全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 643 - 648
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 10 - 29; 修回日期 : 2008 - 04 - 11
基金项目 : 山东农业大学博士基金资助项目 (23226)3 E2mail: scwei@ sdau1edu1cn
冬枣两个 ACC氧化酶基因的 cDNA克隆及其表达
模式
魏绍冲 13 , 陈 汝 1 , 赵相娟 1 , 张 静 2
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018; 2 山东省果树研究所 , 山东泰
安 271000)
摘 　要 : 根据植物 ACC氧化酶 (ACO ) 家族的氨基酸和核苷酸保守区序列设计简并引物 , 采用 3′
RACE技术从半红期冬枣果实中分离了两个 ACO同源基因片段 , 随后通过 PCR技术进一步获得了两个包含
完整开放阅读框 (ORF) 及 3′端非编码区 (UTR) 序列的 ACO基因的 cDNA, 即 Z jACO1和 Z jACO2。两个
基因序列在 GenBank中的登录号为 EU216549和 EU216550, 其大小分别为 1 115 bp和 1 105 bp, 编码蛋白
大小分别为 319个和 321个氨基酸。Z jACO1和 Z jACO2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为 7914%和
8410%。Northern杂交结果表明 , 这两个基因在冬枣叶片中不表达 , 在果实不同发育阶段中的表达具有明
显差异。
关键词 : 冬枣 ; ACC氧化酶 ; 果实 ; 成熟 ; 基因 ; 克隆 ; 表达
中图分类号 : S 66511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520643206
C lon ing and Expression Pa ttern s of Two cD NA s Encod ing ACC O x ida se in
‘D ongzao’Jujube
W E I Shao2chong13 , CHEN Ru1 , ZHAO Xiang2juan1 , and ZHANG J ing2
(1 S ta te Key Laboratory of C rop B iology, College of Horticulture Science and Engineering, Shandong A gricultural U niversity,
Taipian, Shandong 271018, China; 2 Shandong Institu te of Pom ology, Ta ipian, Shandong 271000, Ch ina)
Abstract: Two ACC oxidase (ACO ) cDNA fragments were isolated from half2red Dongzao jujube fruit
by 3′RACE technique using degenerate p rimers corresponding to the conserved nucleotide and am ino acid re2
gion sequences of the ACO fam ily, then the 5′end encoding sequences of both cDNA s were obtained by RT2
PCR experiments. The two cDNA s, named as Z jACO1 and Z jACO2, contain an ORF (open reading frame)
with 3′UTR ( untranslated region) respectively. Their accession numbers in GenBank are EU216549 and
EU216550. The two cDNA s are 1 115 bp and 1 105 bp in length, while the p redicted p roteins of them are 319
and 321 aa long, respectively. The sim ilarity between Z jACO1 and Z jACO2 is 7914% at nucleotide level, and
8410% at am ino acid level. The result of Northern blot analysis indicated that exp ressions of two cDNA s in ju2
jube leaves were both undetectable, while their exp ressions at the development and ripening stages of jujube
fruit were obviously different.
Key words: Z iziphus ju juba; jujube; ACC oxidase; fruit; ripening; gene; cloning; exp ression
冬枣是我国重要特色鲜食果品之一 , 果实富含维生素 C等多种营养成分。但冬枣果实不耐贮藏 ,
采后极易失水、皱缩和霉烂等。
乙烯对包括果实成熟在内的植物生长发育过程具有广泛影响 , 尽管冬枣果实乙烯释放水平较低 ,
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但乙烯作用抑制剂 1 - 甲基环丙烯 ( 12MCP) 处理可延缓冬枣果实成熟的一些生理变化 (申琳 等 ,
2004) , 可见乙烯在其成熟过程中可能仍具有重要调控作用。
高等植物中乙烯生物合成途径为 : Met (蛋氨酸 ) →SAM ( S -腺苷蛋氨酸 ) →ACC (1 - 氨基环
丙烷 - 1 -羧酸 ) →乙烯 , 其中 ACO (ACC氧化酶 ) 为乙烯生物合成的两个关键酶之一。一般植物
中 ACO由多个基因家族成员所编码 , 可直接催化 ACC ( 1 - 氨基环丙烷 - 1 - 羧酸 ) 转变为乙烯
( Zarembinski & Theologis, 1994; Czarny et al. , 2006)。转反义 ACO基因植株的番茄果实 , 乙烯生物合
成受到明显抑制后 , 贮藏期延长 (Ham ilton et al. , 1990)。近年来已先后从柑橘 ( Katz et al. , 2004)、
草莓 ( Trainotti et al. , 2005)、柿子 (饶景萍 等 , 2002)、桃 (Ruperti et al. , 2001; Trainotti et al. ,
2006)、香蕉 (Do et al. , 2005) 等果实中分离出 ACO基因的全长或片段 , 并对它们的基因表达特性
进行了深入研究。
为了深入探讨乙烯在冬枣果实成熟进程中的分子机理 , 作者克隆了两个冬枣 ACO基因的全长 cD2
NA, 并研究其在不同器官中的基因表达特性。
1　材料与方法
111　材料
以 ‘冬枣 ’ ( Z izyphus ju juba ‘Dongzao’) 果实为材料 , 将去除果皮后的果肉组织切成薄片用液氮
速冻后于 - 70 ℃冰箱备用。
大肠杆菌 ( Escherich ia coli) 菌株 DH5α感受态细胞采用 CaCl2法制备。DNA回收纯化试剂盒、
LA Taq酶和 pMD218T载体为大连宝生物公司 ( Takara) 产品。
112　引物设计与合成
根据 GenBank登录的番茄、桃、苹果和草莓等 ACO家族成员氨基酸和核苷酸保守区序列 , 设计
合成两条上游简并引物。 P1: 5′2TTGAG ( C /T) T ( G/T) GTGA (A /G) (C /T) CATGG (A /G) AT23′; P2:
5′2TTCCAGGATGACAAGGTCAG23′。3′RACE扩增的下游通用引物 B26序列为 : 5′2GACTCGAGTCGA2
CATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT23′。
为扩增 Z jACO1和 Z jACO2的全长 cDNA , 分别合成以下引物。
P5: 5′2GAGA (A /G) ATGGAGAA ( C /T) TTCCCA (A /G) T ( G/C /T) AT23′; P321: 5′2CG2
CATAGGAGGGACATCAAT23′; P322: 5′2ATGCTCTTATATTTTCCGTTGGT23′; QF1: 5′2CATGGTATAGC2
CCCTGAGT23′; QR1: 5′2TAAAGAAAACACCCATAAGTAGTA23′; QF2: 5′2GACACCGTGGAGCGA2
CAGAC23′; QR2: 5′2TTTTTCCCAGCACCAGACTAATAC23′。
113　总 RNA的提取
果实总 RNA的提取参照 Salzman等 (1999) 的方法进行。根据果实发育进程将果实分为小绿果
期、大绿果期、发白期、转色期、半红期和红色期等不同阶段。
叶片总 RNA的提取采用 CTAB法 (Chang et al. , 1993)。
沉淀溶解于适量 DEPC处理水 , 经过核酸定量分析后 , 确定 Northern杂交的总 RNA用量。
114　RT2PCR扩增
cDNA第 1链合成按照 MB I公司操作说明书进行。 PCR反应体系如下 : 215 mmol·L - 1 dNTP 8
μL, 25 mmol·L - 1 MgCl2 5μL, 10 ×LA PCR缓冲液 5μL, 上下游引物各 2μL (约 10 pmol·L - 1 ) ,
逆转录产物 1μL, LA Taq酶 015μL (5 U·μL - 1 ) , 用 ddH2 O补充至总体积 50μL。
Z jACO1和 Z jACO2的 3′RACE扩增 : 以引物 P1和 B26的扩增产物为模板 , 再用 P2和 B26进行
扩增。扩增条件为 : 首先 94 ℃预变性 5 m in, 然后 94 ℃变性 30 s, 52 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 60 s,
共 20个循环。将扩增产物稀释后进行第 2次 PCR, 反应条件与第 1次相同。将目的片段克隆至 pMD2
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　5期 魏绍冲等 : 冬枣两个 ACC氧化酶基因的 cDNA克隆及其表达模式 　
18T载体进行序列测定。
5′端序列扩增 : 根据 3′RACE测序结果分别设计下游特异引物 P321和 P322, 根据对桃、苹果、
柿子和柑橘等果实 ACO同源基因序列比较 , 在起始密码子附近设计上游简并引物 P5, 分别用 P321或
P322与 P5进行 PCR扩增。
全长 cDNA的扩增 : 根据拼接结果的 cDNA序列 , 设计两组特异引物 QF1、QR1 ( Z jACO1) 和
QF2、QR2 ( Z jACO2) , 并进行克隆和序列测定。
115　序列拼接与分析
DNA序列测定委托上海英骏生物技术公司完成 , 测序结果用 ContigExp ress序列拼接软件进行全
长序列拼接 , 序列分析则采用 DNASTAR和 DNAMAN软件进行。
116　Northern杂交
地高辛 (D IG) 标记 RNA探针试剂盒及杂交液 (D IG easy Hyb) 均购自罗氏 (Roche) 公司 , 按
照其操作说明书进行。
获取两个探针序列引物分别为 : F1 5′2CATGGTATAGCCCCTGAGTTT23′; R1 5′2taatacgactcactat2
agggGTTTTGGGCATGGTGGATAAT23′; F2 5′2TGCGCCACCTTCCTGTC23′; R2 5′2taatacgactcactatagggATC2
CATTGGCCATCCTTGAG23′。
2　结果与分析
211　3′RACE基因片段的扩增
以成熟冬枣果实的 cDNA为模板 , 利用引物 P1和 B26进行首轮扩增 , 将扩增产物稀释后 , 再用
P2和 B26进行扩增 , 结果得到的 PCR产物约为 550 bp, 与预期大小基本相吻合。将 3′RACE产物与
载体连接 , 转化感受态大肠杆菌细胞 , 获得重组质粒后用于进一步的 DNA序列测定。
测序后得到了大小分别为 554 bp和 542 bp的两个 cDNA片段 , 命名为 Z jACO1和 Z jACO2。将它
们的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别在 NCB I服务器的 B last (B lastn和 B lastp) 软件中进行检索 ,
结果显示同源性较高的序列为桃和番茄等 ACO的序列 , 初步推断它们为冬枣中两个 ACO同源基因的
片段 , 这为下一步的深入研究打下了基础。
212　Z jACO 1的 cD NA克隆
利用引物 P5和 P321经 PCR扩增获得一个约 600 bp大小的目的片段。DNA序列测定结果表明该
基因片段大小为 634 bp, 为 Z jACO1的 5′端序列。将上述两个序列进行拼接 , 其重叠部分序列完全相
同。为防止序列拼接结果来源于不同基因的同源区段 , 利用拼接结果设计引物 QF1和 QR1, 经克隆
测序分析 , 结果得到目的片段序列与拼接结果完全一致。
Z jACO1大小为 1 115 bp, 包含一个 960 bp的 ORF (开放阅读框 ) 及 150 bp的 3′UTR (3′端非编
码区序列 ) , 该基因编码 319个氨基酸 , 推测的分子量为 3612 kD。该基因在 GenBank中的登录号为
EU216549。
213　Z jACO 2的 cD NA克隆
根据 Z jACO2的 3′RACE实验测序结果设计特异引物 P322, 与 P5通过 PCR获得一个约 700 bp大
小的基因片段 , 测序表明该片段为 Z jACO2的 5′端编码区序列。利用引物 QF2和 QR2, 结果得到与
拼接序列相同的 941 bp大小的目的基因片段。
Z jACO 2大小为 1 105 bp, 包含一个 966 bp的 ORF, 其 3′UTR为 134 bp。该基因在 GenBank中的
登录号为 EU216550。推测其编码蛋白的分子量为 3615 kD , 等电点为 5115。 Z jACO2与 Z jACO1在核
苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为 7914%和 8410%。
图 1为 Z jACO1和 Z jACO2推导的氨基酸序列之间的同源性比较。
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图 1　冬枣 ACC氧化酶成员 ZjACO 1与 ZjACO 2的氨基酸序列比较
F ig. 1　A lignm en t of two ACC ox ida ses ZjACO 1 and Z jACO 2 from jujube
214　Z jACO 1和 ZjACO 2的聚类分析
本试验所得的冬枣 Z jACO1和 Z jACO2的氨基酸序列与多种植物 ACO的氨基酸序列都具有较高同
源性 : Z jACO1与桃 AAF36483和草莓 AAU10090序列的同源性分别为 8811%和 8211% ; 而 Z jACO2与
猕猴桃 P31237和桃 AAF36484序列的同源性高达 8612%和 8413% , 因此可以推断它们确实为 ACO新
成员。
聚类分析结果 (图 2) 表明 , Z jACO1和 Z jACO2是两种不同类型的 ACO家族成员。
图 2　一些植物 ACO的系统树
F ig. 2　Phylogenetic tree of som e plan tspiACO
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　5期 魏绍冲等 : 冬枣两个 ACC氧化酶基因的 cDNA克隆及其表达模式 　
215　Z jACO 1和 ZjACO 2的表达特性
图 3为 Z jACO1和 Z jACO2在冬枣叶片和不同发育时期果实中的 Northern杂交结果。
由图 3可以看出 , Z jACO1在冬枣叶片中基本不表达 , 而在果实中则具有相对较高的表达水平。
在绿果期 Z jACO1具有较高水平 , 发白期果实中表达水平达到最高 , 而在成熟期则又下降 , 红色期几
乎不表达 , 这种变化趋势与草莓果实中 FaACO1的表达模式 ( Trainotti et al. , 2005) 类似。
Z jACO2在冬枣叶片中也不表达 , 而仅在大绿果期和发白期果实中具有较高的表达水平 , 在果实
发育的其它时期基本不表达 , 其基因表达特性与 Z jACO1具有明显不同。
图 3　ZjACO 1和 ZjACO 2在叶片和果实中的表达模式
L. 叶片 ; SG. 小绿果期 ; LG. 大绿果期 ; W. 发白期 ; T. 转色期 ; H. 半红期 ; R. 红色期。
F ig. 3　Expression pa ttern s of ZjACO 1 and Z jACO 2 in jujube leaves and
d ifferen t r ipen ing stages of fru it
L. Leaves; SG. Small green; LG. Large green; W. W hite;
T. Turning; H. Half red; R. Red.
3　讨论
乙烯与果实成熟密切相关 , 因而与乙烯生物合成相关的酶及基因的分离工作一直是人们研究的热
点。ACO是植物乙烯生物合成途径中最后一个酶 , 催化 ACC转化为乙烯 , 所以该酶在果实成熟基因
工程方面具有重要意义。
早在 1990年 , Ham ilton等报道了将 ACO的反义基因 pTOM13转入番茄 , 带有两个拷贝 ACO反义
基因的转基因番茄在果实成熟时其乙烯的生成降低 97% , 成熟过程明显变缓。经外源乙烯处理的采
后果实 , 可以表现出成熟果实的正常生理特性。最近 , 转正义或反义 ACO 基因植株在西洋梨品种
‘La France’上获得 ( Gao et al. , 2007) , 转反义 ACO植株的离体新梢乙烯生成量可以降低 85% , 为
延缓果实成熟和延长保鲜期开创了十分诱人的前景。
ACO是由多基因家族成员所编码 , 各成员的基因表达具有明显的组织特异性 , 在不同的条件下
表现出不同的表达特征。番茄中至少包括 5个家族成员 , 其中 L eACO1在番茄成熟果实中大量表达 ,
L eACO3则在番茄果实破色期表达水平最强 , 随着果实成熟度的增加 , 其表达反而减弱 (Barry et al. ,
1996)。Ruperti等 (2001) 的研究结果表明 , 桃 Pp2ACO1在成熟果实及幼果脱落时期中表达明显增
加 , 并且受丙烯 (乙烯替代物 ) 的诱导 , 而 Pp2ACO2仅在果实发育初期表达 , 不受丙烯诱导。Train2
otti等 (2005) 从草莓果实中分离了两个 ACO基因片段 , 定量 PCR分析结果表明 , FaACO1在草莓果
实发白期前表达呈增加趋势 , 随后至全红期又下降 ; 而 FaACO2则在果实发白期阶段达最低水平 , 随
后至成熟呈现略微增加的趋势。
本试验所获得的两个 ACO同源基因虽然在氨基酸水平具有高达 8410%的同源性 , 但聚类分析结
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果却显示它们分别属于不同类型的 ACO家族成员。Northern杂交结果表明 , 尽管 Z jACO1和 Z jACO2
基因在冬枣叶片中基本不表达 , 但它们在冬枣果实发育进程中的表达却具有明显差异。 Z jACO1的基
因表达特性与草莓果实 FaACO1类似 , Z jACO2在枣果实中的表达模式却与草莓果实 FaACO2表达模
式明显不同 , 而是与番茄果实中 L eACO3和桃 Pp2ACO2等成员的表达特性表现出一定类似性 , 这也许
说明冬枣中可能还存在更多的 ACO基因成员。这两个基因的表达是否受外源乙烯的诱导 , 还需进一
步验证。
冬枣 ACO基因的获得为果实成熟基因工程的发展奠定了基础 , 但距离培育出耐贮运的枣树新种
质仍有很多工作尚待完成。
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