全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (2) : 306～310
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 05 - 08; 修回日期 : 2005 - 11 - 30
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30370975)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jshcao@ zhu1edu)
激素对白菜 GM S系不同育性外植体再生植株的影响
孙保娟　曹家树 3 　向　 　叶纨芝　余小林
(浙江大学蔬菜研究所 , 杭州 310029)
摘 　要 : 以白菜核雄性不育两用系的可育株和不育株带有子房及花柄的花托为外植体 , 比较了不同育
性外植体再生体系的异同 ; 并结合内源激素含量测定 , 探讨了内源激素、外源植物生长调节剂间的相互作
用对不同育性外植体再生的影响。结果表明 : 不育和可育再生体系所需的最佳 NAA浓度分别为 012 mg·L - 1
和 011 mg·L - 1 ; 在最适的 NAA浓度下补给不同浓度的 62BA, 不育外植体不定芽诱导率差异不大 , 而可育
外植体不定芽诱导率则随 62BA浓度的增加表现不规律的变化。不同育性的外植体内源激素含量测定结果
表明 , 可育外植体内源 GA3、 IAA和 ZT含量分别比不育外植体高出 3718%、2810%和 22419% ; ABA含量
则是不育外植体比可育外植体高出 2014%。花柄及花托再生得到的不定芽在不继代或继代次数少的情况下
生根培养时高频现蕾 , 生根率极低 ; 随着继代培养时间的延长 , 生殖生长趋势逐渐减弱 , 生根率明显提高。
关键词 : 白菜 ; 外植体 ; 雄性不育 ; 不定芽诱导 ; 培养基
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0220306205
Effect of Horm ones on the Regenera tion of D ifferen t Explan ts of GM S L ine
in B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis
Sun Baojuan, Cao J iashu3 , Xiang Xun, Ye W anzhi, and Yu Xiaolin
( Institu te of V egetable Science, Zhejiang U niversity, Hangzhou 310029, Ch ina)
Abstract: Recep tacles with ovary and pedicel used as exp lants, the regeneration system s of different fer2
tility exp lants of genic recessive male sterility A /B lines in Chinese cabbage2pak2choi (B rassica cam pestris L.
ssp. ch inensis Makino) were compared. Moreover, it was analysed that the effect on different fertility exp lants
regeneration of interaction between endogenous hormone of exp lant itself and exogenous app lication. Results
showed that the best exogenous NAA concentrations for adventitious shoots induction of the sterile and the fer2
tile exp lants were 012 mg·L - 1 and 011 mg·L - 1 , respectively. W ith the op timal NAA concentrations, shoot
induction rate of sterile exp lants was not significantly affected by 62BA, however, that of fertile showed errati2
cally change with different 62BA concentration. The result of endogenous hormone determ ination showed that
the endogenous contents of GA3 , IAA and ZT in fertile exp lants were 3718% , 2810% and 22419% higher
than in that of the fertile, but ABA content is sterile exp lants was 2014% higher than that of the fertile. The
shoots regenerated from this kind of floral exp lants showed high frequency bolting rate without subculture or
with few times subculture. Butwith the times of subculture increasing, the tendency of rep roductive growth de2
clined whereas the rooting rate enhanced significantly.
Key words: Chinese cabbage2pak2choi; B rassica cam pestris ssp. ch inensis; Exp lant; Male sterile;
Adventitious shoot induction; Culture medium
对于十字花科等主要利用杂种优势的作物 , 人们普遍采用优良的自交不亲和系或雄性不育系进行
杂交种子的生产。利用雄性不育系制种过程中 , 存在着对不育系进行保持的问题。组织培养技术的发
展 , 为雄性不育材料的保存提供了直接快速的途径。白菜 (B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis
Makino) 已有通过子叶〔1～3〕、生长点〔4〕、子叶原生质体〔5〕等不同外植体 , 建立雄性不育亲本再生体
　2期 孙保娟等 : 激素对白菜 GMS系不同育性外植体再生植株的影响 　
系的报道。白菜核雄性不育两用系遗传背景特殊 , 以育性明确的花组织为外植体建立无性繁殖体系 ,
不但可以获得全不育株群和全可育株群 , 而且可以在内源激素含量测定的基础上 , 明确白菜 GMS不
同育性外植体再生过程内源激素含量和外源激素补充的关系 ; 另外 , 对已春化材料为外植体获得的不
定芽继代培养中生根、瓶内现蕾变化规律的研究 , 也可以为以花柄及花托为受体建立遗传转化体系奠
定基础。
1　材料与方法
以 ‘矮脚黄 ’白菜雄性不育两用系 ‘ZUajh97201AB’为试材。开花初期在相同节位上取不育株
和可育株刚开放花朵 (图版 , A ) , 以带有子房及花柄的花托为外植体 (以下简称花柄及花托 ) (图
版 , B ) , 先用自来水冲洗 , 再用 70%的酒精振荡漂洗 30 s, 然后用 011%的 HgCl2 溶液消毒 9 m in,
最后用灭菌水浸洗 4～5次。不定芽诱导以 MS + 20 g·L - 1蔗糖 + 8 g·L - 1琼脂为基本培养基 , 附加不
同浓度的 NAA、62BA, pH 518。每处理接种 30个外植体 , 3次重复。 (25 ±1) ℃和 16 /8 h光暗交替
条件下培养 , 光照强度为 2 000～2 500 lx。20 d时统计愈伤组织诱导率 , 并继代培养 , 以补充不定芽
正常发生所需营养 , 30 d时统计不定芽诱导率。基本培养基上添加不同浓度的 NAA作为不定芽生根
培养基 , pH 518。
外植体内源激素含量测定采用 HPLC法。取 510 g样品 , 用 20 mL 4℃ 80%甲醇 , 研磨后移入离
心管 , 超声抽提 30 m in, 15 000 r·m in - 1离心 15 m in, 收集上清液 , 重复抽提沉淀 2次。上清液过
DEAE色谱柱 , 75 mL 蒸馏水淋洗、收集 , 调 pH 至 315; 过 B io2Rax 70阳离子交换柱 , 70 mL 30
mmol·L - 1的醋酸淋洗 , 弃去淋洗液 , 011 mol·L - 1的醋酸铵冲洗、收集 , 调 pH至 715; 过 Sep2Pak
C18短柱 , 1 mL 80%甲醇洗脱、收集 , 供测定 ZT。上述蒸馏水淋洗过的 DEAE色谱柱用 75 mL 011
mol·L - 1硫酸钠淋洗、收集 , 调 pH至 310, 过 Sep2Pak C18短柱 , 3 mL 10%甲醇溶液淋洗 , 弃去淋洗
液 , 1 mL 50%甲醇溶液淋洗、收集供测定 GA3 ; 再用 1 mL 80%甲醇溶液冲洗 Sep2Pak C18短柱 , 收集
供测定 IAA和 ABA。色谱条件 : Hypersil BDS C18柱 ; 流动相 : GA3 : 10%乙腈 , 012% HAC; IAA和
ABA: 25%乙腈 , 012% HAC; ZT: 8%乙腈 , 012%三乙胺 , 018% HAC; 流速 : 1 mL·m in - 1 ; 波
长 : IAA、ABA和 GA3 为 254 nm; ZT为 268 nm。提取 , 纯化试剂及标样均购于 Sigma公司。
2　结果与分析
211　愈伤组织及不定芽分化的基本情况
在 NAA和 62BA单独使用的情况下 , 虽然都能产生愈伤组织 , 但相对于两者配合使用愈伤诱导率
要低的多 , 尤其是单独使用 NAA的情况下 , 不育外植体愈伤组织诱导率只有 17% , 可育仅为 615%
(表 1)。不定芽的诱导对外源细胞分裂素的需要是必须的 , 在单独添加 NAA的培养基上 , 不能诱导
产生不定芽 ; 而有 62BA存在 , 即使没有 NAA , 也可以诱导产生不定芽。在可诱导产生不定芽的培养
基上 , 在花柄切口和花托两处均可以产生不定芽 (图版 , C) , 并伴有子房膨大。花托处 1周左右可
见绿色芽点 , 个别的可见丛生芽的发生 ; 花柄切口处先形成愈伤组织 , 较致密 , 最早的 10 d时也可
发生不定芽。培养 25 d时 , 花托处不定芽大量产生 , 基本上为丛生芽 , 常有玻璃化现象 (图版 ,
D) ; 培养 30 d时 , 花柄愈伤组织上不定芽集中产生 , 多为健壮单芽。
212　不同育性外植体再生对 62BA、NAA浓度及其配比要求
不定芽诱导过程中 , 不育和可育外植体对 NAA和 62BA的要求存在着一定的差异 (表 1)。当 62
BA浓度为 2 mg·L - 1时 , 不育花托是 NAA 012 mg·L - 1时达到最高诱导率 7711% ; 可育花托是 NAA
011 mg·L - 1时达到最高不定芽诱导率 7216% ; 在不加 NAA的情况下 , 可育外植体的不定芽的诱导
率为 1918% , 明显高于不育的 1110%。不育外植体在 012 mg·L - 1的最适 NAA浓度下 , 随 62BA浓度
变化 , 愈伤和不定芽的诱导率相差不大 ; 可育外植体在 011 mg·L - 1的最适 NAA浓度下 , 随 62BA浓
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
度增加 , 不定芽诱导率表现不规律变化 , 62BA为 2 mg·L - 1和 5 mg·L - 1虽然不定芽诱导率都较高 ,
分别为 7216%和 7818% , 但 62BA为 5 mg·L - 1时每个外植体产生的不定芽较多 , 玻璃化芽的发生频
率增加。因此 , 可育外植体再生最理想的 62BA和 NAA配比为 2 mg·L - 1和 011 mg·L - 1 , 不育外植
体则为 2 mg·L - 1和 012 mg·L - 1。
表 1　不同 NAA、62BA浓度配比对白菜核不育两用系可育株与不育株花柄及花托不定芽分化的影响
Table 1　Effects of horm ones on adven titious shoot d ifferen tia tion v ia fertile receptacle explan t of A /B line in
B rassica cam pestris ssp. ch inenesis‘A ijiaohuang’
配比 Combination (mg·L - 1 )
NAA
可育 Fertile exp lants 不育 Sterile exp lants 62BA 愈伤组织诱导率 Callus induction rate ( % )可育 Fertile exp lants 不育 Sterile exp lants 不定芽诱导率 Shoot induction rate ( % )可育 Fertile exp lants 不育 Sterile exp lants
0 0 2 5713 ±118 e 6511 ±415 d 1918 ±118 hi 1110 ±116 hi
011 011 2 8718 ±317 bc 8414 ±311 c 7216 ±212 c 3012 ±316 f
012 012 2 9211 ±116 abcd 8815 ±316 bcd 2316 ±319 gh 7711 ±316 bc
013 013 2 9619 ±311 ab 9315 ±311 ab 3113 ±311 f 3718 ±315 e
014 014 2 9615 ±311 ab 9910 ±118 a 2216 ±212 gh 1215 ±311 hi
015 015 2 9518 ±712 ab 9516 ±318 ab 2711 ±910 fg 1611 ±511 hi
011 012 0 　615 ±012 h 1711 ±019 g 0 i 0 i
011 012 1 7513 ±416 g 9217 ±518 abc 2319 ±315 gh 7712 ±016 bc
011 012 3 8317 ±314 d 9615 ±312 ab 4013 ±219 e 7712 ±215 bc
011 012 4 8318 ±1510 d 9515 ±114 ab 6611 ±216 d 8318 ±019 ab
011 012 5 100 ±0 a 9810 ±117 a 7818 ±511 bc 8615 ±416 a
　　注 : Duncanpis新复极差测验 , P = 0105, 不同字母表示差异显著。
Note: Duncanpis test at P = 0105, different letter indicates significantly different.
213　白菜核不育两用系可育株与不育株外植体内源激素的含量
在测定的 4种内源激素中 , GA3、 IAA和 ZT含量为可育外植体分别比不育外植体高出了 3718%、
2810%和 22419% ; ABA含量则是不育外植体比可育外植体高出了 2014%。而且 , 不育和可育外植体
内源 IAA含量分别比 ZT高出 3142倍和 8169倍。
214　不定芽生根情况
最初诱导得到的不定芽在 NAA浓度为 011～015 mg·L - 1的 MS培养基上生根表现差异不大。若
生根过程中不现蕾 , 则不定根的数目多 , 根的质量好 (图版 , E) ; 但若生根过程中现蕾 (图版 , J ) ,
则根的数目会减少 , 甚至不生根。另外 , 不定芽可以在瓶外扦插生根 (图版 , G)。
215　成花表现
花柄及花托作为离体培养物 , 发生以下 3种形式的试管开花现象 : ( 1) 花托处直接再生出花序
(图版 , H) ; (2) 不定芽在不定芽扩繁培养基上现蕾开花 (图版 , I) ; (3) 在生根培养基上高频现
蕾 (图版 , J )。另外 , 由此花组织诱导的不定芽 , 在继代次数很少的情况下 , 再生的植株移栽后无
需春化处理 , 在白天 25℃, 夜间 16℃, 16 /8 h的光暗交替培养条件下 , 短时间内现蕾 , 并且都按外
植体来源植株的育性发育。由花柄及花托再生的植株 , 可以产生嵌合体花 (图版 , K) 或异常花序
(图版 , M ) ; 有的在生根过程和光照培养箱内培养时存在一定频率的无融合生殖现象 (图版 , N、O )。
另外 , 花柄及花托再生的植株多在基部和顶端两处形成花序 (图版 , P)。
216　继代培养对不定芽性状表现的影响
在早期世代 , 不定芽生根极易在瓶内现蕾 , 现蕾率高达 80% , 继代培养 3个月后生根 , 瓶内
现蕾率为 6515% , 5个月、7个月和 1年时依次下降到 2111% , 2122% , 1128%。另外 , 随着继
代时间增加 , 生根情况逐步得到改善 , 继代培养 3个月的时候 , 生根率只有 20169% , 5个月和 7
个月生根率分别上升到 42111% , 88189% , 继代培养 1年时生根率可以达到 100%。从根的质量
看 , 诱导初期获得的不定芽发生的不定根数较少、较细 , 而随继代次数的增多 , 不定芽发生的根
数逐渐增多、变粗。
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　2期 孙保娟等 : 激素对白菜 GMS系不同育性外植体再生植株的影响 　
3　讨论
311　激素含量对不同育性植株再生的影响
不同育性外植体再生对外源激素的要求不同 , 这很可能是它们本身内源激素含量的差异引起的。
可育外植体 IAA含量要比不育外植体中的高出 28% , 所以其获得较高再生频率的最适外源 NAA浓度
要比不育外植体低 ; 在不加 NAA的情况下 , 可育比不育外植体的不定芽诱导率高也反映了这一点 ;
另外 , 可育外植体中较高含量的 GA3 也可能通过多种途径促进 IAA含量的提高。在以花柄及花托为
外植体时 , 要想诱导产生不定芽就要添加外源细胞分裂素 , 而不一定需要补充外源生长素 , 这可能是
因为外植体内源生长素含量较高 , 而细胞分裂素含量较低 , 这种现象在百合花托组织培养上也有类似
报道〔6〕。不同育性外植体在各自最适 NAA浓度下 , 对 62BA反应的不同 , 可能是多种激素复杂作用
的结果 , 这些还有待于进一步的试验证明。
本再生系统是一步诱导成芽 , 属直接出芽方式 , 获得再生植株的周期短 , 体细胞无性系变异小 ,
能较好保持细胞的稳定性 , 因此这种再生方式更适合植物的转基因工程 , 在遗传稳定的受体细胞中 ,
转化的外源基因能实现更稳定的遗传。另外 , 通过该体系获得不育株群和可育株群为其它方面的研究
提供了育性明确的研究材料。
312　来源花器官外植体的不定芽的离体成花现象
本试验采用花器官作为外植体观察到离体成花现象。十字花科植物在试管培养中 , 已有许多成花
报道。拟南芥菜下胚轴、甘蓝型油菜花器官、1年生椴花叶柄、欧白芥芽等在试管培养条件下都有成
花现象〔7〕。从已发表的有关试管开花植物的报道来看 , 花芽的形成与供体植株的生理状态有密切关
系〔7〕。由于试验所采用的不定芽是由花器官直接诱导而来 , 它以细胞有丝分裂的形式在一定程度上
保持了外植体的成花决定态 , 所以不定芽频繁发生现蕾现象。随着在芽诱导培养基上培养时间的延
长 , 可能是外源激素的长期作用或者是脱分化引起的脱春化 , 消弱了不定芽原有的生殖生长趋势 , 逐
步向营养芽状态过渡。在油菜花器官的离体培养过程中也有类似的报道〔5〕。
313　继代培养时间对不定芽的影响
瓶内现蕾直接抑制了根的发生 , 说明在成花决定态存在的情况下 , 生殖生长更有优势 , 这是
离体条件下生殖生长和营养生长矛盾的体现。因为不定芽在解除了芽诱导培养基条件下 , 分裂素
对成花表现阻抑后 , 不定芽的生长点又一次恢复为生长中心 , 首先对成花决定态做出应答 , 迅速
开始花器官的形成 , 而不定芽的基部却要由原来发生不定芽状态向发生不定根状态转变。换言之 ,
顶端是回复到一种适应态 , 而基部是转入一种新的生长状态 , 需要一定的适应时间。
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图版说明 : A: 可育花 ( a) 和不育花 ( b) ; B: 外植体 ; C: 不定芽再生 ( c为花托处再生芽 ; d为花柄处再生芽 ) ; D: 玻璃化苗 ;
E: 不定芽诱导生根 ; F: 再生植株移栽 ; G: 不定芽瓶外生根 ; H: 愈伤组织再生花序 ; I: 再生不定芽扩繁中开花 ; J: 生根培养时
开花 ; K: 体外生根植株开花 ; L: 可育再生植株开出嵌合体花 ; M: 再生可育形成异常花序 ; N: 不育再生芽生根时无融合生殖 ; O:
再生植株无融合结实 ; P: 再生植株两个花序着生部位。
Explana tion of pla tes: A: Fertile flower ( a) and sterile flower ( b) ; B: Exp lant; C: Adventitious shoot regeneration ( c: pedicel, d: recep ta2
cle) ; D: V itrification adventitious shoots; E: Root induction of adventitious shoots; F: Transp lant of regeneration p lantlets; G: Root induction out
of Erlenmeyer flask; H: Inflorescence induction from callus; I: Flower during multip lication of adventitious shoots; J: Flower during root induc2
tion; K: Plantlets rooted out of Erlenmeyer flask flowered; L: Plantlets regenerated from fertile exp lants were sometimes chimaera; M: Regenera2
tion fertile p lantlet formed excep tional inflorescence; N: In vitro apogamogony of sterile adventitious shoots during root induction; O: Apogamogony
of regeneration p lantlets in phytotron; P: Two positions bearing florescence of regeneration p lants.
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