全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2010, 37 (1) : 129 - 134
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 05 - 11; 修回日期 : 2009 - 10 - 10
基金项目 : 广东省科技计划项目 (2006B20130004)3 E2mail: panlijing@m sn1com
石斛兰 dfr基因的克隆、序列分析及原核表达
潘丽晶 3 , 张妙彬 , 范干群 , 陈伟庭 , 曹友培
(珠海市农业科学研究中心 , 广东珠海 519070)
摘 　要 : 二氢黄酮醇 4 -还原酶 (DFR) 在不同花色形成中起着关键作用。利用 RT2PCR方法从石斛兰
中克隆出 dfr基因 , 并命名为 D endfr。该序列全长 1 164 bp, 编码 352个氨基酸。氨基酸序列分析发现 , Den
DFR与 3种兰科植物的 DFR氨基酸序列同源性达 81% ～86% , 与其他非兰科植物的 DFR氨基酸同源性
在 56% ～72%之间。在 Den DFR N - 末端存在一个保守的 NADP结合区 , 序列中存在 26个氨基酸组成的
底物特异结合区 , 其中 134位氨基酸处存在特异的天冬酰胺 N位点。将 D endfr的编码区克隆到 pQE30载
体中 , 在大肠杆菌中高效表达了该蛋白 , 为进一步研究石斛兰花色形成机制及花色改良基因工程打下基
础。
关键词 : 石斛兰 ; 花色 ; dfr基因 ; 克隆 ; 序列分析 ; 原核表达
中图分类号 : S 682131; Q 78　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2010) 0120129206
C lon ing, Sequenc ing and Prokaryotic Expression of dfr from D endrobium
PAN L i2jing3 , ZHANG M iao2bin, FAN Gan2qun, CHEN W ei2ting, and CAO You2pei
( Zhuhai A gricu ltura l Science Research Centre, Zhuhai, Guangdong 519070, Ch ina)
Abstract: D ihydroflavonol 42Reductase (DFR) p lays a key role in the formation of different floral color.
By using RT2PCR method, a dfr gene was cloned from D endrobium and designated as D endfr. The D endfr
gene was 1 164 bp in length and encoded 352 am ino acid residues. Am ino acid sequence analysis revealed
that Den DFR sequence share homologies of 81% - 86% with three species of orchid, and share homologies of
56% - 72% with the other species. Den DFR p rotein contains a reserved NADP domain at the N 2term inal and
a specific 26 am ino acid region of substrate specificity w ith an asparagine ( position 134 ) . The encoding
region of D endfr was constructed into pQE30 vector and effectively exp ressed the p rotein in E1coli. These
w ill be helpful for studying molecular mechanism of floral color formation and genetic imp rovement of the
D end robium.
Key words: D endrobium ; flower color; dfr gene; cloning; sequence analysis; p rokaryotic exp ression
二氢黄酮醇 4 -还原酶 (DFR) 在不同花色形成中起着关键作用 , 它是将二氢黄酮醇转变为花色
素反应的第一个酶 , 这一反应需要还原型辅酶 Ⅱ (NADPH )。由于不同物种的 DFR对底物选择性不
同 , 所以合成不同的花色素 , 呈现的花色各异。有些植物如矮牵牛的 DFR缺乏还原底物 DHK活性 ,
因而其花瓣缺少橙色 ; 相反 , 大丁草 DFR能够还原 DHK, 使花瓣产生橙色 ( Elomaa et al. , 1995)。
不同物种的 DFR氨基酸序列在很多区域有较高的同源性 , 例如 : DFR与 NADP结合位点高度保
守 , 富含甘氨酸 G (Lacombe et al. , 1997; Johnson et al. , 1999) ; DFR存在 26个氨基酸组成的底物
特异结合区 , 其中第 134位氨基酸可直接影响酶的底物特异性 , 大多数物种在 134位含有天冬酰胺 N
位点 (Beld et al. , 1989; Johnson et al. , 2001)。在矮牵牛的 DFR序列中 , 其底物特异区中的 134位
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不存在 N位点 , 因而缺乏还原 DHK活性 (Johnson et al. , 2001)。
随着分子生物学的发展 , 植物花色的形成及其相关基因的作用机理已得到广泛研究。然而 , 不同
植物 DFR的结构及生化特征仍未得到透彻的阐明。Petit等 (2007) 从葡萄 (V itis vin ifera) 中分离出
dfr基因 , 并将其在大肠杆菌中表达 , 纯化其活性蛋白 , 不仅检测了 DFR的活性 , 还获得了该酶与
DHQ和辅酶 Ⅱ (NADP) 的两种结合物 (DFR2DHQ和 DFR2NADP) 的三维结构图 , 首次通过三维结
构分析 DFR的作用机理。
此外 , dfr基因是花色改良的关键基因之一。Meyer等 (1987) 将玉米 dfr基因导入矮牵牛 RC01
突变体后 , DHK被还原 , 花变成淡砖红色 , 生成矮牵牛的新花色系列。A ida等 (2000a) 将反义 dfr
和反义 chs导入蓝猪耳中 , 花色更显蓝 , 反义 dfr比反义 chs更能使花显蓝。其原因是反义 dfr的导入
使 dfr基因钝化 , 从而导致黄酮的积累 , 使辅色作用增强 (A ida et al. , 2000b)。
石斛兰 (D end robium ) 又称石斛 , 是兰科中的第二大属 , 广泛分布于热带、亚热带地区 , 是主要
的切花品种之一。石斛兰的花色相对单一 , 市场上备受欢迎的亮橙色、火红色和天蓝色在石斛兰中都
不曾见。
长期以来 , 育种家们渴望通过传统杂交手段获得新型的石斛兰花色品种 , 然而 , 由于对石斛兰花
色的遗传研究较少 , 研究者们对这些杂交后代的花色将如何改变无从知晓。同时石斛兰的育种周期
长 , 也限制了其新型花色品种的开发。近几年来 , 尽管石斛兰的分子生物学相关研究已在加速 , 但相
比其他花卉 , 仍比较落后。
石斛兰缺乏橙色与蓝色 , 这与石斛兰花色形成过程中 DFR的活性密切相关。本研究中从石斛兰
中克隆出二氢黄酮醇 4 -还原酶基因 ( dfr) , 并对其进行了全序列分析 , 与其他已知的 dfr基因作比
较 , 揭示了 DFR可能的功能区。同时克隆了该基因的编码区 , 构建表达载体 , 并在大肠杆菌中高效
表达 , 为进一步研究石斛兰花色形成机制及改良花色的基因工程打下基础。
1　材料与方法
111　材料
试验于 2008年在珠海市农业科学研究中心实验室进行 , 材料为本中心兰花资源圃栽培的石斛兰
品种 ‘Geeting Fragrance’。将花蕾剪下 , 迅速投入液氮中速冻后放入 - 70 ℃冰箱保存。
112　总 RNA的提取与 dfr基因的克隆
取适量的花蕾于研钵中 , 加入少量石英砂 , 快速研磨成粉末 , 加入 10倍体积的裂解液 [ 50 mmol·
L - 1 Tris2HCl (pH 810)、20 mmol·L - 1 L iCl、2 mmol·L - 1 EDTA、1 mol·L - 1 NaCl; 115% SDS; 4%
β -巯基乙醇 ] , 涡旋 1 m in, 静置 15 m in。4 ℃ 8 500 ×g离心 10 m in; 取上清液 , 加入 L iCl至终浓度
2 mol·L - 1 , 颠倒混匀后 - 20 ℃放置 2 h。4 ℃ 15 000 ×g离心 45 m in。弃上清液 , 沉淀中加入 011～
012 mol·L - 1 NaCl溶解 , 再加入等体积的酚 ∶氯仿 ∶异戊醇 (25∶24∶1) 抽提 2～3次 , 离心 , 取上层
水相 ; 加入 3倍体积无水乙醇 , - 20 ℃放置 15 m in, 离心 , 收集沉淀 ; 将所得的沉淀用 75%乙醇洗
涤 1次。待 RNA沉淀略干 , 加适量无 RNase水溶解 , - 70 ℃储存备用。
参照 TaKaRa公司的 RNA PCR Kit (AMV ) Ver. 310试剂盒说明书合成 cDNA第一链。设计两个
特异性引物 : dfr1: 5′2AACTGGCGTTGAGGAGAGAGAA23′, dfr2: 5′2GCACTTAGAAAATCAATAGGAC2
3′。用 cDNA第一链为模板 , 进行 PCR扩增。扩增产物经回收 , 与 pMD182T载体连接 , 转化 E1coli
DH5α, 提取质粒 T2dfr, 鉴定后送广州 Invitrogen公司测序。质粒提取、酶切 , DNA片段回收、连接、
转化等按分子克隆实验手册略加修改进行。
113　序列分析
应用 DNAStar软件对 DNA序列进行读码框、核苷酸与氨基酸序列特征分析 , 并将其编码的氨基
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　1期 潘丽晶等 : 石斛兰 dfr基因的克隆、序列分析及原核表达 　
酸序列用 B last搜索引擎在 GenBank /EMBL数据库中寻找同源序列。
同源性分析和多序列比较用 CLUSTAL W软件 ( Thomp son et al. , 1994) 进行。
序列特征分析参照文献 (Beld et al. , 1989; Lacombe et al. , 1997; Johnson et al. , 1999; Johnson et
al. , 2001) 进行。
114　dfr基因原核表达载体的构建
根据测序结果 , 重新设计引物 : dfr3: 5′2GGATCCATGGAGAATGAGAAGAAG23′, dfr4: 5′2GG2
TACCTCACTTAACAGCAATCTG23′。
以 T2dfr为模板进行 PCR 扩增 , 扩增后的产物连入 pMD182T克隆载体 , 连接产物转化 E1coli
DH5α, 经序列测定后 , 以 B am HⅠ和 KpnⅠ酶切 , 回收并纯化 , 再连入 pQE30, 转化 E1coli DH5α,
得到重组表达质粒。
重组质粒 pQE2dfr经酶切鉴定后 , 进一步用 pQE30测序引物 , 送广州 Invitrogen公司进行测序鉴
定。
115　D FR在 E1co li中的表达
分别将质粒 pQE30与 pQE2dfr转化 E1coli M15 [ pREP4 ] 中 , 37 ℃培养过夜。次日以 5%转接于
LB培养基中 , 37 ℃培养 2 h后 , 取 3 mL菌液 , 测光吸收值 A600 ; 并收集菌体作为诱导表达前的对
照 , 其余菌液中加入 IPTG至终浓度 1 mmol·L - 1 , IPTG诱导 1～5 h后 , 分别收集菌体。表达产物用
15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 , 方法参照 Q IA exp ressionistTM操作说明进行。
2　结果与分析
211　dfr基因的克隆与序列分析
21111　dfr基因的克隆 　
提取石斛兰花蕾总 RNA 后 , 通过逆转录和
PCR扩增 , 进行琼脂糖凝胶电泳 , 获得一条约为
112 kb的特异条带 , 条带大小与预期一致 (图
1) , 将特异条带进行回收测序。
21112　序列特征 　
dfr序列全长 1 164 bp, 读码框全长 1 059 bp ,
编码 352个氨基酸 , 预计分子量为 391625 kD, 等
电点为 5188, GenBank登录号为 FJ426271, 命名
为 D endfr。
用 B last分析发现 , D endfr与 B rom head ia‘fin2
laysoniana’dfr基因氨基酸同源性最高 , 达 86% ;
与兰属 (Cym bid ium hybrida) 的 dfr基因氨基酸同
图 1　石斛兰 dfr基因的 RT2PCR产物
M: DNA marker;
1: 石斛兰 dfr基因片段。
F ig. 1　RT2PCR product of D endfr
M: DNA marker;
1: RT2PCR p roduct of D endfr.
源性为 83% , 与文心兰 (O ncid ium‘Gower Ram sey’) 的氨基酸同源性为 81% ; B last分析还发现 , 该
基因的氨基酸序列与其他非兰科植物 dfr基因的氨基酸同源性在 56% ～72%之间。
4个兰科植物的 DFR氨基酸序列进行比对结果见图 2, 其 N -末端存在一个保守的 NADP结合区
“VTGASGYVGSWLVMKLLQKGY”, 富含甘氨酸 G; 且都存在 26个氨基酸组成的底物特异结合区
“TVNVEEMQAAVYDESSW SDLDFVNRV”; 在 134位氨基酸处存在决定还原 DHK活性的特异天冬酰胺
N位点 , 这两个结合区和一个位点在各物种的 DFR中广泛存在且高度保守。
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图 2　兰科植物 D FR氨基酸序列对比
引用的 DFR序列分别是 : Cym, 兰属 ; Onc, 文心兰 ; Den, 石斛兰 ; B ro, B rom headia。
矩形框内是 NADP结合区 , 下划线部分是底物特异结合区 , #代表特异的天冬酰胺 N位点。
F ig. 2　M ultiple sequence a lignm en t of orch ids D FR
The following EMBL DFR sequences were used: Cym, Cym bid ium hybrida, AF017451; Onc, O ncid ium , AY953937;
Den, D endrobium , FJ426271; B ro, B rom headia fin laysoniana, AF007096. The NADP binding regions were denoted in box.
The substrate specificity determ ing regions were highlighted by underlines. The specific N am ino acid was denoted by #.
212　原核表达载体的构建及原核表达
以 T2dfr为模板 , 经 PCR扩增后 , 获得 dfr基因。
将 dfr基因克隆到 pQE30表达载体上 , 转化 E1coli DH5α, 挑选阳性克隆 , 纯化质粒 , 用 B am HⅠ
和 KpnⅠ酶切鉴定重组质粒 pQE2dfr, 结果与预期大小一致 (图 3)。
图 3　重组质粒 pQE2dfr的鉴定
M: λDNA /EcoRⅠ + H indⅢ marker; 1: B am HⅠ单酶切 ; 2: B am HⅠ和 KpnⅠ双酶切。
F ig. 3　 Iden tif ica tion of recom b inan t pla sm id pQE2dfr
M: λDNA /EcoRⅠ + H indⅢ marker; 1: B am HⅠ / pQE2dfr; 2: B am HⅠ和 KpnⅠ / pQE2dfr.
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　1期 潘丽晶等 : 石斛兰 dfr基因的克隆、序列分析及原核表达 　
　　用 pQE30测序引物进行测序鉴定 , 结果表明 , 插入片段与已经登录的序列完全一致 , 而且正确
插入到了表达载体的克隆位点。
将含 dfr的重组表达质粒 pQE2dfr转化 E1coli M15 [ pREP4 ] 后 , 经 IPTG诱导可表达与理论预测
值相符的 42 kD蛋白 , 并且诱导后 1 h即可见诱导蛋白的产生 , 诱导后 5 h其表达量达到最大 (图
4)。
图 4　D en D FR在 E1coli中的表达
M: 蛋白质分子量标准 ; 1: 诱导前 ; 2～6: 诱导后 1、2、3、4和 5 h; 7: M15 [ pREP4 ]。
F ig. 4　D en D FR expressed in E1coli M 15 [ pREP4]
M: Standrad p rotein marker; 1: Samp le before IPTG induction;
2 - 6: Samp les after IPTG induction 1, 2, 3, 4, 5 h; 7: M15 [ pREP4 ].
3　讨论
目前有关兰花花色基因的报道相对较少 , 对兰花花色形成的机制研究也比较薄弱。L iew等
(1998) 用同源探针通过 PCR 方法从 B rom head ia fin layson iana的 cDNA 文库中分离得到 dfr基因 ,
Southern blot分析表明 , 在该兰花中 dfr由单基因编码。H ieber等 (2005) 从文心兰中分离到 3个不
同的 dfr转录本。兰科植物大部分的 dfr基因都是单拷贝 , 多拷贝的 dfr基因并不多见。本研究从石斛
兰中成功克隆到的 dfr基因也是单拷贝的。
在复杂的花色素合成过程中 , 呈现不同颜色花色素的积累依赖于 DFR 的活性。 Johnson等
(1999) 将兰属 dfr基因转入矮牵牛中 , 发现兰属的 DFR不能有效还原 DHK, 从而导致天竺葵色素的
缺乏 , 但兰属的 DFR中存在 134位的 N特异氨基酸。文心兰的 DFR中也存在 134位的 N, 这就提示 ,
兰花的 DFR底物特异性位点不是 134位的 N 位点。Mudalige2Jayawickrama等 ( 2005) 推测 , 由于
F3′H和 DFR作用于相同的底物 DHK, 它们之间的竞争决定了 DHQ和 DHK的不同表达水平 , 从而呈
现不同的花色。本研究中获得的 Den DFR也存在 134位的 N特异氨基酸 , 但石斛兰却缺乏橙色 , 这
似乎证实了以上的推测 : F3′H和 DFR之间的竞争决定了 DHQ和 DHK的不同表达水平。
Petit等 (2007) 首次对 DFR的三维结构进行了详细描述 , 进一步证实了其 NADP结构域、底物
特异结合位点的存在。Trabelsi等 (2008) 进一步获得了 DFR - NADP - 杨梅酮和 DFR - NADP - 栎精
两种结合物的晶体 , 通过三维结构的展示 , 证实黄酮醇可能抑制 DFR的活性。DFR三维结构的分析 ,
将有助于 DFR作用机理的阐明。本研究将石斛兰 dfr基因的编码区在大肠杆菌中进行了高效表达 , 为
Den DFR蛋白的分离纯化、活性检测、三维结构的探讨、石斛兰花色素的研究与遗传转化奠定了基
础 , 同时也为石斛兰新品种的改良提供了一条新途径。
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