全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 637 - 643
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 05; 修回日期 : 2007 - 03 - 16
基金项目 : 北京市自然科学基金项目 (5062030) ; 国家自然科学基金项目 (30270236) ; 农业部 ‘948’项目 〔20062G13 (A ) 〕;
农业部蔬菜遗传与生理学重点开放实验室项目 (2005210)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xieby@mail1caas1net1cn)
β - 氨基丁酸诱导辣椒细胞色素 P450基因的克隆
及其序列分析
戴素明 1, 2 , 周程爱 1, 2 , 谢丙炎 13 , 肖启明 2 , 杨宇红 1 , 尹丽蓉 1, 2
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 湖南农业大学生物安全科技学院 , 长沙 410128)
摘 　要 : 用 RT2PCR和 RACE方法 , 从β -氨基丁酸 (β2am inobutyric acid, BABA ) 诱导辣椒叶片的基
因表达体系中克隆出 CYP92A的全长 cDNA序列。在 BABA处理后 , CYP92A基因以一种快速而短暂的方式
作出应答。生物信息学分析表明 , 该基因编码一条 509个氨基酸残基的多肽 , 含有一段细胞色素 P450保守
的血红素结合区域 , 由此 CYP92A被确定是细胞色素 P450。通过系统进化分析 , CYP92A 属于多基因家族
P450的 92A亚家族。结合已报道 92A亚家族成员的研究 , 推测 CYP92A参与植物的防御反应。通过生物信
息学分析蛋白结构 , 对 CYP92A催化反应特性进行了讨论。为进一步探讨 BABA的诱导机理奠定了基础。
关键词 : 辣椒 ; 细胞色素 ; β -氨基丁酸 ; 生物信息 ; 防御反应
中图分类号 : S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320637207
M olecular C lon ing and Sequence Ana lysis of Cytochrom e P450 in Pepper
( C apsicum annuum L. ) Induced byβ2am inobutyr ic Ac id ( BABA)
DA I Su2ming1, 2 , ZHOU Cheng2ai 1, 2 , X IE Bing2yan13 , X IAO Qi2ming2 , YANG Yu2hong1 , and YIN Li2rong1, 2
( 1 Institu te of V egetables and F low ers, Ch inese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, Ch ina; 2 College of P lan t P rotec2
tion, Hunan A gricultural U niversity, Changsha 410128, China)
Abstract: The comp lete CYP92A was amp lified by RT2PCR and RACE, which exp ressed in pepper (Cap2
sicum annuum L. ) leaf was rap idly and transiently induced byβ2am inobutyric acid (BABA ). The analysis of
bioinformatics showed that CYP92A gene encoded a 5092am ino acid p rotein which contained a conserve heme2
binding region of cytochrome P450. Therefore, it was confirmed that CYP92A is cytochrome P450. By phyloge2
netic analysis, it was belived to belong to 92A sub2fam ily of P450. According to researches of other 92A sub2
fam ily genes reported, it is speculated conferred that CYP92A may p lay a role in p lant defence response. Based
on bioinformatics analysis of p rotein struction, the p roperty of CYP92A in catalytic reaction was also discussed in
this paper. This study had significance for research on indued2resistance mechanism s of BABA.
Key words: Capsicum annuum L. ; Cytochrome; BABA; B ioinformatics; Plant defence response
β
-氨基丁酸 (β2am inobutyric acid, BABA ) 是一种植物体内次生代谢的非蛋白氨基酸。多年研
究表明 , BABA具有广谱的诱抗活性 , 对许多一年生或多年生、单子叶或双子叶植物均具有很强的诱
抗作用 , 可诱导这些植物抵抗由卵菌、真菌、细菌、病毒和线虫引起的病害 , 保护植物的叶部、根部
和果实免受为害 (Jakab et al. , 2001)。本实验室用 1 000μg/mL的 BABA喷施八叶期 ‘茄门 ’甜椒 ,
获得抗辣椒疫病和辣椒病毒病 ( TMV ) 的效果分别达 80%和 50%以上 (谢丙炎 等 , 2002; 梁俊峰
等 , 2003)。但有关 BABA诱导辣椒抗性机理尚不十分清楚 , 仅在生理生化水平上对此开展了相关研
究 (李惠霞 等 , 2006)。研究发现 : ( 1) BABA可诱导植株细胞壁结构发生变化 , 产生胼胝质 , 形
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成乳突或导致细胞木质化等具有防止侵染和增强抗病性作用的结构 (Cohen et al. , 1999)。 (2) BABA
可诱导植物产生活性氧物质 (ROS) , 发生过敏反应从而进入对病原菌的防卫状态 , 使病原菌的侵入和
扩展受到抑制 ( Silue et al. , 2002)。 (3) BABA能诱导植物积累病程相关蛋白、植保素等抗病物质
(Hwang et al. , 1997)。上述表明 BABA诱导植物抗病反应可能是由多种机理协同作用所控制。高等植物
在遇到如温度、水分、盐碱等胁迫或在病原菌侵染、化学药剂、激素、创伤等的刺激下都将诱导基因的
特异表达 , 从基因表达调控的角度剖析植物应答 BABA诱导的分子机制 , 有助于认识 BABA的诱导抗病
作用 , 为开发利用 BABA诱导植物抗病潜能 , 创新有害生物综合治理途径与技术奠定理论基础。
细胞色素 P450是一类以还原态与 CO结合后在波长 450 nm处有吸收峰的含血红色素的多功能氧
化酶 (冷欣夫和邱星辉 , 2001)。目前 , 已从 111种植物中获得 1 052个植物细胞色素 P450基因 , 部
分 P450基因功能已得到鉴定 (戴素明 等 , 2004)。P450在植物体中具有生物合成和代谢解毒两大功
能 , 其中一些能催化结构抗病物质 (如木质素、角质层和树脂 )、植保素 (如异黄酮和甜椒素 )、毒
素 (即杀虫剂 , 如生氰糖苷和丁布 )、胁迫信号物质 (茉莉酸、创伤激素和 D ivinyl ethers) 的合成 ,
从而在植物防御反应中发挥重要的作用 (Morant et al. , 2003 )。因此 , 作者从 BABA 与细胞色素
P450的关系入手 , 根据已报道的茄科类细胞色素 P450的核酸序列同源区域设计引物 , 通过 RT2PCR
寻找辣椒叶片中受 BABA诱导参与植物防御反应的细胞色素 P450基因 , 为进一步研究 BABA诱导抗
性的分子机制奠定基础。
1　材料与方法
111　材料
供试 ‘茄门’甜椒 (Capsicum annuum L. ) 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。供试药品为β
-氨基丁酸 (BABA)。当植株长至八叶期时 , 用 1 000μg/mL的 BABA和蒸馏水 (对照 ) 喷洒叶片 , 分
别于 0、2、4、6、8、12、24 h切取植株上部叶片 , 混合后放于液氮中速冻保存 , 用于 RNA提取。
Trizol Reagent、反转录酶和 5′RACE试剂盒均购自 Invitrogen公司 ; Taq酶、DNA纯化试剂盒、克
隆载体 pGM 2T和宿主菌大肠杆菌 TOPO10购自天根公司 ; 3′RACE试剂盒购自 Takara公司。
112　方法
采用 Trizol法提取植物组织总 RNA, RNA沉淀用 20μL DEPC处理的超纯水溶解。取 5μL总
RNA为模板 , 以 O ligo ( dT) 18为反转录引物 , 在反转录酶的作用下催化第一链 cDNA的合成。
以茄科植物翻译延伸因子基因 ( EF12α) 作为内参基因 , 根据其同源性设计引物 EF12αF和 EF12
αR (表 1)。内参基因扩增反应的参数为 : 94℃预变性 3 m in; 94℃变性 30 s, 58℃变性 30 s, 72℃
变性 30 s, 共 25个循环 ; 最后 72℃延伸 10 m in。根据已报道茄科植物细胞色素 P450基因的同源性设
计一对引物 92AF和 92AR (表 1)。以第一链 cDNA 为模板进行扩增 , 反应参数为 : 94℃预变性
3 m in; 94℃变性 30 s, 52℃变性 30 s, 72℃变性 30 s, 共 28个循环 ; 最后 72℃延伸 10 m in。扩增的
PCR产物以 115%琼脂糖凝胶电泳检测和分离 ,
用 DNA 纯化试剂盒纯化后连接到 pMD182T载体
中 , 转化 TOPO10感受态细胞。挑取单菌落放大
培养 , 提取质粒做酶切鉴定 , 挑选阳性克隆送上
海生工进行序列测定。
根据上述已取得的中间序列设计合成 3条基
因特异性引物 3RP、GSP1和 GSP2 (表 1) , 用于
RACE反应 , 获得辣椒 CYP92A基因的全长 cDNA
序列。
表 1　试验中设计的引物序列
Table 1　O ligo nucleotide pr im ers designed in exper im en ts
引物 Primer 核酸序列 (5′→3′) Sequence (5′→3′)
EF12αF CCACCAATCTTGTACACACATCC
EF12αR AGACCACCAAGTACTACTGCAC
92AF TGTTATTAGCAGGATGGTAC
92AR GCTAGCTTGAATCACCTT
3RP CCAAATCTTCCATACATAGAG
GSP1 AACAAGTCCTGAGTGAATGC
GSP2 TTCCACTGCTTTCCTTCTCAC
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　3期 戴素明等 : β -氨基丁酸诱导辣椒细胞色素 P450基因的克隆及其序列分析 　
　　3′RACE反应按照 Takara 3′2Full RACE Core Set说明书进行 : 以总 RNA为模板 , 采用试剂盒内的
反转录引物 O ligo dt23 sitesAdap tor Primer和反转录酶合成 3′RACE cDNA。再以转录产物为模板 , 用引
物 3RP和试剂盒内的通用引物 3 sites Adap tor Primer进行 3′端扩增。反应参数为 : 94℃预变性 3 m in;
然后 94℃变性 30 s, 58℃变性 30 s, 72℃变性 30 s, 共 35个循环 ; 最后 72℃延伸 10 m in。扩增产物
克隆进行序列测定。
5′RACE反应按照 Invitrogen说明书进行 : 以总 RNA为模板 , 采用引物 GSP1和反转录酶合成 5′
RACE cDNA。然后 , 转录产物经 S1N1A1P纯化后进行 TdT加尾。最后 , 以加尾产物为模板 , 用引物
GSP2和试剂盒内的通用引物 AAP进行 5′端扩增。反应参数为 : 94℃预变性 3 m in; 94℃变性 30 s,
58℃变性 1 m in, 72℃变性 90 s, 共 10个循环 ; 再 94℃变性 30 s, 55℃变性 1 m in, 72℃变性 90 s, 共
25个循环 ; 最后 72℃延伸 10 m in。扩增产物克隆进行序列测定。
2　结果与分析
211　BABA处理后辣椒叶片 RT2PCR分析
用半定量 RT2PCR对 BABA处理后的辣椒 P450基因的表达谱进行了研究。结果 (图 1) 显示 :
选用引物 92AF和 92AR进行 RT2PCR反应 , 获得了 800 bp左右的特异性条带 CYP92A ; 该基因在辣椒
叶片中受 BABA诱导表达 , 即处理 2 h后开始微弱表达 , 然后表达量增强 , 并一直持续到 8 h, 之后
停止表达。
图 1　BABA诱导辣椒叶片表达细胞色素 P450的电泳图
F ig. 1　The electrophoresis results of expression of CYP92A gene induced by BABA
212　辣椒 CYP92A基因全长 cD NA序列的克隆
通过同源克隆策略扩增到辣椒叶片 CYP92A基因的一段中间片段 , 测得片段大小为 832 bp。通过
BLAST比对分析表明 , 该片段和其它茄科类作物的 CYP92A序列有较高的同源性。进而通过 RACE -
PCR技术分别获得 664 bp的 3′端序列 (图 2) 和 850 bp的 5′端序列 (图 3)。利用 DNAman软件将相
互重叠的 3段序列进行拼接 , 得到 1 766 bp 的辣椒 CYP92A 全长 cDNA 序列 ( GenBank登录号为
DQ785813) (图 4)。该核苷酸序列 5′端起始密码子 ATG前有一段非编码区 , 而 3′末端有一个 polyA
多聚核苷酸结构 , 说明它的序列是完整的。
图 2　3′RACE扩增结果
F ig. 2　3′RACE of CYP92A
图 3　5′RACE扩增结果
F ig. 3　5′RACE of CYP92A
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图 4　辣椒 CYP92A cD NA及推导出的氨基酸序列
小写字母代表 5′和 3′端非翻译区 ; 大写字母部分为编码区 , 上面为核苷酸序列 , 下面为氨基酸序列 ;3 终止密码子 ; 方框为血红素结合区域 (Heme2binding region)。
F ig. 4　Com p iled full2length CYP92A
Lowercase rep resents 5′and 3′untranslation region; Cap ital rep resents translation region; Above: nucleotide sequence;
Below: am ino acid sequence; A sterisks mark term ination codon; The heme2binding region was marked by pane.
213　序列分析
通过网络 ORF Finder分析工具分析 , 辣椒 CYP92A基因的开放阅读框 (ORF) 为 1 530 bp, 编码
一条 509个氨基酸残基的多肽 (图 4)。细胞色素 P450含有一段保守的血红素结合区域 (Heme2bind2
ing region) , 其氨基酸序列特征为 P2F2G2X2G2R2R2X2C2X2G ( Toguri & Tokugawa, 1994)。CYP92A编码
的氨基酸序列具有这段保守区域 (图 4) , 从而肯定了 CYP92A是细胞色素 P450。
将 CYP92A基因的氨基酸序列与已报道的茄科植物细胞色素 P450的氨基酸进行多序列对比 [由
于 CYP74家族的 P450异常 , 本研究与已构建的植物 P450的种系进化树 (冷欣夫和邱星辉 , 2001)
一致 , 未将 CYP74家族包括 ] , 用 MEGA210构建系统发育树 (图 5 ) , 从中可以看出 , 细胞色素
P450是个多基因家族 , 其各个家族分别聚在一起。植物 P450可以分为 4个集团 (即 71集团、72集
团、85集团和 86集团 ) , 已知的多个植物 P450家族均归于 71集团 , 构成最大的一个植物 P450集团
(冷欣夫和邱星辉 , 2001)。已报道的茄科植物 P450 (CYP92、82、76、75、71、84、77和 73) 大多
集中于 71集团 , 聚合成一大枝。CYP92A 与已有的 92A 亚家族成员聚合在一起 , 说明该细胞色素
P450是 92A亚家族的新成员。
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　3期 戴素明等 : β -氨基丁酸诱导辣椒细胞色素 P450基因的克隆及其序列分析 　
图 5　茄科植物细胞色素 P450系统进化树
F ig. 5　Phylogenetic tree of CY P450 prote in s of Solanaceae
214　蛋白结构预测
用 TMHMM 软件分析 CYP92A蛋白的跨膜区 , 结果显示有 1个跨膜螺旋区 (图 6)。亚细胞定位
分析 ( ProtComp分析工具 ) 显示该蛋白在植物细胞中主要结合在内质网上。用 PHD软件分析蛋白的
二级结构 , 辣椒 CYP92A可形成螺旋构象 4815% , 伸展构象 918% , 无规卷曲 4117%。利用同源建模
的方法 ( SW ISS2MODEL分析工具 ) 获得的 CYP92A 三级结构 (图 7) 显示 , CYP92A蛋白 Leu33至
Met473具有 21个α -螺旋和 5个β -折叠 (分别用红色和黄色表示 ) , 基本上分别集中于分子的右半
部和左半部。
图 6　CYP92A的跨膜螺旋区
F ig. 6　Pred iction of tran sm em brane reg ion s in CYP92A
图 7　CYP92A的同源建模
F ig. 7　Hom ology prote in m odel of CYP92A
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3　讨论
许多研究结果都认为 BABA 诱导植物抗病不是因为其本身对病原物具有毒性 (陈士云 等 ,
2003)。本实验室也曾发现 BABA对辣椒疫霉的菌丝生长和其它培养性状没有抑制作用 , 表明处理后
辣椒对疫病的抵抗作用不是 BABA直接的抑菌作用 , 而是产生了诱导抗性 (谢丙炎 等 , 2002 )。本
试验中利用同源克隆和半定量 RT2PCR方法 , 在 BABA诱导辣椒基因表达体系中发现了一个新基因
CYP92A。通过生物信息学分析 , 确证该基因是细胞色素 P450, 属于 92A亚家族 , 归在植物 P450的
71集团。
在 71集团中 , 已发现一些 P450是从寄主 —病原物互作中分离得到的 , 与植物获得抗性有关 , 如
炭疽病非亲和小种 (Colletotrichum g loeosporioides) 诱导辣椒表达 CYP71D19, 其产物在病菌侵染果实
表皮时起保护作用 (Oh et al. , 1999 )。同为 92A 亚家族的 CYP92A2 ( Czernic et al. , 1996 ) 和
CYP92A5 (Ralston et al. , 2001) 也分别是从青枯病非亲和小种 (R alston ia solanacearum ) 和真菌分泌
物 (纤维素酶 ) 诱导的烟草组织中鉴定获得 , 且 CYP92A2已被证实具有过敏性反应相关基因的特性 ,
又名 hsr515。由此 , 推测 CYP92A有可能在辣椒的防御反应中起作用 , 是 BABA诱导植物抗性途径的
组成成员。这为进一步研究 BABA诱导抗性机理提供了新的思路。
类似 CYP92A2和 CYP92A5的表达模式 (Czernic et al. , 1996; Ralston et al. , 2001) , CYP92A 在
BABA处理后 4～8 h内被激活 , 快速而又短暂地对 BABA作出应答。然而 , 有关 92A亚家族成员在
植物防御系统中的具体作用至今尚无研究。CYP92A 表达后的产物是否类似 CYP71D20 ( Ralston et
al. , 2001) 一样催化形成植保素等物质 , 直接抑制对植物有致病作用的微生物生长 , 还是类似
CYP74A ( Park et al. , 2002) 一样参与合成植物信号的代谢途径 , 通过信号物质调控植物抗病性 , 还
有待作深入研究。
目前 , 一些 P450反应特性已在分子结构和分布位置中得到揭示。相比其它 P450分子结构 ( Gra2
ham & Peterson, 1999) , CYP92A存在两套结构保守的β -折叠 , 这些有助于形成疏水性的底物进入通
道。同时 , CYP92A也表现出结构的差异 , 如α -螺旋的数目以及空间结构的取向等 , 这些可变区域
决定着 P450具有较高程度的底物和产物专一性特征。对于不同分布位置的 P450, 其代谢反应中获得
电子的途径也存在差异 ( Takemori et al. , 1993)。结构预测分布在内质网的 CYP92A , 电子是从 NAD2
PH通过含黄素蛋白的 FAD和 FMN来传递。与分布在线粒体上的 P450不同 , 无需铁 —硫铁氧还蛋白
的中介作用。
此外 , 本试验通过同源比对设计了扩增其它细胞色素 P450家族的引物 (结果未显示 )。然而 ,
这些扩增引物没有获得 BABA诱导相关的基因产物 , 可能是由于某些 P450基因组织表达特异性等因
素 , 如 CYP74D主要在植物的根组织中表达 ( Itoh & Howe, 2001)。目前已报道的茄科类细胞色素
P450尚未完善 , 所以利用同源克隆方法还不能弄清辣椒叶片中有多少个 P450基因与 BABA相关。细
胞色素 P450在植物体内是一个庞大的多基因家族 , 且对化学信号的反应很灵敏 , 相信还存在其它
P450基因受 BABA诱导表达。
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