全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（10）：1901–1910 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–08–18；修回日期：2011–10–08
基金项目：国家自然科学基金项目（31000538，30771206）；北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX201101010-19）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liufan@nercv.org）
花椰菜—黑芥体细胞杂交获得抗黑腐病异附加
系新材料
王桂香 1，严 红 2，曾兴莹 1，盛小光 1，唐 宇 1，韩 硕 1，宗 梅 1，
陆 坤 1，刘 凡 1,*
（1 北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097；2北京市农林科学院植物与环境保护研究所，北京 100097）
摘 要：以花椰菜—黑芥体细胞杂种的自交及回交后代为材料，建立了结合抗病性人工接种鉴定，
流式细胞仪 DNA 含量分析，B 基因组特异分子标记和染色体原位杂交的大规模群体分析技术，在 50 份
高代自交及回交材料中筛选获得了 20 份形态学特征偏向花椰菜，30 份呈花椰菜—黑芥中间类型的材料。
细胞 DNA 含量检测（FLC）及染色体计数结果表明，偏花椰菜的类型，DNA 含量基本在 2.24 pg · cell-1
以下，染色体数在 28 条以下。经连续 3 年黑腐病病菌人工接种鉴定，获得高抗株系 12 个，抗性株系 17
个，占全部受试材料的 14%。对其中 3 个（PFCN29 BC3-3-5、PFCN16-1 S2BC3-107 和 PFCN14-1 S1BC4-123）
形态偏花椰菜且高抗黑腐病的植株进行基因组原位杂交，结果显示其分别为花椰菜染色体组附加了 2、7
和 8 条黑芥染色体的异附加系材料。这些植株可以用于后续的研究和作为育种桥梁材料，进一步获得黑
腐病抗性的单体附加系或渐渗系。本研究表明通过体细胞杂交转育野生优异抗性资源，创新甘蓝类蔬菜
育种种质的可行性。
关键词：花椰菜；黑芥；体细胞杂交；黑腐病；异附加系
中图分类号：S 635.3；S 63 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）10-1901-10

New Alien Additon Lines Resistance to Black Rot Generated by Somatic
Hybridization Between Cauliflower and Black Mustard
WANG Gui-xiang1，YAN Hong2，ZENG Xing-ying1，SHENG Xiao-guang1，TANG Yu1，HAN Shuo1，
ZONG Mei1，LU Kun1，and LIU Fan1,*
（1Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China；
2Institute of Plant and Environmental Protection，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，
China）
Abstract：In this study，the asymmetrical somatic hybrids of cauliflower and Brassica nigra and their
selfed or backcrossed progenies were analysed using morphological，cytological and molecular methods.
Fifty advanced selfing or backcrossing descendants were obtained. Besides 30 lines with an intermediate
morphology to that of the parents，there were 20 lines with a nuclear DNA content below 2.24 pg · cell-1
and chromosomes number less than 28 displaying the cauliflower-like morphology. Combining with


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successive black rot resistance assay，a set of alien additon lines were obtained，in which 12 lines with high
resistance，17 lines being resistant，those accounted for 14% of the total materials tested. Three plants
（PFCN29 BC3-3-5，PFCN16-1 S2BC3-107 and PFCN14-1 S1BC4-123）displayed a more cauliflower-like
morphology and high resistance to Xcc strain CH15 were confirmed to have a total set of cauliflower
chromosomes added with 2，7 and 8 B. nigra-derived chromosomes respectively by genomic in situ
hybridization（GISH）.
Key words：cauliflower；black mustard；somatic hybridization；black rot；alien additon line

黑腐病是十字花科蔬菜常见病害，危害严重。黑腐病致病菌为黄单胞杆菌属细菌 Xanthomonas
campestris pv. campestris（Xcc）。国际上将其分为 6 大类生理小种，其中生理小种 1 及 4 是主要致病
小种（Vicente et al.，2001）。甘蓝类蔬菜育种资源对黑腐病抗性呈现单一或缺乏现象（Bain，1955；
Dickson & Hunter，1987；Vicente et al.，2002）。花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis，2n = 18，
CC）经人工长期定向选育，种质遗传基础狭窄，特别是对病虫害的抗性已不能满足生产与现代蔬菜
育种的需求。
黑芥（Brassica nigra，black mustard，2n = 16，BB）为芸薹属近缘野生种，对多种十字花科常
见病害具有抗性，包括对黑腐病和根肿病等重要病害（Scholze & Hammer，1998；Taylor et al.，2002；
Vicente et al.，2002；Tonguç et al.，2003）。本研究中拟通过体细胞杂交技术将黑芥中的黑腐病抗病
基因转移到花椰菜中，实现育种种质创新。
芸薹属植物是进行体细胞杂交研究的模式物种（Glimelius，1999；Navrátilová，2004）。通过种
间和属间的体细胞杂交，许多重要的农艺性状包括抗病性，高脂肪酸含量，胞质雄性不育等已在甘
蓝型油菜上被成功地转移和利用（Gerdemann et al.，1994；Hansen & Earle，1994；Wang et al.，2003；
胡琼 等，2004；Zhao et al.，2008）。国际上虽然有过甘蓝与黑芥体细胞杂交的研究报道（Jourdan &
Salazar，1993），但仅限于 BBCC 基因组的人工合成，没有后续研究或应用报道。作者在前期工作
（张丽 等，2008）基础上，对花椰菜—黑芥非对称体细胞杂种进行连续的自交、回交，结合对黑腐
病抗性选择，促进抗病附加系、代换系、或渐渗系的形成，以期为十字花科蔬菜育种提供新的抗源
桥梁育种材料。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis）下胚轴原生质体与经 UV 射线处理的黑芥
（B. nigra）叶肉原生质体融合的 170 个独立再生株，经分子细胞学鉴定为杂种（张丽 等，2008）。
选择形态、生长势及育性较好的 30 个单株，进行连续自交及与花椰菜受体的回交，获得了包括自交
1 ~ 5 代，回交 1 ~ 4 代，以及先自交后回交的不同世代、不同组合的材料 50 份。
用于人工接种的黑腐病病原菌为从北京、湖南等 8 个省、市的感病甘蓝叶片上分离并经过鉴定
的 8 个菌种，以及从英国 HRI（Horticultural Research International）研究所引进的 Race 1 和 Race 4 两
个生理小种，共 10 个菌株。
对花椰菜、黑芥以及 30 个单株的后代株系进行连续 3 年的黑腐病人工接种抗性鉴定，同时选用
黑腐病高感花椰菜品种‘Wirosa’为对照。
10 期 王桂香等：花椰菜—黑芥体细胞杂交获得抗黑腐病异附加系新材料 1903

1.2 方法
核 DNA 含量测定：取待测杂种和两亲本上、中、下叶片各 0.2 g，分别加入 2 mL 细胞裂解液，
以锋利刀片切碎组织，过滤，800 r · min-1 离心 5 min，弃上清液，加入 200 µL PI 染液（propidium iodide，
50 µg · mL-1）对核进行染色，30 min 后，以亲本花椰菜的 2C DNA 相对含量为标准，采用流式细胞
仪进行杂种细胞 DNA 相对含量的测定，最后取其平均值。
染色体计数：上午 9：00—10：00 时将两亲本和杂种的根尖切下，用饱和对二氯代苯处理 4 h，
卡诺固定液（冰醋酸︰乙醇 = 1︰3）固定 24 h，1 mol · L-1 盐酸在 60 ℃中解离 5 min，用卡宝品红染
色后常规压片方法镜检。
B 基因组特异的分子标记分析：所用引物序列为 F：GGCATCTGAAGAGAGAGTCCCTTTG，R：
GGCCACTCATGGCAAGAAGAAGAT（Schelfhout et al.，2004），在真杂种中都能扩增出大小为 329 bp
的条带，是 B 基因组每条染色体共有的一段重复序列。扩增条件按照 Schelfhout 等（2004）的报道。
基因组原位杂交：黑芥基因组 DNA 采用切口平移法，用 Dig-11-dUTP（Roche）标记探针。花
药用 5%纤维素酶（Sigma）和 5%果胶酶（MERCK）酶解后制片，杂交程序按照 Jiang 等（1996）
的方法进行。杂交信号用 anti-dig rhodmine（Roche）检测，染色体使用 DAPI（Vector Laboratories）
复染。Nikon 显微镜进行荧光观察和照相，利用 Adobe Photoshop v6.0 软件进行图像的合成及亮度和
对比度的调节。
形态学性状调查：调查处于营养生长期杂种植株的叶形、叶色、叶片质地、生长势等，生长势
按照同期植株株高和展开度分为强、中、弱。在初花期时调查杂种的株高、花冠大小及花色。
病原菌接种：首先用 10 个黑腐病菌种对融合亲本花椰菜和黑芥进行苗期抗病性鉴定，筛选出受
体花椰菜高感但供体黑芥高抗的株系，再用筛选出的黑腐病菌种对体细胞杂种后代进行苗期抗病性
鉴定。每份材料至少 30 株，分为 3 个重复。采用喷雾法接种：在接种前 1 d 将 4 ~ 6 片真叶幼苗保
湿 12 h，于第 2 天早晨用医用喉头喷雾器将 1 × 108 cfu · mL-1 新培养的细菌悬浮液均匀喷于幼苗上。
接种后幼苗避光保湿 24 h。接种 20 d 调查发病情况，并计算各材料的病情指数。调查以接种叶片为
单位，病情分级按照 Tonguc 等（2003）的标准进行。0 级：叶片上无任何症状；1 级：水孔处有黑
色枯死点，且病斑稍有扩散，占叶面积 5%以下；3 级：病斑从水孔处向外扩展，占叶面积 5% ~ 25%；
5 级：病斑占叶面积的 25% ~ 50%；7 级：病斑占叶面积 50%以上；9 级：病斑占叶面积的 85%以上。
病情指数 = [Σ（病级株数 × 该病级值）／（调查总株数 × 最高级值）] × 100；抗病性为：高抗
（HR）：0 < 病情指数 ≤ 10；抗病（R）：10 < 病情指数 ≤ 30；耐病（T）：30 < 病情指数 ≤ 50；
感病（S）：50 < 病情指数 ≤ 70；高感（HS）：70 < 病情指数。
2 结果与分析
2.1 花椰菜－黑芥杂种后代的初步筛选
对杂种后代材料进行 DNA 含量测定的部分结果列于表 1。融合受体花椰菜的 2C DNA 含量为
1.42 pg · cell-1（Hansen & Earle，1994），以此作为参照，黑芥的 2C DNA 含量为（1.30 ± 0.02）pg · cell-1。
杂种后代群体的 DNA 含量介于 1.33 ~ 2.27 pg · cell-1 之间，染色体数变化范围为 18 ~ 32 条。其中株
高和形态偏花椰菜的类型，其 DNA 含量基本在 2.24 pg · cell-1 以下，染色体数在 28 条以下。
结合表 1 相应材料的染色体计数与流式 DNA 含量测定值做相关性分析，建立了回归方程： Y =
0.556 + 0.0492X（Y 代表 DNA 含量，X 代表染色体数）。通过 26 个单株验证：该方程推算染色体
数的误差在两条染色体范围内，有利于根据 FLC 测定值对材料的染色体数进行估算初筛。
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表 1 部分体细胞杂种后代材料的核 DNA 含量、染色体数、株高和形态比较
Table 1 The nuclear DNA contents，chromosome numbers，plant height and morphology of progenies
材料
Plant line
DNA 含量/（pg · cell-1）
DNA content
染色体数
Number of chromosome
株高/cm
Height
形态分类
Phenotype
花椰菜 Cauliflower 1.42 18 45 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
黑芥 B. nigra 1.30 16 230 N（黑芥型 B. nigra type）
PFCN2 S3BC2-1-1 2.01 28 85 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN2 S3BC2-3-3 1.94 26 90 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN2 S3BC2-X-8 1.93 26 91 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN2 S3BC1-1-1 1.89 26 135 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN5 S4-2-133 2.13 30 90 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN5 S4-2-134 1.99 30 93 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN5 S4-2-135 2.13 32 125 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN13-2 S1BC4-3-3 1.89 24 122 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN13-2 S1BC4-4-1 2.05 26 60 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN13-2 S1BC4-4-2 2.24 26 58 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN13-2 S1BC4-116 2.13 28 57 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN13-2 S1BC4-117 1.70 30 70 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN13-2 S1BC4-121 2.27 30 104 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN14-1 S1BC4-123 1.70 26 80 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN14-1 S1BC4-124 2.13 32 111 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN15-2 S1BC4-5-2 1.92 30 103 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN15-2 S1BC4-3-4 1.92 24 92 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN15-2 S1BC4-3-9 1.90 26 98 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN15-2 S1BC4-6-2 1.94 30 120 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN16-1 S1BC2S1BC1-103 2.13 32 125 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN16-1 S1BC2S1BC1-107 1.70 25 90 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN16-1 S1BC2S1BC1-108 1.70 26 88 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN21-1 S1BC2-1-28 1.28 18 50 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN21-1 S1BC2-140 1.99 28 98 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN21-1 S1BC2-141 2.13 28 110 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN22-1 S2BC1-X-22 1.84 26 108 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN29 BC3-3-5 1.33 20 48 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN29BC3-4-8 1.85 28 80 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN29 BC3-5-7 1.82 32 120 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN29 BC3-5-8 1.99 28 110 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN29 BC3-5-11 1.86 24 102 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN29 BC3-3-8 1.94 34 120 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN29 BC3-3-9 1.84 26 98 K（花椰菜类型 Cauliflower type）
PFCN31-1 S3-138 2.13 30 130 N（黑芥型 B. nigra type）
PFCN31-1 S3-139 2.13 32 135 N（黑芥型 B. nigra type）
PFCN14-4 S5-111 1.42 24 128 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN9 S4-2-128 1.99 28 98 M（双亲中间类型 Intermediate type）
PFCN9 S4-2-129 2.27 30 125 N（黑芥型 B. nigra type）

对体细胞杂种一代（H1）和回交后代进行黑芥 B 基因组特异的分子标记分析（图 1），均含有特
征条带。







图 1 黑芥 B 基因组染色体的特异分子标记鉴定
M：DNA 分子量标记；K：花椰菜；N：黑芥；1、2：H1 代杂种；3、4：BC1 代杂种；5、6：BC2 代杂种；7、8：BC3 代杂种。
Fig. 1 Hybrid and progenies identification using B genome specific molecular markers
M：DNA molecular marker；K：Cauliflower；N：Brassica nigra；1，2：Somatic hybrids；3，4：BC1 progenies；
5，6：BC2 progenies；7，8：BC3 progenies.
10 期 王桂香等：花椰菜—黑芥体细胞杂交获得抗黑腐病异附加系新材料 1905

2.2 花椰菜－黑芥杂种后代形态和育性分析
在叶形上，花椰菜叶片为长卵形，叶缘有浅锯齿，无叶耳，呈浅蓝绿色，表面有蜡粉，叶面光
滑无毛（图 2，a，K）。黑芥叶片近似三角形，有叶裂，具叶耳，呈绿色，表面无蜡粉，叶面被毛（图
2，a，N）。杂种叶形变异广泛，形状有椭圆形、三角形、心形、卵形等，多数有叶裂，全部具叶耳，
叶色大多呈双亲的中间色，叶表面被疏毛或无毛。回交后代部分杂种植株的叶形和叶色趋向于花椰
菜（图 2，a，BC1、BC2）。体细胞杂种一代的叶形和叶色多趋向于黑芥（图 2，a，F1-1、F1-2）。
花椰菜的花呈淡黄色，花瓣大且前缘有明显皱缩（图 2，b，K）；黑芥的花为黄色，花瓣短小平
滑（图 2，b，N）。盛花期，花椰菜的花冠直径[（2.1 ± 0.2）cm]约为黑芥花冠[（0.7 ± 0.1）cm]的
3 倍。杂种后代的花冠大小不均，但都介于两亲本之间，整体差异不大，为 1.4 ~ 2.0 cm，明显大于
黑芥而略小于花椰菜。回交后代个别单株的花瓣前缘出现皱缩，形状（花冠前缘有皱缩），颜色（淡
黄）和花冠大小[（1.9 ± 0.1）cm]上都接近于花椰菜（图 2，b，BC1、S1BC4），但明显看出其花药
发育不良。
整体形态上花椰菜成株期植株较矮（40 ~ 50 cm），呈莲座状，茎短，无分枝，先抱球再抽薹开
花（图 2，c，K）。黑芥成株期植株较高，达到 230 cm，茎长，分枝多，花序不抱球，直接抽薹开
花（图 2，c，N）。杂种后代多数呈中间类型，茎长居中，分枝较多，成株期一般无大花球形成，一
些株系有小花球形成，多数偏绿色，回交后代中个别单株出现偏白色花球性状（图 2，c，BC3-I、
S2BC1-I），与花椰菜相比，花球比较松散。
自交及回交表明：材料育性较好（不同植株的花粉活力为 10% ~ 85%），通过人工辅助授粉可以
得到后代种子，其中自交比回交易于结籽。

图 2 杂种后代的形态比较
a：叶形，b：花形态，c：花球。K：花椰菜；N：黑芥；F1-1，F1-2，BC2，BC1，S1BC4，BC3-I，S2BC1-I：分别为杂种及回交自交后代。
Fig. 2 The morphology of the hybrid progenies
a：Leaves，b：Flowers，c：Flower head. K：Cauliflower；N：B. nigra；F1-1，F1-2，BC2，BC1，
S1BC4，BC3-I，S2BC1-I：Hybrids and progenies.
2.3 黑腐病菌致病性鉴定
首先进行不同菌种对两亲本材料致病性的鉴定，结果如表 2 所示。在所有黑腐菌种中 5 号菌种
对黑芥的致病力远低于受体花椰菜，花椰菜的病情指数达到 70.4，表现为高感（HS），而黑芥的病
情指数为 8.8，表现为高抗（HR），两者差异显著。该菌种采集自北京郊区发病甘蓝叶片，经归类鉴
定，属于黑腐病菌生理小种 4，具有致病性强和对体细胞杂种的两亲本致病性差异显著的特点。因
此，5 号菌种（CH5）被选作用于体细胞杂种后代的黑腐病抗性鉴定。
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表 2 不同黑腐菌种的致病力
Table 2 Reaction of cauliflower，B. nigra and Wirosa to the ten strains of Xcc
注：T. 耐病；R. 抗病；S. 感病；HS. 高感；HR. 高抗。下表同。
Note：T. Tolerant；R. Resistant；S. Susceptible；HS. High susceptible；HR. High resistant. The same below.
2.4 抗病异附加系材料的获得及鉴定
结合逐年抗病性筛选、流式鉴定、形态特征优选等研究手段，2010 年获得了 20 份染色体数在
26 条以下的异附加系材料，这些材料可能包含全套花椰菜 CC 基因组染色体，附加 0 ~ 8 条黑芥 BB
基因组染色体。植株表型整体上偏向于花椰菜，比如株高在 50 cm 以下，叶色暗绿，叶表无毛，叶
脉清晰明显，但所有材料都表现出了来自黑芥的叶耳形态。花的形态整体上变大，花瓣颜色变淡，
呈偏花椰菜类型。花粉具有一定的活力。在人工辅助授粉下可以获得一定量的自交、回交种子，其
中自交结籽易于回交结籽。通过对这些材料进行的黑腐病抗性筛选，获得了一部分抗病异附加系（表
3）。
表 3 抗病异附加系材料信息
Table 3 Alien addition lines of cauliflower and black mustard showing resistance to Xcc strain CH5
材料
Plant
materials
世代编号
Lineage
表型
Phenotype
长势
Growth
叶色
Leaf colour
叶耳
Ligule
花器
Flower
染色体数
Number of
chromosome
病情指
数
Disease
index
抗性
Resistance
degree
花椰菜
Cauliflower
受体及轮回亲
本 Receptor and
recurrent parent
K 强
Strong
灰绿
Grey green
无
No
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
18 50.86 S
黑芥
B.nigra
供体
Donor parent
N 强
Strong
绿
Green
有
Have
花小，瓣黄
Small，yellow
16 14.58 R
PFCN2 S3BC2-3-3 K 强
Strong
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
26 14.84 R
PFCN2 S3BC2-X-8 M-K 中
Medium
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
26 24.22 R
PFCN5 S3BC1-1-1 K 强
Strong
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
26 14.31 R
PFCN13-2 S1BC4-3-3 K 强
Strong
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
24 25.33 R
PFCN13-2 S1BC4-4-1 K 弱
Weak
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
26 20.95 R
PFCN14-1 S1BC4-123 K 强
Strong
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
26 6.04 HR
PFCN15-2 S1BC4-3-4 K 弱
Weak
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
24 20.71 R
PFCN16-1 S1BC2S1BC1-107 K 中
Medium
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
25 10.07 HR
PFCN29 BC3-3-5 K 中
Medium
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
20 15.17 R
PFCN29 BC3-5-11 K 中
Medium
灰绿
Grey green
有
Have
花大，瓣淡黄
Big，yellowish
24 14.59 R
注：K：花椰菜类型；N：黑芥类型；M：双亲中间类型。
Note：K：Cauliflower type；N：B. nigra type；M：Intermediate type.
花椰菜 Cauliflower 黑芥 B. nigra Wirosa
菌株
Xcc strain
来源
Origin 病情指数
Disease
index
抗性
Resistance
degree
病情指数
Disease
index
抗性
Resistance
degree
病情指数
Disease
index
抗性
Resistance
degree
1 江西 Jiangxi 43.2 T 28.9 R 56.9 S
2 四川 Sichuan 38.6 T 21.2 R 61.8 S
3 福建 Fujian 29.6 R 19.1 R 39.8 T
4 广东 Guangdong 59.8 S 30.9 T 47.2 T
5 北京 Beijing 70.4 HS 8.8 HR 62.6 S
6 湖南 Hunan 30.2 T 9.1 HR 38.9 T
7 浙江 Zhejiang 42.2 T 18.9 R 50.9 S
8 宁夏 Ningxia 60.3 S 15.8 R 69.8 S
9（Race 1） 英国 HRI 33.8 T 18.9 R 40.8 T
10（Race 4） 英国 HRI 54.6 S 15.9 R 48.2 T
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图 3 展示了两份异附加系材料 PFCN16-1 和 PFCN14-1 的叶形、株形及染色体情况。
图 3 异附加系材料 PFCN16-1 和 PFCN14-1 的叶片和苗期形态及染色体数
N：黑芥；PFCN16-1：杂种后代，染色体数 25；PFCN14-1：杂种后代，染色体数 26；K：花椰菜。
Fig.3 Leaf，seedlings and chromosome number of alien addition line
N：B. nigra；PFCN16-1：Hybrid progeny，chromosome number 25；PFCN14-1：Hybrid progeny，
chromosome number 26；K：Cauliflower.

选择对黑腐病达到了抗或高抗且形态都更偏向于花椰菜的 3 个附加系单株 PFCN29 BC3-3-5、
PFCN16-1 S1BC2S1BC1-107 和 PFCN14-1 S1BC4-123，对其基因组组成进行了 GISH 鉴定。3 个单株
为花椰菜染色体组（2n = 18）分别附加黑芥染色体 2 条、7 条和 8 条（图 4）。对于其他重要材料染
色体组成还将进一步鉴定和明确。
图 4 异附加系的基因组原位杂交分析
蓝色为花椰菜染色体；红色为黑芥染色体。
Fig. 4 GISH analysis of the alien addition lines
Blue：Cauliflower chromosome；red：B. nigra chromosome.
1908 园 艺 学 报 38 卷
3 讨论
3.1 体细胞杂种早代染色体的排除与稳定
Ozkan 等（2001）对小麦与其野生种的杂种（Aegilops–Triticum）及自交后代基因组快速进化
研究中发现，自杂种 F1 代开始染色体序列发生大规模排除，持续到自交 2 ~ 3 代并开始逐步稳定。
Song 等（1995）也发现在芸薹属新合成的多倍体中，基因组序列的消减和变化主要发生在杂种形成
后的第 1 ~ 5 代。本研究中，体细胞杂种形成后的第 3 ~ 5 代 DNA 含量介于 1.33 ~ 2.58 pg · cell-1 之
间，染色体数变化范围为 18 ~ 38 条，与杂种一代（1.81 ~ 5.16 pg · cell-1，21 ~ 68 条）（郝薇薇，2008）
相比变化范围都明显变窄。而且，虽然杂种后代个别植株依然具有一定程度的混倍特性，但同一植
株不同细胞中染色体数的变化范围比体细胞杂种 H1 代明显缩小。这种变化可能有利于杂种染色体趋
向最终的稳定和一致，表明多倍体形成的早代是染色体排除和丢失的主要时期。
3.2 体细胞杂种后代形态变异丰富
花椰菜—黑芥体细胞杂种及后代植株的 DNA 含量不一，形态变异广泛，包括株高、叶形、分
枝、花形等表型变异丰富。体细胞杂交中，基因组在常规遗传、非常规遗传、互作和表观遗传上都
发生了大规模的重建（Madlung & Comai，2004）。在多种人工合成多倍体植物中，都报道过有关
基因组剂量效应，遗传序列丢失，染色体重排，基因沉默，表观遗传变异和转座子激活等现象（Song
et al.，1995；Matzke et al.，1999；Comai，2000；Tu et al.，2008）。除了核基因组相关的改变，体
细胞杂交中胞质组分的重组改变及两个亲本胞质和核基因组之间的冲击和协调也是表型遗传变异的
原因（Du et al.，2009）。本试验中获得的花椰菜—黑芥体细胞杂种和后代群体也为以上相关研究提
供了良好材料。目前在后代群体中，已经鉴定出 5 份在形态特征、开花习性上具有不同于双亲类型
特征的材料，获得的 20 份异附加系材料也表现了广泛的遗传多样性，例如早抽薹，初步表现抗病、
虫等，其中也不乏具有偏亲（花椰菜）性状、育性好的植株，表明采用体细胞杂交技术手段来改良
甘蓝类蔬菜的遗传多样性具有可行性。
3.3 体细胞杂种回交与黑腐病抗性转育
甘兰类蔬菜的黑腐病抗性由多个显性基因控制（Camargo et al.，1995；Sharma et al.，1995），
且普遍存在的是对生理小种 3 的抗性（Vicente et al.，2001，2002），其抗性不具稳定性、显著性和
广谱性，同时特别缺乏对常见黑腐菌种 1 和 4 的抗性。研究表明，黑芥（BB 基因组）中的抗黑腐
病基因不同于甘蓝，存在对致病小种 1 和 4 的抗性，且可能为显性单基因控制（Vicente et al.，2002）。
另外，由于病菌株系的变异性，植物基于主基因的抗病性很快会被其它病菌株系突破（Li et al.，
2005）。因此，在一种材料中引入来源不同的多种抗病基因，这种抗性基因的堆叠（gene stacking）
是实现新材料对病虫害具备持续多抗性的重要策略（Wang et al.，2006）。
本试验中筛选出了 1 个黑腐菌株 CH5 属于黑腐菌生理小种 4（未发表），具有致病力强，在融合
亲本花椰菜和黑芥上致病性差异极显著的特点。采用该菌株进行的抗病性人工接种，将 3 年的抗病
鉴定结果做综合考虑，发现虽然 3 年的鉴定材料不同，鉴定条件有异，病情指数不同，但材料的抗
病性归类还是有一定方向性，亲本花椰菜的病情指数总在 50 ~ 60 间，黑芥的病情指数总在 10 ~ 25
之间，分别归属于感病及抗病类型；体细胞杂种的自交后代一般表现为抗病，病情指数 10 ~ 30，带
有回交成分后代的病情指数差异较大，分布于抗病及感病类型。这一结果显示，杂种在回交过程中，
随着黑芥染色体的不断丢失，其位于某条或某几条 B 染色体上的抗黑腐病基因也可能随之丢失，从
10 期 王桂香等：花椰菜—黑芥体细胞杂交获得抗黑腐病异附加系新材料 1909

而造成部分回交后代杂种植株的病情指数升高，抗病性消失。经过连续的筛选已经获得了高抗株系
12 个，抗性株系 17 个，抗黑腐病且 B 染色体数在 8 条以下的材料（抗病异附加系）占全部材料的
14%（对其中 3 株进行了染色体组成的 GISH 鉴定）。以上说明了通过体细胞杂交进行抗病性转育的
可行性。下一步将继续进行回交和自交，期望在后代中能够有抗黑腐病的单体附加系或渐渗系，作
为桥梁材料或直接应用于花椰菜抗病育种；并对这些材料进行系统的细胞学和分子生物学分析，以
期能够确定抗黑腐菌株 CH5 基因的染色体定位和连锁标记。

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