全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (1) : 81 - 86
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 05 - 09; 修回日期 : 2008 - 12 - 10
基金项目 : 浙江省自然科学基金项目 ( Y307472) ; 浙江省新苗人才计划项目 (2007R40G2030177)3 E2mail: gwd@ zjnu1com; Tel: 0579282282346
低温胁迫下佛手半致死温度测定和抗寒性分析
郭卫东 3 , 张真真 , 蒋小韦 , 陈民管 , 郑建树 , 陈文荣
(浙江师范大学生化学院 , 浙江金华 321004)
摘 　要 : 以 ‘青皮 ’和 ‘矮化 ’佛手 (C itrus m ed ica var. sarcodacty lis Swingle) 为试材 , 测定不同低温
处理 24 h后叶片的电解质外渗率 (REC) , 计算半致死温度 (LT50 ) ; 在半致死温度下设置不同处理时间 ,
测定 REC、超氧化歧化酶 ( SOD ) 活性、游离脯氨酸 ( Pro) 和丙二醛 (MDA ) 含量 , 进行抗寒性分析。
结果表明 : 佛手 REC随温度降低及处理时间延长呈 “S”型上升 , LT50在 - 4～ - 5 ℃之间 ; 在 LT50下 , 随
着处理时间的延长 SOD活性呈先上升后下降的趋势 , Pro和 MDA含量逐渐上升 ; 12～24 h为佛手在 LT50下
冷害发生的临界时间。
关键词 : 佛手 ; 电解质外渗率 ; 半致死温度 ; 超氧化歧化酶 ; 游离脯氨酸 ; 丙二醛
中图分类号 : S 686; S 666　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2009) 0120081206
Sem iletha l Tem pera ture of F ingered C itron ( C itrus m edica var. sa rcodac tylis
Sw ingle) under L ow Tem pera ture Stress and Eva lua tion on The ir Cold Re2
sistance
GUO W ei2dong3 , ZHANG Zhen2zhen, J IANG Xiao2wei, CHEN M in2guan, ZHENG J ian2shu, and
CHEN W en2rong
(College of Chem istry and L ife Science, Zhejiang N orm al U niversity, J inhua, Zhejiang 321004, Ch ina)
Abstract: The sem ilethal temperatures (LT50 ) of two cultivars of fingered citron ( C itrus m ed ica var.
sarcodacty lis Swingle) ‘Q ingp i’and‘A ihua’were calculated and their resistance to low temperature stress
was evaluated. The relative electric conductivity (REC) in leaves of the two cultivars were determ ined and
their sem ilethal temperatures (LT50 ) were determ ined after the p lants had been treated under a series of low
temperatures for 24 h. Then the REC, superoxide dismutase ( SOD ) activity, the malondialdehyde (MDA )
and free p roline ( Pro) contents were analyzed under LT50 after a serial treatment period. The results showed
that the REC of the both cultivars increased following an S2curve with the temperature drop and the extension
of time and the LT50 was between - 4 and - 5 ℃. The activity of SOD increased at the beginning of cold
treatment at LT50 then decreased. Contents ofMDA and Pro gradually increased with the extension of time. 12
- 24 hours was considered to be a critical period for cold injury of C. m edica under the LT50.
Key words: fingered citron; C itrus m edica var. sa rcodacty lis Swingle; relative electric conductivity;
sem ilethal temperature; superoxide dismutase; free p roline; malondialdehyde
佛手 (C itrus m edica var. sa rcodacty lis Swingle) 是我国和东南亚地区特有的柑橘属植物 , 果实形状
奇特 , 果端开裂成指状或拳状 , 具有较高的观赏和药用价值。在我国 , 佛手的栽培地主要分布在浙
江、广东、广西、四川、福建等地 , 其中浙江栽培的佛手与广东等地有较大差异 , 具有树体较矮小 ,
栽培管理方便等特点 , 适宜制作观赏盆景 (周春丽和郭卫东 , 2005)。但佛手的抗寒力较差 , 在亚热
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带及以北地区栽培时冬季需要设施保护 , 增加了生产成本 , 同时也影响了佛手的品质和产量 (陈秉
初和申屠文月 , 2003)。由于佛手特有区域的限制 , 国内外对其抗寒性研究还相当匮乏。因此 , 探讨
佛手的抗寒胁迫生理 , 寻找提高抗寒性的新途径 , 对于进一步开发利用我国特有的观赏植物资源具有
重要意义。
本研究中以浙江金华地区主栽佛手品种 ‘青皮 ’和经 137 Cs2γ射线辐射诱变产生的佛手新株系
‘矮化 ’ (郭卫东 等 , 2006) 为试材 , 研究低温胁迫下电解质外渗率 (REC) 的变化 , 配合 Logistic
方程 , 测定其半致死温度 (LT50 ) , 并通过分析佛手在低温胁迫下 SOD活性、Pro和 MDA含量等生理
指标的变化 , 对其抗寒性进行评价。
1　材料与方法
111　试验材料
试验于 2007年 9—10月在浙江师范大学进行。从浙江师范大学佛手实验基地 ———浙江锦林佛手
有限公司选取长势一致的两年生 ‘青皮’和 ‘矮化 ’佛手盆栽苗 , 在人工气候室进行预培养及抗寒
锻炼。
参照刘祖祺等 (1990) 的方法 , 预培养温度为 20 ℃ (夜 ) /28 ℃ (昼 ) , 光照每天 14 h, 光照
强度 100μmol·m - 2 ·s- 1 , 相对湿度 75% , 定期浇水 ; 预培养 3周后在 2 d内将温度缓慢降至 4 ℃进
行冷锻炼 7 d。
112　低温处理
冷锻炼后每个品种随机取 3盆移入 LF220电脑自动控温冷库 (宁波莱福公司制造 ) , 温度分别设
为 0、 - 1、 - 2、 - 3、 - 4、 - 5、 - 6、 - 7 ℃, 处理 24 h, 温度控制精度为 ±011 ℃ (用水银温度
计进行校准 ) , 光照 14 h, 相对湿度 75%。取完整、无病虫害的当年生春夏梢自顶向下数第 5～11叶
位的 7张叶片用于分析测定 , 3次重复。
根据朱根海等 (1986) 有关组织半致死温度的计算方法 , 配合 Logistic方程 , 计算出佛手半致死
温度 (LT50 ) , 半致死温度 (LT50 ) 下设置处理 0、12、24、36、48、60 h取样 , 进行生理生化分析。
单株重复 3次。
113　测定方法
电解质外渗率 (REC) 的测定参考张志良 (1990) 的方法 ; 超氧化物歧化酶 ( SOD ) 活性测定
采用 SOD抑制氮蓝四唑 (NBT) 光化还原法 ( Giannop litis & R ies, 1977) ; 丙二醛 (MDA ) 含量测定
参考刘祖祺和张石诚 (1994) 的方法 ; 游离脯氨酸 ( Pro) 含量的测定参照萧浪涛和王三根 ( 2005)
的方法。
2　结果与分析
211　不同低温胁迫下佛手电解质外渗率的动态变化
在 0、 - 1、 - 2 ℃低温胁迫下两个佛手品种的叶片基本正常。 - 4 ℃胁迫下多数叶片冻伤 , 呈现
出水渍状、下垂等典型冻伤症状 , 1 d后叶片卷曲、干枯。 - 5、 - 6、 - 7 ℃下全部叶片冻伤。
低温处理 24 h内 , 青皮、矮化佛手叶片的电解质外渗率随低温下降呈 “S”型曲线变化 (图 1) ,
在高于 - 4 ℃温度处理下 , 叶片的电解质外渗率为 1517%～3513%。 - 4 ℃处理下 , 青皮佛手叶片的
电解质外渗率增加到 6315%、矮化佛手增加到 4514% , - 5 ℃处理下青皮和矮化佛手分别达到
8614%和 8412% , 温度低至 - 6～ - 7 ℃时 , 变化趋势平缓。形态上观察到的佛手受冻情况与电解质
外渗率的变化趋势相符。
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　1期 郭卫东等 : 低温胁迫下佛手半致死温度测定和抗寒性分析 　
图 1　不同低温处理 24 h后佛手叶片电解质外渗率变化
F ig. 1　The rela tive electr ic conductiv ity of C. m edica leaves after exposure to d ifferen t low tem pera tures for 24 h
212　低温胁迫下佛手半致死温度
从图 1可以看出 , 在相同处理时间里 , 青皮、矮化佛手叶片的电解质外渗率均随着温度的降低逐
渐增大 , 呈 “S”型上升。
青皮佛手的半致死温度 (LT50 ) 为 - 4110 ℃, 矮化佛手为 - 4149 ℃ (表 1)。矮化佛手比青皮佛
手 LT50低 0139 ℃, 说明矮化佛手抗寒力比青皮佛手强。
表 1　青皮佛手及矮化佛手半致死温度 ( L T50 )
Table 1　The sem iletha l tem pera tures ( L T50 ) of Q ingp i and A ihua
品种
Cultivar
处理温度 /℃
Treat temperature
拟合方程
Logistic equation
拟合度
ryx
半致死温度 (LT50 ) /℃
Sem ilethal temperature
青皮 Q ingp i - 7～0 y = - 2173 + 0167x 019547 - 4110
矮化 A ihua - 7～0 y = - 4185 + 1108x 019388 - 4149
213　L T50处理时间对电解质外渗率的影响
从图 2看出 , 在 LT50下 , 随着处理时间逐渐延长 , 叶片的电解质外渗率逐渐增加 , 变化曲线呈
“S”型 , 处理 12～24 h时变化显著 , 青皮佛手由 1711%增加到 5912% , 矮化佛手由 1615%增加到
4413% , 分别比 12 h时增加了 315倍和 217倍 , 表明 12～24 h为青皮佛手和矮化佛手 LT50下冷害发
生的临界时间。
图 2　L T50不同处理时间佛手叶片电解质外渗率变化
F ig. 2　Changes in rela tive electr ic conductiv ity of C. m edica leaves w ith tim e of exposure to L T50
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214　L T50处理时间对 SOD活性的影响
在 LT50下 , 两个品种的叶片 SOD活性的变化规律基本一致 , 呈先上升后下降的趋势 , 并在 24 h
时增加到最大值 (图 3)。24 h时 , 青皮佛手的 SOD活性是对照的 314倍 , 矮化佛手是对照的 211倍。
两个品种的 SOD活性在 24 h前增加幅度相近 ; 处理长于 24 h后 , 青皮佛手下降的幅度显著大于矮化
佛手。
图 3　L T50下佛手叶片 SOD活性变化
F ig. 3　Changes in SOD activ ity in C. m edica leaves w ith tim e of exposure to L T50
215　L T50处理时间对 Pro和 MDA含量的影响
在 LT50下 , 随着低温胁迫时间的延长 , 两个品种叶片的 Pro含量总体呈上升趋势 (图 4) , 0～12
h增长缓慢 , 但 12～24 h急剧增加 , 36～60 h趋向平缓。60 h时矮化佛手的 Pro含量是处理前的 812
倍 , 青皮佛手是处理前的 8倍 ; 矮化佛手的 Pro含量及其增加幅度均高于青皮佛手。
图 4　L T50下佛手叶片 Pro含量的变化
F ig. 4　Changes in con ten t of proline in C. m edica leaves w ith tim e of exposure to L T50
佛手的 MDA含量与 Pro含量的变化有相同的趋势 , 也是随着低温胁迫时间的延长而不断上升
(图 5)。但相反的是在低温胁迫的各个时间 , 青皮佛手 MDA含量及其增加幅度均高于矮化佛手。60
h时青皮佛手 MDA含量是低温处理前的 214倍 , 而矮化佛手是处理前的 212倍。
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　1期 郭卫东等 : 低温胁迫下佛手半致死温度测定和抗寒性分析 　
图 5　L T50下佛手叶片 MDA含量的变化
F ig. 5　Changes in con ten t of MDA in C. m edica leaves w ith tim e of exposure to L T50
3　讨论
半致死温度 (LT50 ) 是评价一个物种抗寒性强弱比较准确的指标 (朱根海 等 , 1986; 罗正荣和
章文才 , 1994; 徐康 等 , 2005)。本研究应用此方法计算出青皮、矮化佛手的 LT50分别为 - 4110 ℃
和 - 4149 ℃, 并推算出佛手在 LT50下的冷害发生的临界时间为 12～24 h。两者的半致死温度虽然相
差不大 , 但在浙江中部地区冬天实际低温 ( 0～ - 2 ℃) 下 , 矮化佛手表现出明显优于青皮佛手的生
长势及更强的抗寒性 , 深入研究其抗寒机制将有助于解决佛手种植中不耐寒的问题。
当植物受到低温胁迫时 , 自由基积累过多 , 就会伤害细胞 (Mccord & Fridovich, 1969) , 导致膜
脂过氧化 , SOD活性降低 (Mead, 1976)。本研究中发现 , 在 LT50下 , 随着低温胁迫时间的延长 , 两
个佛手品种叶片 SOD活性均先上升后下降 , 24 h达到最大值。上升阶段可能是由于低温胁迫处理初
期诱导 SOD活性增加 , 有助于清除低温造成的细胞内的自由基积累 , 从而保护佛手的细胞膜系统 ,
提高了佛手的抗寒性 , 这是植物本能地对低温进行抵御的机制。但是随着低温胁迫时间的延长 , 低温
造成的伤害最终打破了体内的代谢平衡 , 酶活性不可逆转的下降 , 清除自由基的能力下降 , 动态平衡
失调 , 表现出伤害。两个佛手品种 SOD活性增加幅度相近 , 而青皮佛手 SOD活性下降幅度显著大于
矮化佛手 , 可以认为青皮佛手对低温胁迫更加敏感。
有研究表明 , 植物抗寒性与 Pro含量成正相关 ( Cote et al. , 1989) , 而与 MDA含量呈负相关
(刘祖祺和张石诚 , 1994)。本研究结果与以往的研究结论吻合 , Pro和 MDA含量均随着低温胁迫时
间的延长不断增加。两个佛手品种相比较而言 , 在相同低温处理下矮化佛手叶内积聚的 Pro要多于青
皮佛手 , 而 MDA含量则显著低于青皮佛手 , 表明矮化佛手膜脂过氧化程度低于青皮佛手 , 具有强于
青皮佛手的抗寒力。
本研究中 SOD活性、Pro与 MDA含量的结果以及半致死温度 (LT50 ) 的结论均表明 , 矮化佛手
具有强于青皮佛手的抗寒力 ; 同时 , 本研究结果表明从佛手半致死温度 (LT50 ) 入手 , 结合生理生化
指标评价佛手抗寒性的方法简便、灵敏、准确性高 , 可以作为不同佛手品种抗寒性比较和抗寒品种选
育的量化指标。而冷害临界时间的确定为今后研究佛手抗寒性弱的分子机理提供了合适的处理时间。
佛手作为我国特有的种质资源 , 探讨其寒胁迫生理 , 对于今后研究佛手抗寒性弱的分子机理 , 寻找提
高佛手耐寒性的新途径 , 扩大佛手栽培适应区域和进一步开发利用这一植物资源都具有重要作用。
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