全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (10) : 1467 - 1472
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 04 - 17; 修回日期 : 2008 - 07 - 14
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671412, 30270236) ; ‘十一五 ’国家科技支撑计划项目 ( 2006BAD08A08) ; 农业公益性
行业科研专项项目 ( nyhyzx072050)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xieby@mail1caas1net1cn)
辣椒抗根结线虫相关 WRKY基因的分离
李淑敏 , 茆振川 , 李　蕾 , 冯东昕 , 杨宇红 , 谢丙炎 3
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 为了确定抗性基因 M e3介导表达的抗根结线虫相关基因 W RKY的种类及其表达特点 , 以含
M e3基因的 HDA149辣椒品种为材料 , 接种南方根结线虫二龄幼虫 , 通过同源克隆法获得辣椒 4个 W RKY
新基因片段。利用 RT2PCR技术克隆了 W R KY2a、W R KY2b、W RKY2c、CaW RKY1、W RKY1和 CaW RKY2等 6
个 W RKY基因的全长 cDNA。研究表明 , W RKY2a、CaW RKY2基因受根结线虫诱导表达 ; CaW RKY1基因的表
达具有组织特异性 , 在根和叶中表达 , 在茎中不表达。聚类分析表明 WRKY2a、WRKY2c、CaWRKY2蛋白
属于第 Ⅰ组 WRKY蛋白 , WRKY2b、CaWRKY1属于第 Ⅱc亚组 , WRKY1属于第 Ⅱa亚组。
关键词 : 辣椒 ; WRKY转录因子 ; 基因克隆 ; 聚类分析
中图分类号 : S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1021467206
Isola tion of W R KY Genes in the Incom pa tible In teraction Between M eloido2
gyne incogn ita and C apsicum annuum
L I Shu2m in, MAO Zhen2chuan, L ILei, FENG Dong2xin, YANG Yu2hong, and X IE B ing2yan3
( Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricultura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: Pepper cultivar HDA149 (Capsicum annuum L. ) is resistant to M eloidogyne incogn ita, which
is controlled by a single dom inant gene M e3. To determ ine the type ofW R KY genes and their exp ression char2
acteristics during the incompatible interaction between HDA149 and M eloidogyne incogn ita, homology2based
cloning and RT2PCR app roacheswere used in this study. Four new hot pepperW R KY genes were isolated from
HDA149 after challenging inoculation with J2 root2knot nematode and the comp lete cDNA s of six W R KY
genes, i1e. W RKY2a, W R KY2b, W R KY2c, CaW R KY1, W R KY1 and CaW R KY2 were amp lified. It was shown
that the exp ression of W R KY2a and CaW R KY2 was induced by root2knot nematode. The CaW R KY1 gene
exp ressed differently in various tissues of the p lant, e1g. it exp ressed in roots and leaves but not in stem s.
Cluster analysis indicated WRKY2a, WRKY2c and CaWRKY2 p roteins were clustered into the group Ⅰ of
WRKY p rotein, WRKY2b and CaWRKY1 p roteins were classified as subgroup Ⅱc, whereasWRKY1 p rotein
in subgroup Ⅱa. W RKY genes regulate HDA149 resistance to root knot nematode together.
Key words: hot pepper; WRKY transcrip tion factor; gene cloning; cluster analysis
辣椒 (Capsicum annuum L. ) 野生类型及其野生近缘种中广泛存在抗线虫基因 M e家族 (黄三文
等 , 2000; de Souza2Sobrinho et al. , 2002)。Hendy (1984) 在 PM217和 PM687的双单倍体群体中共
发现了 5个抗根结线虫显性基因 (M e125)。M e1、M e3抗南方根结线虫 (M i)、花生根结线虫 (M a)、
爪哇根结线虫 (M j) , M e2、M e5抗 M j, M e4抗 M a (D jian2Caporalino et al. , 1999; de Souza2Sobrinho et
al. , 2002)。
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WRKY转录因子是一类非常重要的抗病相关转录因子 , 在植物的逆境胁迫信号转导过程中起着
非常重要的作用。WRKY转录因子一般都具有 1或 2个含一个 WRKYGQK序列和一个锌指结构的约
60个氨基酸的区域。目前在辣椒中共发现了 6个 W R KY基因 , Park等 (2006) 在辣椒与烟草花叶病
毒 ( TMV) 的不亲和互作体系中分离到 3个 W R KY基因 W R KY2a、W RKY2b、W RKY2c。在根结线虫与
寄主植物的不亲和互作中 , WRKY转录因子与抗线虫基因的表达有着紧密的关系 ( Jammes et al. ,
2005; 茆振川 等 , 2007)。茆振川等 (2007) 从辣椒与根结线虫的不亲和互作中分离到 4个 WRKY
转录因子 , 发现 WRKY转录因子参与了 M e3基因介导的抗根结线虫作用。本研究以含 M e3基因的辣
椒 HDA149为材料 , 接种南方根结线虫二龄幼虫 , 通过 RT2PCR扩增明确辣椒不同 W R KY基因的表达
方式 , 为解析 WRKY转录因子在辣椒抗线虫基因 M e3介导下抗线虫信号传导中的调控作用机理奠定
基础。
1　材料与方法
111　材料
辣椒 (Capsicum annuum L. ) 双单倍体材料 HDA149含有单显性抗根结线虫基因 M e3, 由 A lain
Palloxin博士惠赠。2007年 7月 , 本试验于中国农业科学院蔬菜花卉研究所病害组进行。4片真叶期
的辣椒苗在移栽 10 d后进行接种处理 (茆振川 等 , 2007)。接种线虫为南方根结线虫 (M eloidogyne
incogn ita) 生理小种 1, 对照用无菌水做模拟接种 , 在接种后 36 h时取样 (茆振川 等 , 2007)。取完
全展开的上部叶片、110～115 cm长的根尖及嫩茎为样品 , 于 - 80 ℃冰箱中保存。
112　RNA提取和反转录
采用 Invitrogen公司的 TR IZOL试剂提取辣椒根尖、叶片、茎的总 RNA, 并采用该公司的 Super2
Scrip tTM First2Strand Synthesis System for RT2PCR试剂盒进行反转录。
113　辣椒 W RKY基因的同源克隆
根据拟南芥、烟草、马铃薯 W R KY基因的保守区域设计简并引物。简并引物序列为 FP: TGGM2
GIAARTAYGGNCARA , RP: TGRBYRTGYTTICCYTCRTA IGTDGT。以根尖 cDNA为模板进行 PCR扩增
获得 W R KY基因的中间片段。反应程序为 : 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 35个循
环 ; 72 ℃ 10 m in。PCR产物阳性克隆后进行测序。
114　辣椒 W RKY基因的 RT2PCR扩增
根据已发表的辣椒 W R KY基因序列设计全长引物 (表 1) , 分别以对照辣椒叶片和根结线虫处理
后的辣椒根尖、叶片、茎的 cDNA为模板进行 RT2PCR扩增。6个基因的扩增程序为 : 95 ℃ 5 m in,
94 ℃ 30 s, 退火温度分别为 58 ℃、55 ℃、55 ℃、55 ℃、55 ℃、54 ℃, 复性 30 s, 72 ℃ 90 s, 35
个循环 , 最后 72 ℃延伸 10 m in。PCR产物阳性克隆后进行测序。
表 1　辣椒 W RKY基因 RT2PCR扩增的引物序列
Table 1　Pr im er sequences used in hot pepper W RKY genes RT2PCR
基因
Gene
登录号
Accession No.
上游引物 (5′- 3′)
Forward p rimer
下游引物 (5′- 3′)
Reverse p rimer
W RKY2a AY391747 GGGATCCTATGATCTCTTCTTCATCA CGGATCCCAGTTAAGGAAAGAGCT
W RKY2b AY743433 GGAGAATTACCCACCACTAT CCCAGTGTATTTATGCCTTA
W RKY2c AY740531 GAGCACTGGGTATAGGAAGA CACAAGTATTTCAATGGTGA
CaW RKY1 AY229992 GAAGATCATCCAATGTATTAC CGCATATAGTACTAGATGCT
W RKY1 AY789641 CACCTGAAGAAAGACTAGAAG CCGTGTGGCTAGGAGATTAT
CaW RKY2 DQ402421 CTCTCTAATGGCTGCTTC GCTCCTTTCATTACCAAGAT
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　10期 李淑敏等 : 辣椒抗根结线虫相关 W RKY基因的分离 　
2　结果与分析
211　辣椒 W RKY基因的同源克隆
利用简并引物进行同源扩增 , 得到与预期长度相吻合的片段。经过测序得到 6个不同的 CaW R KY
基因片段 , 并进行 BLAST同源比对 , 结果见表 2。其中 15028与辣椒 W R KY2c为同一基因 , 700215与
辣椒 W R KY2a为同一基因 , 其它 4个片段均为辣椒中的 W R KY新基因片段。
表 2　辣椒 CaW RKY基因片段的同源性比对
Table 2　Hom ology a lignm en ts of hot pepper CaW RKY gene fragm en ts
序列
Clone
长度 / bp
Length
结构域
Domain
同源基因
Accession
同源比对结果
B last
相似度 /%
Identity
期望值
Expect
15022 155 单结构域 EAY83253 水稻假定蛋白 Hypothetical p rotein O sI 90 3e222
15026 155 单结构域 BAA86031 烟草 WRKY转录因子 4 Transcrip tion factor N tWRKY 4 100 2e223
15028 155 单结构域 AAW67002 WRKY2c转录因子 WRKY transcrip tion factor2c 100 4e223
70026 659 双结构域 AAD16139 绑定蛋白 2 DNA2binding p rotein 2 79 6e299
70028 803 双结构域 CAC36397 假定蛋白 Hypothetical p rotein 90 3e2143
700215 651 双结构域 AAR26657 WRKY2a转录因子 WRKY transcrip tion factor2a 100 2e2127
212　辣椒 W RKY基因的 RT2PCR检测
利用所设计的 6对特异引物分别进行全长的 RT2PCR反应。结果 (图 1) 表明 , 在无菌水做模拟
接种的辣椒叶片中 W R KY2b、W R KY2c、CaW R KY1和 W R KY1 4个 W RKY基因都表达 , 但表达量不同 ,
CaW R KY1基因表达量高。W R KY2a、W R KY2b、W R KY2c、W RKY1和 CaW R KY2 这 5个 W R KY基因在根
结线虫接种 36 h后的辣椒根尖、茎、叶片中都表达 , 而 CaW R KY1基因在根结线虫接种 36 h后的辣椒
根尖、叶片中表达 , 在茎中不表达。说明 W R KY2b、W R KY2c、CaW R KY1和 W R KY1 4个基因在辣椒中
表现为组成型表达 , 而 W R KY2a、CaW RKY2基因是诱导型表达 , CaW R KY1基因的表达具有组织特异
性。
图 1　辣椒 6个 W RKY基因的 RT2PCR分析
A: 无菌水对照 ; B、C、D: 根结线虫接种辣椒的根、茎、叶。
M: Maker; 1: W RKY2a; 2: W RKY2b; 3: W R KY2c; 4: CaW RKY1; 5: W R KY1; 6: CaW RKY2。
F ig. 1　RT2PCR ana lysis of six W RKY genes in pepper
A: Sterile water control; B , C, D: Roots, stem s and leaves of hot pepper inoculated by root2knot nematode.
M: Maker; 1: W RKY2a; 2: W R KY2b; 3: W R KY2c; 4: CaW R KY1; 5: W RKY1; 6: CaW RKY2.
213　W RKY蛋白的聚类分析
根据 WRKY结构域的数量及锌指结构的组成 , WRKY蛋白家族可以分为 3个亚家组 (族 )。第 1
组 (Ⅰ) 通常含有 2个 WRKY域 , 其锌指结构的氨基酸组成模式为 : C2 H2结构 (C2X4 - 5 2C2X22 - 23 2H2
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X1 2H, X为非保守的氨基酸 )。还有数量更多的是只含有 1个 WRKY域的蛋白 , 属于第 2组 (Ⅱ) 或
第 3组 (Ⅲ) , 第 2组与第 3组的主要区别在于它们的锌指结构。第 2组的锌指结构与第 1组类似。
第 3组的锌指结构与第 1、2组稍有不同 , 其结构模式为 : C2 2HC结构 (C2X7 2C2X23 2H2X1 2C)。
在 GenBank以及拟南芥信息库 ( TA IR, http: / /www1A rabidop sis1org) 中搜集拟南芥、辣椒、烟
草、马铃薯的 WRKY蛋白序列 , 应用 MEGA 311软件通过邻位法进行聚类分析 , 以 1 000次回抽的置
信度作置信分析 , 结果如图 2所示。
图 2　拟南芥、马铃薯、烟草及辣椒 W RKY蛋白的聚类分析
F ig. 2　C luster ana lysis of A rabidopsis, Solanum , N icotiana and Capsicum W RKY prote in sequences
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　10期 李淑敏等 : 辣椒抗根结线虫相关 W RKY基因的分离 　
　　聚类分析表明 WRKY蛋白分为 3个组 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。第 Ⅱ组根据小的分枝分为 5个亚组 (Ⅱa、
Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe) , Ⅱa与 Ⅱb亚组关系较近 , Ⅱd与 Ⅱe亚组关系较近 , 而 Ⅱd、Ⅱe与 Ⅱa、Ⅱ
b、Ⅱc关系较远 ; 第 Ⅲ组明显分为 2个分枝 , 据此分为 2个亚组 (Ⅲa和 Ⅲb)。在不亲和互作所分
离到的 6个 W R KY基因中辣椒 WRKY2a、WRKY2c、CaWRKY2、CaRKN IF1蛋白属于第 Ⅰ组 , 辣椒
WRKY2b、CaWRKY1蛋白属于第 Ⅱc亚组 , 辣椒 WRKY1属于第 Ⅱa亚组。
3　讨论
植物具有复杂的基因表达调控体系抵御病原物的侵染 , 并且主要通过转录水平上的调控来实现。
WRKY转录因子家族在调控基因的表达和对外界环境生物和非生物胁迫的反应中起着重要作用。拟
南芥存在着 75种 WRKY蛋白 , 几乎所有的第 Ⅲ组 WRKY蛋白都与应答生物胁迫反应有关 (Dong et
al. , 2003; Kalde et al. , 2003)。
已有研究表明 , 在根结线虫与寄主植物的不亲和互作中 , WRKY转录因子与抗线虫基因的表达
联系紧密。在拟南芥与根结线虫不亲和互作表达基因分析中 , 证实 WRKY转录因子参与了根结线虫
与拟南芥的分子互作 , 被侵染的拟南芥中有 21个 WRKY转录因子的表达发生了改变 , 其中 17个是
下调表达的 , 说明这些 WRKY转录因子在拟南芥与根结线虫不亲和互作中具有重要作用 (Jammes et
al. , 2005)。
在根结线虫侵染植物的过程中 , 口针频繁穿刺植物根尖以及侵入后在根尖内移动造成机械伤害。
现已证明在机械伤害条件下 , 植物可以表达 W R KY基因以激活防御反应 (Hara et al. , 2000; Guo et
al. , 2004)。
辣椒 HDA149中含有单显性抗线虫基因 M e3, 其介导的过敏性坏死 (HR) 反应发生在侵染早期 ,
即线虫与根尖接触、移动及刺激巨型细胞形成的过程中。试验证明 , 在根结线虫侵染早期 , WRKY
转录因子参与了 M e3基因介导的抗根结线虫作用 (茆振川 等 , 2007 )。本研究结果表明在辣椒
HDA149与根结线虫的不亲和互作中 , M e3基因介导了 HR反应 , 分离到 6个 W R KY基因 , RT2PCR证
实 W R KY基因在接种线虫 36 h后大量表达 , 并且表达具有组织特异性 , 这与根结线虫的侵染转移紧
密相关。
由于根结线虫全面侵染植物的根尖并刺激形成巨型细胞 , 所以根部 W R KY基因表达量大 , 叶片中
相对较弱 , 而在茎中只有个别 W R KY基因表达 , 这进一步说明辣椒 W RKY基因在抗线虫中起重要作
用。
聚类分析表明 6个 W R KY基因分属于 2个组 , 而同一组中的 W RKY基因之间存在着较大差距。这
些研究表明在辣椒中 W R KY基因与线虫侵染引起的抗性反应紧密相关 , 是多个 W R KY基因参与的调控
体系 , 而各个 WRKY转录因子在 M e3基因介导的抗线虫反应中的调控目标及其涉及到的相关信号传
导途径有待于进一步研究。
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