全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1247～1252
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 04 - 29; 修回日期 : 2006 - 07 - 02
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30370854)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: qwmeng@ sdau1edu1cn)
甜椒 CaHSP26的 cDNA克隆与表达
郭尚敬 1, 3 　郭　鹏 1 　董新纯 1 　孟庆伟 1, 23
(1 山东农业大学生命科学学院 , 山东泰安 271018; 2 山东省作物生物学重点实验室 , 山东泰安 271018; 3 聊城大学生
命科学学院 , 山东聊城 252000)
摘 　要 : 用 RT2PCR技术从热激处理的甜椒 (Capsicum annuum L. ) 叶片中克隆了叶绿体小分子量热激
蛋白 ( sHSP) 基因的 cDNA序列 , 其全长为 917 bp, 命名为 CaHSP26。Southern杂交分析表明该基因在甜
椒基因组中为单基因。Northern杂交结果显示该基因在甜椒根、茎、叶中受高温诱导表达。高温 ( 50℃)
胁迫下 , 在大肠杆菌中异源表达 CaHSP26可以维持大肠杆菌较高的细胞活力。这些结果表明在高温胁迫下
植物叶绿体 sHSP对细胞具有保护作用。
关键词 : 辣椒 ; 小分子量热激蛋白 ; 基因克隆 ; 异源表达
中图分类号 : S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621247206
cD NA C lon ing and Expression of C aH SP26 from Sweet Pepper
Guo Shangjing1, 3 , Guo Peng1 , Dong Xinchun1 , and Meng Q ingwei1, 23
(1 College of L ife Sciences, Shandong A gricultural U niversity, Taipian, Shandong 271018, China; 2 Key L abora tory of C rop B iology
of Shandong Province, Ta ipian, Shandong 271018, Ch ina; 3 College of L ife Sciences, L iaocheng U niversity, L iaocheng, Shandong
252000, Ch ina)
Abstract: Full length 917 bp of chlorop last sHSP cDNA was isolated from heat2shocked sweet pepper
leaves by RT2PCR app roach, named CaHS P26 (AY224603 ). A single2gene was found in sweet pepper
genom ic DNA by southern2blot analysis. Northern blot revealed that heat stress induced the exp ression of CaH2
S P26 in roots, stem s and leaves of sweet pepper. The heterologous exp ression of CaHSP26 in E. coli could
maintain higher cell viability of E. coli under high temperature stress ( 50℃). These results indicated that
p lant chlorop last sHSP could p rotect cell against heat stress.
Key words: Sweet pepper; Small heat shock p rotein ( sHSP) ; Gene cloning; Heterologous exp ression
热锻炼可以提高植物耐高温胁迫的能力 , 热激蛋白 (HSP) 在此过程中起了重要作用。热激蛋白
最早是 1962年在果蝇中发现的 , 1978年才证明其广泛存在于其它生物中 , 而且在几乎所有的活细胞
中都起着重要作用〔1〕。
根据分子量的大小 HSP分为 HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子量热激蛋白 ( sHSP, 15
～30 kD) , 其中 sHSP是高等植物中最为丰富的热激蛋白。有研究结果表明热激蛋白的表达与植物的
耐热性有关 , 在烟草中过量表达 sHSP提高了烟草的耐热能力〔2〕, 缺少 sHSP的蓝细菌突变体的放氧
活性以及类囊体膜的稳定性降低〔3, 4〕。植物受到高温胁迫时 , 叶绿体 sHSP可以保护光合电子传递链 ,
减轻高温胁迫引起的光抑制〔5, 6〕。有研究表明在大肠杆菌中表达细胞质 sHSP提高了大肠杆菌的耐热
性〔7〕, 但是利用原核表达探讨叶绿体 sHSP的功能未见报道。
本试验采用 RT2PCR和 5pi/3piPCR相结合的方法克隆了甜椒叶绿体 sHSP基因 , 利用 Northern杂交
方法研究了该基因的表达 , 并构建了原核表达载体 , 将该基因在大肠杆菌中异源表达 , 探讨该基因的
表达特征以及高温条件下维持细胞活性的作用 , 以期为提高作物耐热性提供理论依据。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
1　材料与方法
111　材料
试材为甜椒 (Capsicum annuum L. ) 耐热品种 ‘中椒 8号 ’〔8〕, 购自中国农业科学院蔬菜花卉研
究所。2005年在山东农业大学温室播种 , 盆栽培养 60 d后在光照培养箱中 42℃下热激 2 h。
克隆受体大肠杆菌菌株为 DH5α, 原核表达用大肠杆菌菌株为 BL21, 由山东农业大学植物生理
实验室提供。
克隆载体 pMD182T vector、限制性内切酶为 Takara公司产品。PCR产物纯化试剂盒为上海生工生
物工程技术服务有限公司产品 , Taq DNA聚合酶为上海博亚生物技术有限公司产品 , 氨苄青霉素、低
熔点琼脂糖为 Sigma公司产品 , 其余试剂为分析纯。原核表达载体为 PET30a, 由山东农业大学丁家
波博士惠赠。
112　RNA的提取和 PCR扩增
Trizol法提取幼叶总 RNA (方法参照上海生工生物工程技术服务有限公司 Trizol试剂盒说明 )。
用 M 2MLV反转录酶 ( Promega公司 ) 合成 cDNA。
根据烟草、番茄、马铃薯等叶绿体 sHS P基因的保守区设计兼并引物 5pi2CAGATGAT (A /G) GA
(C /T) AC (A /G/T) ATGGA23pi ( CP1 ) 和 5pi2AGACTCC (A /G) T ( C /T) CTT ( C /G) A (A /G)
( G/T) TC23pi (CP2) , 以甜椒叶片 cDNA为模板进行 PCR扩增获得该基因的中间片段。反应体系为
25μL, 内含 1倍反应缓冲液。反应程序为 : 94℃预变性 3 m in; 94℃变性 30 s、50℃复性 30 s、72℃
延伸 50 s, 35个循环 ; 72℃延伸 6 m in。
回收的 PCR产物与 PUCM 2T vector连接 , 转化大肠杆菌 DH5α, 菌落在含有 X2gal和 IPTG的平面
上进行蓝白斑筛选 , 分别提取若干白斑菌落质粒 , 质粒 DNA酶切和 PCR鉴定。
克隆的 PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测定。根据试验结果设计特异引物 5pi2
ACAGATTATTCGAGGATACC23pi (CP3) 和 5pi2ATGAATGTCCCAAGGAGCAC23pi ( CP4 ) , 利用引物 CP3
和 B26 (上海生工生物工程技术服务有限公司提供的通用引物 ) 进行 PCR扩增直接获得基因的 3pi端。
为了得到这个基因的 5pi端 , 取 30μL反转录 cDNA纯化后用 TdT试剂盒进行 5pi加尾反应 , 在
cDNA的 5pi加 polyC。利用特异引物 CP4和 AAP (上海生工生物工程技术服务有限公司提供的通用引
物 ) 进行 PCR反应扩增该基因的 5pi端 , 反应程序同上。根据所得到的序列设计特异的 5pi端引物 5pi2
AAAGAGATCGTATATATCCT23pi (CP5) 和 3pi端引物 5pi2CAAGAACAAGAATAGCTTG23pi (CP6) 进行全
长的 PCR反应 , 得到全长。
113　Northern和 Southern杂交
取甜椒根、茎、叶的总 RNA各 20μg, 112%琼脂糖凝胶电泳后 , 转移至尼龙膜上 , 以 32 P标记的
CaHSP26全长 cDNA片段为探针进行杂交分析〔9〕。甜椒基因组 DNA用 EcoRⅠ、EcoRⅤ、X ba Ⅲ限制
性内切酶进行消化反应 , 然后按照 Sambrook等〔10〕的方法进行电泳、转膜、杂交。
114　原核表达载体的构建
以获得的全长 cDNA为模板 , 根据所得到的序列设计含酶切位点 B am HⅠ的特异 5pi端引物 5pi2AT2
GGATCCATGGCTTGC23pi (CP7 ) 和含酶切位点 H ind Ⅲ的 3pi端引物 5pi2GGAAGCTTCTATTAATT23pi
(CP8) 进行 PCR反应 , 得到全部编码区。然后将 PCR产物及原核表达载体 PET30a进行 B am HⅠ、
H ind Ⅲ双酶切 , 将二者连接 , 转化大肠杆菌 BL21, 在含卡那霉素的培养基上进行筛选重组克隆。
115　大肠杆菌细胞活力测定
细菌细胞在 LB液体培养基中 37℃培养 , 当其 A600为 110时取 50μL用新鲜的含卡那青霉素的 LB
培养基 5 mL稀释 , 加 IPTG至终浓度为 1 mmol·L - 1。培养 2 h后 , 将大肠杆菌分别进行 0、30、60、
120、180 m in的 50℃高温处理。细胞活力测定参照 Soto等〔7〕的方法。
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　6期 郭尚敬等 : 甜椒 CaHSP26的 cDNA克隆与表达 　
116　大肠杆菌可溶性蛋白分析
将处理的 1 mL大肠杆菌离心回收细胞 , 加入 50μL SDS细菌裂解液 , 煮沸 3 m in裂解细胞 , 吸
取 25μL裂解液进行 SDS2PAGE凝胶电泳。
2　结果与分析
211　C aHSP26基因的克隆和序列分析
测序结果表明 , 该 cDNA全长为 917 bp, 开放阅读框 99～807 bp, 编码 235个氨基酸 , 分子量大
约 26 kD (图 1) , 将其命名为 CaHSP26。
图 1　甜椒 CaHSP26基因核苷酸序列
F ig. 1　Nucle ic ac id sequence of CaHSP26 from Capsicum annuum
sHSP的晶体结构相对保守〔1〕。用 B last软件将该 cDNA序列与 GenBank中的序列进行同源性比
较 , 发现该蛋白具有一个保守的α - 晶体结构。用 DNAman软件处理发现 , 该基因核苷酸序列与烟
草、番茄等植物的叶绿体 sHSP基因均具有较高的同源性 (图 2) , 这表明我们已经成功地克隆到了甜
椒叶绿体 sHSP基因序列 , 将该基因在 GenBank中注册 (AY224603)。
图 2　甜椒与其它植物叶绿体 sHSP基因序列聚类图
F ig. 2　Hom ology tree of nucle ic ac id sequences of chloropla st sHSP genes from
Capsicum annuum and som e other plan t spec ies
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212　C aHSP26在甜椒基因组中由单基因编码
Southern杂交结果显示各泳道中均只有 1条带 , 说明 CaHSP26在甜椒基因组中由单基因编码
(图 3)。在拟南芥中也有同样的报道 , 而大豆、豌豆、大麦、烟草、小麦基因组中有两个编码基
因〔11〕。
213　C aHSP26在甜椒幼苗中的表达
以 CaHS P26 cDNA为探针进行了 Northern杂交分析。结果显示 , 25℃下生长的对照植株该基因在
根、茎、叶中无表达 , 而在 42℃热激处理的植株中均有表达 , 根中表达量较低 , 叶片中表达量较高 ,
说明该基因的表达受热激诱导。在 4℃处理的植株叶片中检测不到该基因的表达 (图 4)。
214　异源表达 C aH SP26基因提高大肠杆菌在高温胁迫下的生存能力
用 PET30a表达载体与 CaHSP26基因进行重组 , 转化大肠杆菌 BL21 ( PET + HSP) , 同时将空载
体 PET30a转化 BL21作为对照 ( PET)。用 IPTG诱导大肠杆菌蛋白质的表达 , 提取蛋白质进行 SDS2
PAGE。
结果显示 PET2HSP细胞中有过量表达的特异蛋白质带。因为所表达的蛋白质中含有 PET载体的
一段编码大约 716 kD蛋白的序列 , 所以得到的融合蛋白大小约为 3316 kD (图 5)。随高温 ( 50℃)
处理时间的延长 , 大肠杆菌内蛋白质分解 , 但是转基因的 PET + HSP大肠杆菌的蛋白降解较少 , 表明
sHSP对细胞有保护作用。
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　6期 郭尚敬等 : 甜椒 CaHSP26的 cDNA克隆与表达 　
　　将 IPTG诱导后的细菌进行 50℃高温处理 , 分别于 0、30、60、120、180、240 m in取 50μL涂到
固体 LB培养基上 , 通过统计菌落数测定大肠杆菌的存活能力。处理 60 m in后 , 转基因大肠杆菌有
13%死亡 , 而对照的死亡率达到 59% , 180 m in后对照只有 8%的存活率 , 而转基因大肠杆菌仍然有
32%的存活率 (图 6)。
3　讨论
多种逆境条件 , 如高温〔6〕、低温〔12〕、光氧化〔2, 5〕、氧化剂〔11〕、干旱〔13〕、涝害〔14〕等可以诱导 sHSP
基因的表达 , 说明 sHSP是植物对这些逆境产生的应激蛋白 , 预示 sHSP的产生与植物的抗逆性有一定的
关系。
Northern杂交结果显示 , 甜椒根、茎、叶中 CaHSP26的表达受热激的诱导 , 推测该基因的表达与植
物耐热性有关 , 并且在植物体内的表达具有普遍性。但该基因在叶片中的表达量较高 (图 4) , 说明该
基因的表达可能与植物叶片的耐热性关系更为密切。CaHSP26在大肠杆菌中异源表达维持高温胁迫下大
肠杆菌的细胞活力 (图 6) , SDS2PAGE显示高温胁迫下该基因的表达减轻了大肠杆菌蛋白的降解 (图
5)。Soto等〔7〕研究认为细胞质 sHSP的表达可以维持大肠杆菌蛋白质的稳定性 , 从而维持细菌细胞较高
的活力 , 表明高温条件下不同 sHSP对细胞的保护机制具有相似性。在热激条件下 CaHSP26有可能具有
分子伴侣的作用 , 参与蛋白质的保护 , 从而维持高温条件下细菌的活力。
也有文献对热激蛋白与细胞耐热性的相关性提出了疑问。H¾rndah等〔15〕在豌豆离体的类囊体膜中
加入纯化的叶绿体 sHSP后并没有发现对 PSⅡ的保护作用。因此 , 热激蛋白潜在的生理功能还需要深
入研究。目前我们已分析了转 CaHS P26基因烟草植株的部分功能 , 并将该基因转化甜椒 , 以阐明高
温胁迫下该基因对甜椒植株的保护作用。
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“《园艺学报》第 7届编委会”会议在北京召开
2006年 12月 17日中国园艺学会在北京中国农业科学院蔬菜花卉研究所召开“《园艺学报 》第 7届编委会 ”会议 ,
内容为 《园艺学报 》编委会换届 , 编辑部工作总结 , 研讨如何进一步办好学报。在北京的 23名第 7届编委和学会、
承办单位领导以及编辑部全体同志共计 35人出席会议。
中国园艺学会理事长、《园艺学报 》主编方智院院士主持会议 , 他首先介绍中国园艺学会第 10届 3次常务理事会
对 《园艺学报 》组建新一届编委会的决定 , 组建中注意到各学科的代表性 , 同时在保持编委的连续性、保留部分园
艺届的老前辈继续担任编委的前提下 , 特别重视增加一批中青年骨干 ; 然后他感谢中国科学技术学会、中国园艺学
会、承办单位中国农业科学院蔬菜花卉研究所和 11家协办单位的大力支持 , 感谢 2003年以来的 4年中第 6届编委会
成员和编辑部卓有成效的工作 , 同时感谢学会和前几任主编、副主编等老领导、老同志为 《园艺学报 》打下的坚实
基础 , 希望新一届编委会将学报办得更好。
第 7届主编仍由方智远院士担任 ; 副主编 8人 , 其中新任副主编 6人 ; 国内编委 67人 , 其中新任编委 15人 ; 国
外编委 5人。
编辑部主任赵华总结了 2003～2006年 《园艺学报 》的编辑出版工作。近年 《园艺学报 》稿源和载文量均不断增
加 , 2006年收到稿件 905篇 , 刊登稿件 372篇 , 约 270万字。学报的编辑出版工作始终坚持 “三审 ”、“四改 ”“五
校 ”制度 , 2006年有 263人参加审稿 , 审稿最多的 48篇次 /人 ; 发表的论文 , 平均审稿 418次 /篇 , 编辑、校改 8人
次 /篇 ; 近几年又采用了铜版纸彩色印刷 , 其学术水平和出版质量明显提高。《园艺学报 》被美国 CA、英国 CAB、俄
罗斯 JA等国际著名数据库收录。我国园艺科学中获国家奖的 80%项目在本学报发表论文 , 发表论文中 71%来源于国
家或省部级项目。2005年 《园艺学报 》获得第 3届国家期刊奖 , 2006年获得 “中国科协精品科技期刊工程项目 ”资
助。目前存在的主要问题是发表周期较长 , 来稿质量及英文写作水平有待提高等。近期的工作计划是 : 补充更新审稿
专家库 ; 增设快报栏目 ; 加强网络建设 , 实现数字化出版 ; 2007年扩版 20% , 2008年改为月刊 , 绝大多数论文发表
周期缩短至 5～6个月。发展目标是 : 将 《园艺学报 》办成 “在国际园艺学科有影响力的期刊 ”。
与会者充分肯定了 《园艺学报 》编辑出版工作的成绩 , 并就如何进一步办好学报进行了热烈讨论。大家希望今
后进一步扩大论文报道面 , 重视理论联系实际 , 多报道一些具有我国园艺特色并从实践中总结升华的理论成果 ; 加强
审稿确保稿件质量 , 规范专业名词以及拉丁学名 , 来稿试验数据要有统计分析 , 试验要有必要的数据支持 , 减少研究
简报 , 适当控制分子生物学方面的文章并加强其实际意义审查。大家就加强英文审校、刊登英文论文、创造条件办英
文版、扩大国际影响等献计献策 , 有的还介绍了法国、日本等经验 , 有的未到会编委提出书面意见出谋划策。
方智远主编做了简要总结 , 希望编辑部会后认真研究编委会的意见 , 制定切实可行措施 , 扎实工作 , 再创佳绩。
中国农业科学院蔬菜花卉研究所杜永臣所长代表承办单位表示 , 继续在人力、物力、财力等方面提供保障 , 办好
《园艺学报 》。
《园艺学报 》编辑部
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