全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 艺 学 报 2006, 33 (3) : 566～570
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 07 - 05; 修回日期 : 2005 - 12 - 30
基金项目 : 四川省教育厅资助项目 (2004A030)
刚竹属 ( Phyllostachys) 23个观赏竹种间亲缘关系的
RAPD分析
高素萍 1 任艳军 1, 2 陈其兵 1
(1 四川农业大学林学园艺学院 , 四川雅安 625014; 2 四川西南勘查设计院 , 四川成都 610066)
摘 要 : 本文采用 RAPD技术分析了刚竹属 23个种或变种的 DNA多态性。从 37个随机引物中选出多
态性效果好的 6个引物 , 共获得 47个 DNA扩增片段 , 大小处于 013～1105 kb, 扩增表现出明显的多态性 ,
高达 9316%。对 RAPD产物进行相似系数统计和聚类分析 , 结果同形态分类结果基本吻合 , 但其中个别竹
种出现了不同结果 , 即 : 与种和其变种是聚在一类的结论不一致 , 因此 , 对个别竹种有待进一步研究。
关键词 : 刚竹属 ; 引物 ; DNA多态性 ; 遗传距离 ; 亲缘关系
中图分类号 : S 68 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0320566205
RAPD Ana lysis of Genetic Rela tion sh ips am ong the 23 O rnam en ta l Bam boo
Spec ies in Phyllos tachys
Gao Sup ing1 , Ren Yanjun1, 2 , and Chen Q ibing1
(1 College of Forestry and Horticulture, S ichuan Agricultrual U niversity, Yapian, S ichuan 625014, China; 2Academ y of Southwest
Exploration and D esign, Chengdu, S ichuan 610066, China)
Abstract: 23 species of Phyllostachys were analyzed by amp lified polymorphic DNA s ( RAPD s). Six
p rimers out of 27 random p rimers showed high polymorphism. Totally 47 of the polymorphic amp lification DNA
fragments were obtained. The length ranged from 013 kb to 1105 kb. The polymorphic amp lification has
showed distinct polymorphism , about 9319%. The results of cluster analysis and sim ilarity coefficient statistics
from RAPD, analysiswere dentical in the main with that from morphological taxonomy, although a few species
not in good agreement with the morphological p roperties. This species need to be studied further.
Key words: Phy llostachys; Primer; Amp lified polymorphic DNA s; Genetic distance; Genetic Relation2
ship s
刚竹属 ( Phy llostachys) 植物在我国有 50余种 , 在竹亚科中系种类最多的属。除新疆、内蒙、东
北、青海等地外 , 全国各地均有自然分布或栽培。该属是竹类植物中较耐寒的类群 , 成为我国北方地
区发展竹类生产和园林绿化的主要栽培对象 , 并成为 “南竹北移 ”的首选种类。
竹类植物在有花植物中具有特殊的生长发育规律 , 形态特殊多变 , 且大多不开花或不常开花 , 这
决定了竹类植物难以用传统的花、果等形态为主的分类方法加以区分。目前大多数学者用竹营养体来
分类 , 但还无法做到仅靠营养体外部形态特征来鉴别竹属 , 更无法确定 1个属或 1个种在整个系统中
的地位〔1〕。本研究对刚竹属中观赏价值较高的 23个竹种进行种间亲缘关系的分子研究 , 在传统形态
分类基础上 , 从分子水平确定种间的亲缘关系。其结果不仅对一些传统分类方法和结果有一定的补充
和完善 , 而且为今后培育新品种 , 丰富园林植物材料有一定现实意义。
1 材料与方法
111 试材
试材为刚竹属观赏价值高、园林绿化中广泛运用的 23个竹种 , 详见表 1。选取竹子嫩叶 , 每种
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3期 高素萍等 : 刚竹属 ( Phyllostachys) 23个观赏竹种间亲缘关系的 RAPD分析
取样 3～5株 , 野外采集用冰壶和变色硅胶快速干燥 , 带回实验室后置于 - 70℃下低温保存 , 每个种
的样品混和后用于提取 DNA。
表 1 供试竹种一览表
Table 1 The bam boo spec ies tested in the exper im en t
编号
Code
种名
Chinese name
of species
拉丁学名
Latin name of species
编号
Code
种名
Chinese name
of species
拉丁学名
Latin name of species
1 人面竹 Phyllostachys aurea Carr. exA. etc. riviere 13 黎子竹 P. heteroclada f. purpurata (McClure)W en
2 紫竹 P. nigra (Lodd. )Munro. var. nigra 14 云和乌哺鸡竹 P. yunhoensis S. Y. Chenet C. Y. Yao
3 筠竹 P. glauca f. uouzhu J. L. Lu 15 黄槽竹 P. aureosulcata McClure
4 绿皮黄筋竹 P. Sulghurea cv. Houzeau 16 黄槽毛竹 P. heterccycla cv. Luteosulcata
5 黄槽石绿竹 P. arcane f. lu teosulca ta C. D. Chu et C. S. Cha 17 花毛竹 P. heterccycla cv. Tao Kiang
6 毛金竹 P. nigra var. henonnis (m itford) Stapfex Rendle 18 龟甲竹 P. heterccycla (Carr. )M itford
7 金镶玉竹 P. aureosulcata f. spectabilis C. D. Chu et C. S. Chou 19 黄条早竹 P. praecox f. notata S. Y. Chen et C. Y. Yao
8 黄皮竹筋竹 P. su lphurea cv. Robert young 20 黄秆乌哺鸡竹 P. vivac f. aureocaulis N. X. Ma
9 京竹 P. aureosulca ta f. pekinensis 21 黄纹竹 P. vivax f. huanw enahu J. L. Lu
10 斑竹 P. banbusoides f. lacrim adeae kengf. etW e 22 早竹 P. praecox C. D. Chu et C. S. Chao
11 黄秆京竹 P. aureosulcata f. aureocaulia Z. P. Wang et N. X. Ma 23 乌哺鸡竹 P. vivax McClure
12 强竹 P. heterccycla cv. Obliquinoda
注 : 采集地均为四川宜宾长宁县 “世纪竹园”。
Note: The samp les were collected in the bamboo garden, Changning county, Sichuan.
112 基因组 D NA的提取
DNA的提取与纯化采用改进的 CTAB法〔2～7〕。取 10～50 g新鲜叶片 , 在无菌水下洗涤 , 吸干后
放入液氮中冻结。用研钵将叶片研成粉状 , 迅速倒入 5 mL的试管中 , 量为试管的 1 /3～1 /2即可。将
2 mL预热的 1 ×CTAB缓冲液 (50 mmol/L Tris2HCl pH 810, 017 mmol/L NaCl EDTA , 1% CATB , 20
mmol/L 2 -巯基乙醇 ) 加入磨碎的叶片中 , 轻轻摇匀 , 65℃水浴 40 m in, 其间不时摇匀。用等体积的
24∶1的三氯甲烷 /异戊醇抽提匀浆液 , 8 000 r/m in离心 5 m in, 取上清液后 , 再加入等体积的 24∶1的
三氯甲烷 /异戊醇抽提匀浆液 , 摇荡 10 m in, 离心 5 m in, 取上清液 , 重复该步骤 , 直至两液间不再有
乳白色物质存在。加入 1 /100体积 RNA酶贮液 , 颠倒摇匀 , 37℃保温 30 m in。快速加入等体积异丙
醇 (4℃) 沉淀 DNA。将 DNA用 70%乙醇洗 2次 , 再用无水乙醇洗 1～2次。将 DNA晾干 , 加无菌
水溶解 , 置 - 20℃贮存备用。
用核酸蛋白质仪检测 DNA浓度 , 0185%的琼脂糖胶电泳检查 DNA的完整性 , 并稀释至 100 mg/
μL备用。
113 RAPD反应体系建立
此过程包括 RAPD扩增反应体系与反应程序的交叉试验。
优化体系时选择购自北京赛百盛公司的引物 A01 (碱基序列 GAGGCCCTTC) , A15 (碱基序列
TTCCGAACCC) 和 A20 (碱基序列 GTTGCGATCC) , DNA模板选择样 1、样 2和样 3。
体系优化交叉试验设 DNA模板用量和引物两个因素 , 分别取 4个 (20, 30, 40, 50 ng) 和 2个
(50, 100 pmol/μL) 水平进行交叉试验 , 同时结合进行 3个 RAPD扩增反应条件的筛选。
通过筛选 , 本研究扩增反应体系为 : 引物 ( 5 pmoL /μL ) 110μL; 模板 DNA ( 100 ng/μL ) 015
μL; 10 ×buffer 2μL; Mg2 + ( 20 mmol/L ) 110μL; Taq聚合酶 1 U; 116μL dNTP ( dATP、 dTTP、
dCTP、dGTP各 100 pmol/μL ) , 无菌水定容到 20μL。程序按 : 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 45 s,
36℃退火 1 m in, 72℃延伸 1 m in, 反应进行 45个循环 ; 72℃延伸 10 m in; 4℃结束扩增。
114 PCR扩增
取 12μL反应产物 , 加入 1g/mL的溴化乙锭 015μL于 018%琼脂糖凝胶中 , 电极缓冲液为 015 ×
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园 艺 学 报 33卷
TBE, 在 4 V /cm的电场强度下电泳 2 h左右 , EB染色 , 在紫外灯下观察并拍照。
115 RAPD条带分析和数据处理
在记录 RAPD分析过程中 , 位点的取舍不能根据带的强弱 , 重复性好是最重要的取舍标准。不同
种间随机多态 DNA片段相似性计算根据 Jaccard公式〔8〕。
RAPD扩增带有无分别用 “1”和 “0”表示 , 建立数据库文件。利用 NTSYS (2110版 ) 软件进
行统计分析 , 根据遗传距离采用不加权算术平均法进行聚类分析 , 建立聚类分析树状图〔9〕。
2 结果分析与讨论
211 引物的筛选和 RAPD多态性
对购自北京赛百盛公司的 37条 10碱基随机
引物进行筛选 , 选出 6条扩增产物较多、谱带清
晰、多态性较好的引物用于 RAPD扩增 , 分别是
A15、B10、B15、 C20、 C12、D12、D15。其中
D15对 23个样品具有很好的多态性 , 因此将其作
为样品鉴定的有效引物 (表 2、图 1)。
由表 2、图 1可见 , 37个随机引物对 23个竹
种扩增 , 其中 6个引物扩增的电泳图谱较清晰 ,
均能反映出试验材料基因组的多态性。共获得 47
个位点 DNA扩增片段 , 大小 013～1105 kb, 其中 表 2 6个引物扩增结果Table 2 The am plif ied results using the selected 6 pr im ers引物Primer 碱基序列(5pi～3pi)The sequenceof the p rimer 总条带数 Totalamp lifi2ed bands公共条带数 Commonamp lifiedbands 多态条带数 Thepolymor2phicbands 多态性Percentageof polymo2rphicbands( % )A15 TTCCGAACCC 9 0 9 100B10 GTGCTGGGAC 7 0 7 100B15 GGAGGGTGTT 8 0 8 100C20 ACTTCGCCAC 6 2 4 6617D12 CACCGTATCC 8 0 8 100D15 CATCCGTGCT 9 1 8 8819合计 Total 47 3 44 9316
44个位点具有多态性 , 高达 9316%。平均每条引物扩增出 718条带 , 713条多态性带 , 引物 A15扩
增出 , 多态性条带最多 , 占总数的 20145%。
以上结果表明 , 同属不同种间有极其丰富的遗传多样性 , 且各种间具有一定差异性 , 这符合刚竹
属竹种地理分布广泛的事实。
图 1 随机引物 D15扩增的 23个竹种 D NA图谱
M: DNA marker; 1～23: 样品 1～23, 下同。
F ig. 1 Am plif ied prof ile of pr im er D15 for 23 ornam en ta l bam boo spec ies
M: DNA marker; 1 - 23: Samp le 1 - 23, the same below.
212 种间遗传相似聚类分析
由表 3可见 , 23个观赏竹种的平均遗传距离为 014073, 变异幅度在 010870～017587。遗传距离
和变异幅度均较大 , 进一步说明它们具有较高的遗传多样性。
按传统形态分类学观点 , 同一种的变型种或栽培种之间遗传距离较小 , 不同种间遗传距离较大。
本试验结果也证明此结论基本正确。如毛竹的 4个变型种强竹、黄槽毛竹、花毛竹和龟甲竹的遗传距
离在 010870～012123, 金镶玉竹和黄秆京竹为 011272, 人面竹与乌哺鸡竹变型种的黄纹竹和水竹组
的黎子竹间的遗传距离都为 017035, 说明它们之间的亲缘关系较远。以上证明了利用分子标记手段
检测种间遗传多样型的可靠性。
根据遗传距离将 23个竹种分为 L1和 L2两个层面。L1处遗传距离为 014492, 可将 23个竹种分
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3期 高素萍等 : 刚竹属 ( Phyllostachys) 23个观赏竹种间亲缘关系的 RAPD分析
表 3 根据 RAPD数据计算的 23个试验材料的遗传距离矩阵
Table 3 Genetic d istance of the 23 exam ined ma ter ia ls on 47 RAPD bands
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 010000
2 015871 010000
3 013435 014242 010000
4 013213 012842 012801 010000
5 014808 012324 015076 013602 010000
6 014559 012365 014266 012708 012554 010000
7 014048 012624 013064 012301 012324 013543 010000
8 015258 014887 014964 012801 012712 014266 014242 010000
9 016931 012506 015258 013784 012695 013914 013507 013435 010000
10 014825 013849 012664 013013 014037 013143 013277 015177 014219 010000
11 014387 011680 013944 012668 011460 012704 011272 012890 012050 013103 010000
12 014006 012524 013629 013407 012712 012930 012524 013629 015258 014487 012890 010000
13 017035 014433 014510 015829 013370 014552 013787 014510 014803 013387 013489 014510 010000
14 014559 014879 013576 014784 013126 015108 013543 013576 013308 014478 013816 014266 013121 010000
15 015352 014181 013568 013346 012939 012869 012750 012827 013811 014581 013630 013568 013914 012128 010000
16 015471 012736 013842 013620 012412 013788 012736 013842 014219 012877 012615 012123 013387 014478 013040 010000
17 015471 012736 013236 013620 012925 014478 013277 013842 014825 014055 013103 011610 014032 014478 013781 010870 010000
18 016161 012736 013842 014265 012412 013788 013849 013842 013648 014055 013103 012123 014032 013788 013781 011335 010870 010000
19 016242 014048 014613 015726 012695 015990 014619 014613 013365 014825 013874 015258 014158 013914 015352 014219 013648 013107 010000
20 015871 014249 015577 014665 012812 014879 013677 013636 013507 015790 012550 015577 015123 014879 014181 014455 013849 013849 012506 010000
21 017035 015123 015251 015829 013976 015352 015123 015251 014803 016264 013489 016051 014055 016222 015737 015463 014722 014722 012980 011556 010000
22 016365 012940 015381 015159 013129 016224 014053 014691 013852 014904 012819 015381 014236 013993 016609 014259 013653 013653 012798 014053 014236 010000
23 014303 017034 015551 014528 015552 016675 013932 016421 017404 015763 014812 016421 016919 016675 015237 014963 015763 017587 014993 013287 014295 015968 010000
成 3类 (图 2) , 即第 1类 : 人面竹、乌哺鸡竹 ;
第 2类 : 紫竹、黄槽石绿竹、金镶玉竹、黄秆京
竹、京竹、绿皮黄筋竹、毛金竹、强竹、黄槽毛
竹、花毛竹、龟甲竹、黄皮绿槽竹、云和乌哺鸡
竹、黄槽竹、筠竹、斑竹、黎子竹 ; 第 3类 : 黄
条早竹、黄秆乌哺鸡竹、黄纹竹、早竹。
L2处遗传距离为 013310, 将 23个竹种分成
9类 , 即第 1类 : 人面竹 ; 第 2类 : 乌哺鸡竹 ;
第 3类 : 紫竹、黄槽石绿竹、金镶玉竹、黄秆京
竹、京竹、绿皮黄筋竹、毛金竹 ; 第 4类 : 强竹、
黄槽毛竹、花毛竹、龟甲竹 ; 第 5类 : 黄皮绿槽
竹、云和乌哺鸡竹、黄槽竹 ; 第 6类 : 筠竹、斑
竹 ; 第 7类 : 黎子竹 ; 第 8类 : 黄条早竹、黄秆
乌哺鸡竹、黄纹竹 ; 第 9类 : 早竹。
此结果证实了竹种与其变型种聚为一类 , 表
明种内和种间关系的树系图与形态分类的结果基
本吻合 , 但其中个别竹种出现了不同结果 , 如 ,
黄秆乌哺鸡、黄纹竹与原变栽培型乌哺鸡没有聚
在一类 , 而与黄条早竹和旱竹聚为一类 , 说明黄
条早竹、黄秆乌哺鸡竹、黄纹竹、旱竹可能是由
图 2 23个竹种遗传距离聚类树状图
F ig. 2 D endrogram ba sed on the genetic d istance ma tr ices
con structed by the m ethod of UPGM A
乌哺鸡竹进化而来 ; 又如乌哺鸡竹没有与其变型种聚在一起 , 而是与人面竹聚在一起 , 这与种和其变
型种聚为一类的结论不符。
《中国植物志 》中属于水竹组的黎子竹并没有与其它 22个属于刚竹组的种或变型种有明显的区
别 , 而是与它们遗传距离较近 , 表明其亲缘关系较近。这是本试验得出的不同于形态分类学的结果 ,
有待进一步研究。
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园 艺 学 报 33卷
总之 , 聚类结果基本符合吴海清等 (1997) 对刚竹属植物地下茎的比较解剖学研究的结果 , 说
明 RAPD技术用于分析属内竹种间、种下级之间遗传多样性和亲缘关系有较高的精确性和可靠性 , 但
个别竹种有待深入研究。
参考文献 :
1 赵奇僧 , 汤庚国. 中国竹子分类的现状和问题. 南京林业大学学报 (自然科学版 ) , 1993, 17 (4) : 1～8
Zhao Q S, Tang G G. The p resent status and p roblem s of bamboo classification in China. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sci2
ences Edition) , 1993, 17 (4) : 1～8 ( in Chinese)
2 秦贺兰 , 游 捷 , 高俊平. 菊花 18个品种的 RAPD分析. 园艺学报 , 2002, 29 (5) : 488～490
Q in H L, You J, Gao J P. RAPD analysis of 18 Chrysanthem um cultivars. Acta Horticulturae Sinica, 2002, 29 (5) : 488～490 ( in Chi2
nese)
3 杨光耀 , 赵奇僧. 苦竹类植物 RAPD分析及其系统意义. 江西农业大学学报 , 2000, 22 (4) : 551～553
Yang G Y, Zhao Q S. Phylogenetic Relatingship s among five pleioblastus species (Bambusoideae) from China and Japan based on random am2
p lified polymorphic DNA. Acta Agriculturae Universitatis J iangxiensis, 2000, 22 (4) : 551～553 ( in Chinese)
4 方 伟 , 何祯祥 , 黄坚钦 , 史钱均 , 林新春. 雷竹不同栽培类型 RAPD分子标记的研究. 浙江林学院学报 , 2001, 18 (1) : 1～5
Fang W , He Z X, Huang J Q, ShiQ J, L in X C. Studies on cultivars of Phyllostachys pxaecox with RAPD molecularmarkers. Journal of Zhe2
jiang Forestry College, 2001, 18 (1) : 1～5 ( in Chinese)
5 师丽华 , 杨光耀 , 林新春 , 郭起荣. 毛竹种下等级的 RAPD研究. 南京林业大学学报 (自然科学版 ) , 2002, 26 (3) : 65～68
Shi L H, Yang G Y, L in X C, Guo Q R. RAPD studies on the grade of infra2species of Phyllostachys edulis. Journal of Nanjing Forestry Uni2
versity (Natural Sciences Edition) , 2002, 26 (3) : 65～68 ( in Chinese)
6 杨光耀 , 赵奇僧. 用 RAPD分子标记探讨倭竹族的属间关系. 竹子研究汇刊 , 2001, 20 (2) : 1～5
Yang G Y, Zhao Q S. RAPD studies on intergeneric relationship s in Shibataeeae Nakai emend Keng f. ( Gram ineae, Bambusoideae) . Journal
of Bamboo Research, 2001, 20 (2) : 1～5 ( in Chinese)
7 吴益民 , 黄纯农 , 王君晖. 四种竹子的 RAPD指纹图谱的初步研究. 竹子研究汇刊 , 1998, 17 (3) : 10～13
W u Y M, Huang C N, W ang J H. Primary study on the RAPD fingerp rinting do four bamboo species. Journal of Bamboo Research, 1998,
(3) : 10～13 ( in Chinese)
8 Jaccard P. Nouvelles recherches surla distribution florale. Bull Soc. Vaud. Sci. Nat. , 1908, 44: 223
9 周志钦 , 李育农 , 王力超. 11种野生苹果种质资源 RAPD标记研究. 西南农业大学学报 , 1998, 20 (1) : 34～37
Zhou Z Q, L i Y N, W ang L C. A p rekim inary study on RAPD markers of wild species in M alusM ill. Journal of Southwest Agricultural Uni2
versity, 1998, 20 (1) : 34～37 ( in Chinese)
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本书由中国农业科学院蔬菜花卉研究所主编 , 已于 2002年 9月出版发行。全书分上、下卷 , 1～6章为上卷 , 包
括根菜类、白菜类、芥菜类、甘蓝类、绿叶菜类及葱蒜类 , 计 2263个品种 , 1347页 ; 7～12章为下卷 , 包括瓜类、
茄果类、豆类、薯芋类、水生蔬菜类和多年生蔬菜类 , 计 2550个品种 , 1177页。入志的品种中 , 地方品种占 90%以
上 , 少量在全国栽培时间较长、种植面积较大的一代杂种也选入其中。本书较全面系统而又有重点地反映了中国丰富
的蔬菜品种资源概貌、研究成果及育种水平 , 可供蔬菜科研、教学、生产及种子公司、农业行政单位的人员参考。本
书出版后受到读者普遍好评 , 现尚有少量存书 , 特以优惠价格 490元 (上、下卷 ) 提供给读者 (原价 980元 )。
购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街 12号中国农科院蔬菜花卉所 《园艺学报 》编辑部 , 邮编 100081。
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