒内，用液氮将材料迅速冷冻，然后放入温度为–20 ℃
的冰冻切片机样品台上迅速冷冻固定。先将样品切取需要的部位，然后拿出来室温放置 25 s，使包
埋块稍微变软。回温后的材料放入机箱内切片。用镊子小心夹取组织切片，平展于载玻片上，室温
放置 10 min 使切片稍变干。
用 3× PBS 和 1× PBS 分别冲洗组织，并温育 5 min。然后按顺序以 30%、60%、80%和 100%乙
醇依次冲洗切片进行室温脱水，每次 2 min。将载有固定样品的载玻片置于 105 ℃加热 2 min。放入
含 0.3% H2O2 PBS 中，于 37 ℃或室温放置过夜，然后用 PBS 洗 1 遍。将载玻片浸于 1 mg · L-1 蛋白
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图 1 利用 RT-PCR 检测 PMMoV
M：DL2000 Marker；1：PMMoV 阳性样本；2：阴性对照。
Fig. 1 Detection of PMMoV by RT-PCR
M：DL2000 Marker；1：Sample infected PMMoV；2：Negative control.
酶 K（1× PBS 稀释）中，温浴 10 min 后进行原位 RT-PCR 扩增。
1.6 原位 RT-PCR
将反转录溶液加于切片上，盖上原位杂交专用盖玻片，密封，之后放于原位 PCR 仪上进行反转
录反应。反转录反应结束后，将 PCR 反应混合液加到切片上，密封后放置原位 PCR 仪上进行 PCR
扩增。反转录体系、PCR 体系组成、反应程序与上述 RT-PCR 反应相同。利用地高辛标记的探针对
组织切片进行杂交检测，最后利用倒置显微镜进行观察并采集图像。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR 检测系统的优化
以感病辣椒叶片组织为试材，利用改进
CTAB 法提取总 RNA，利用 PMMoV 特异引物
扩增病毒基因组部分外壳蛋白（Coat Protein，
CP）基因区域。最终优化的反转录程序为 37 ℃
2.5 h；最优退火温度为 58 ℃。利用优化
RT-PCR 反应程序，最终扩增出了与预期片段
大小一致的 PCR 产物（约 250 bp）（图 1）。
利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对扩增产物进
行胶回收，连接至载体后进行测序，测序结果
显示该序列为 246 bp；与 GenBank 中所报道的
PMMoV CP 基因的序列同源性为 91% ~ 98%，显示该序列为 PMMoV 特异序列。
2.2 间接原位 RT-PCR 法检测 PMMoV 在辣椒组织中的分布
2.2.1 探针制备及其有效性分析
以质粒 DNA 为模板，利用地高辛标记试剂盒，以 DIG-dUTP 为底物，用随机渗入法对 DNA 进
行标记，制备了地高辛的探针，经电泳显示探针大小与预期相符。为了确定探针的有效性，利用制
备的探针对感染 PMMoV 样本的 RT-PCR 产物进行斑点杂交检测（图 2），杂交后加入抗地高辛的碱
性磷酸酶标记的抗体，利用碱性磷酸酶和化学底物的作用检测杂交靶 DNA，该探针可与 RT-PCR 产
物产生明显杂交信号，而阴性对照中未见杂交信号，说明制备的探针及整个杂交体系是有效的。

图 2 PMMoV 探针的斑点杂交反应结果
Fig. 2 The result of spots hybridization of PMMoV probe

2.2.2 冰冻切片制备及蛋白酶处理过程优化
将辣椒组织利用包埋剂进行包埋，利用液氮将辣椒组织冷冻，在冰冻切片机上将辣椒组织制成
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冰冻切片。对切片厚度进行了优化（5 ~ 30 µm），最终最优的切片厚度为 7 μm。切片过薄则不能保
持细胞形态的完整性，导致杂交显色后组织形态模糊，且后续试验中组织易碎。切片过厚则背景颜
色太深，杂交后的显色不明显，不利于观察，也易导致样品吸附力降低，与载玻片结合不牢固。将
切片展片到Superfrost plus正电荷防脱载玻片上，在显微镜下可清晰观察到叶片内部组织形态（图3）。

图 3 辣椒叶片组织冰冻切片（放大 200×）
Fig. 3 Frozen tissue section of pepper leaf（magnifying 200×）

在切片预处理过程中，还对蛋白酶的消化时间进行了优化。蛋白酶消化主要是为了增加细胞的
通透性，利于反应溶液进入细胞内部。切片的最佳消化时间为 5 min（蛋白酶 K 浓度为 1 mg  L-1），
时间过长会导致细胞膜完整性受到破坏，细胞组织形态模糊；时间过短则细胞通透性不好，反应不
稳定，易出现假阴性。
2.2.3 间接原位 RT-PCR技术检测 PMMoV的结果
经过优化反应体系，建立了间接原位 RT-PCR 技术检测 PMMoV 的技术体系。以辣椒叶片、叶
柄为试材，制备冰冻切片，切片厚度为 7 μm，置于 Superfrost plus 正电荷防脱载玻片上；切片预处
理过程采用蛋白酶 K（1 mg  L-1）消化 5 min；之后在原位 PCR 仪中进行 RT-PCR 反应，反转录程
序为 37 ℃ 2.5 h、PCR 反应退火温度为 58 ℃；之后利用地高新标记的探针对 RT-PCR 产物进行分
子杂交检测；最后将切片置于倒置显微镜下进行镜检，感染 PMMoV 辣椒组织中可见一些紫黑色斑


图 4 PMMoV 的组织定位（放大 200×）
A：叶片组织；B：叶柄组织。EP：表皮组织；PA：栅栏组织；SP：海绵组织；V：病毒粒子；CO：皮层；
BS：维管束鞘。黑色箭头标示阳性信号密集聚集区。
Fig. 4 Location of PMMoV in tissue of pepper （magnifying 200×）
A：Leaf tissue；B：Petiole tissue；EP：Epidermis；PA：Palisade tissue；SP：Sponge tissue；V：Virus；CO：Cortex；
BS：Bundle sheath. Strong positive-sign regions were signed with black arrow.
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点在组织中沉积。探针是以 PMMoV 的一段特异序列为模板合成的，因此探针能与 PMMoV 的核酸
发生互补配对，即只有存在 PMMoV 的组织才会有紫黑色斑点的出现。该原位 RT-PCR 体系为间接
原位 RT-PCR，相比直接法操作较繁琐，但其灵敏度、稳定性较高。
以感染 PMMoV 辣椒叶片、叶柄为试材的原位 RT-PCR 结果显示，紫黑色沉淀在叶片组织中主
要分布于栅栏组织，其次是海绵组织，表皮组织中也有少量阳性信号（图 4），阴性对照中未见紫黑
色沉淀。此外，叶柄中仅见少量阳性信号，主要位于表皮组织，维管束鞘中可见少量阳性信号。
3 讨论
原位 RT-PCR 技术流程较长，技术难度较大，需要对试验中的各个技术环节进行优化及调整。
在载玻片、盖玻片方面，原位杂交专用盖玻片、Superfrost plus 正电荷防脱载玻片效果最优，常规的
多聚赖氨酸载玻片效果较差，组织易脱落。在组织选择上，总体上含水量低、硬度较高的组织制备
切片及原位 RT-PCR 反应效果较好。在间接原位 RT-PCR 体系中，通过多次冲洗，影响 RT-PCR 反
应中酶活性的植物次级代谢物质可能在反应过程中被冲洗掉了，因而其稳定性较好。本研究是利用
原位 RT-PCR 技术进行辣椒病毒组织定位的首次报道，所建立的原位 RT-PCR 体系可为其他植物病
毒研究所借鉴。
在植物病毒检测研究中，同一植株不同季节、不同组织取材可能得到相反的结果（Posthuma et
al.，2002；Thompson et al.，2003），其原因可能和检测技术的灵敏度相关，也可能与病毒在植株体
内分布不均衡有关。经过原位 RT-PCR 检测，在辣椒叶片组织中发现大量病毒粒子，而叶柄组织中
病毒粒子数量相对较少。在叶片中，栅栏组织中含有较多病毒粒子，而栅栏组织中存在大量的叶绿
体，推断病毒可能影响叶绿体的合成，从而影响光合作用和叶片发育。
在原位 RT-PCR 相关研究中，除了以叶片组织为试材外，近年来一些研究开始探索花粉、茎尖
中病毒的分布（Silva et al.，2003；Zhao et al.，2009），其对于了解病毒的传播特点及控制病毒传播
具有重要意义。本研究仅针对叶片和叶柄组织中 PMMoV 的分布进行了分析，下一步将对辣椒花粉、
种子、特别是病毒灭活处理后种子内病毒的分布特点进行分析。

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